DSS诱导肠道炎症损伤动物模型的构建、评价方法及应用与流程

本发明属于动物模型构建，具体涉及了一种dss诱导肠道炎症损伤动物模型的构建、评价方法及应用。

背景技术：

1、肠道作为家禽体内最主要的消化器官和免疫器官，在保障家禽健康和生长发育等方面发挥重要的作用。在集约化和高密度养殖生产条件下，饲料、饮水、环境和疾病等因素均会影响家禽肠道健康，导致养殖成本增加。随着饲料端、养殖端全面禁抗，细菌和病毒感染等诱发的肠道炎症发病率显著增加，养殖面临着成本的提高和疾病风险的进一步加剧。

2、动物模型的构建为疾病的机理研究和治疗药物筛选提供了很好的手段。肉鸭的肠道疾病主要有细菌性、病毒和寄生虫感染等，在进行动物病理学、生物饲料添加剂和疫苗开发等，主要用上述疾病的病原菌或弱毒疫苗等建模。但这种建模方式需要专门的动物隔离区进行试验，且发病程度难以控制，还有可能会引发其他并发症。因此，目前在肉鸭上可见的应用主要集中于使用细菌脂多糖(lps)诱导的肠道炎症。lps诱导因其存在剂量大小和注射次数等差异会造成试验结果重复性差、稳定性低等不足，且lps诱导炎症模型的作用靶点并不直接在肠道，不能作为专门的肠炎模型。

3、由此可见，肉鸭疾病的机理研究和治疗药物筛选研究中亟需一种操作简单、稳定可靠的、可重复性强、模型一致性高的肉鸭肠炎模型构建方法。葡聚糖硫酸钠(dss)是葡聚糖的聚阴离子衍生物，用dss构建小鼠uc模型已广泛用于新药物研发及其发病机制研究。dss不能被肠上皮细胞直接吸收，但可损伤上皮细胞紧密连接和基底膜，导致肠道渗透性增加，促进肠道菌群和抗原渗入，激活免疫系统，诱导炎症反应。dss适用于多种动物造模，例如小鼠、大鼠、斑马鱼、猪等。近年来，已有研究采用dss成功建立肉鸡肠道炎症损伤模型，鉴于肉鸡和肉鸭在体型大小、消化系统和对dss耐受剂量范围均差异较小，可参照dss建立肉鸡肠道炎症的方法，但目前肉鸡研究中多采用dss建立急性肠炎模型。肉鸭实际生产中慢性肠道炎症居多，因此通过dss诱导建立肉鸭肠道慢性炎症模型和评价方法是本领域技术人员亟待解决的问题。

技术实现思路

1、为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种dss诱导肠道炎症损伤动物模型的构建、评价方法及应用，以解决现有肠道炎症模型未能准确模拟肉鸭慢性肠道炎症损伤的问题。

2、本发明所采用的技术方案如下：

3、一、一种dss诱导肠道炎症损伤动物模型的构建方法，包括以下步骤：

4、首先选取肉鸭作为建立dss诱导肠道炎症损伤动物模型的对象，然后将分子量为36～50 kda的葡聚糖硫酸钠dss溶于灭菌饮用水中，配制成重量百分浓度为1.0%的dss溶液，避光保护，现配现用，接着采用两轮dss溶液灌喂法对肉鸭进行灌喂：分别于肉鸭9-13日龄和23-27日龄期间采用配制好的dss溶液对肉鸭进行灌喂处理，在14-22日龄期间停止灌喂dss溶液(即进行恢复处理)，建模期间全程正常饮食，自由饮水， 28日龄的所述肉鸭即为dss诱导肠道炎症损伤动物模型。

5、所述肉鸭为9日龄雄性番鸭。

6、所述dss溶液的重量百分浓度为1.0%~1.2%，灌喂剂量为1~1.2 ml/kg肉鸭体重。

7、二、一种对dss诱导肠道炎症损伤动物模型的评价方法，包括以下步骤：

8、设立对照组，所述对照组为不进行任何dss溶液灌喂，全程正常饮食，自由饮水的28日龄雄性番鸭，将dss诱导肠道炎症损伤动物模型作为建模组，建模组和对照组检测下述指标：

9、1)血清中肠道屏障损伤标志物；

10、2)空肠绒毛损伤情况；

11、3)空肠黏膜屏障功能基因表达水平；

12、4)促炎细胞因子含量及其基因表达水平；

13、5)肠道微生物菌群多样性和菌群组成；

14、利用统计学方法对建模组与对照组的上述指标数据进行差异性分析，并对上述指标设立合格值，若建模组指标数据与对照组相比具备显著性差异，且建模组的上述所有指标均达到合格值，则认为模型构建成功。

15、所述血清中肠道屏障损伤标志物包括血清内毒素lps、d-乳酸和血浆二胺氧化酶dao。

16、所述血清中肠道屏障损伤标志物的检测方法如下：

17、采集建模组和对照组中28日龄肉鸭的血清，采用酶联免疫吸附法分别测定两组肉鸭血清中lps、d-乳酸以及dao的含量，若建模组与对照组的lps、d-乳酸、dao含量相比均具备显著性差异，且建模组中lps、d-乳酸、dao含量均高于对照组，即建模组的血清中肠道屏障损伤标志物指标检测合格。

18、空肠绒毛损伤情况的检测指标包括空肠he染色图、空肠电镜图以及ab-pas染色图。

19、所述空肠绒毛损伤情况的检测方法如下：

20、采集建模组和对照组中28日龄肉鸭的空肠组织，将空肠组织分别经he染色、透射电镜和ab-pas染色，获得两组肉鸭的空肠he染色图、空肠透射电镜图以及空肠ab-pas染色图，利用空肠he染色图、空肠透射电镜图和空肠ab-pas染色图获取肉鸭空肠绒毛损伤情况；若相比于对照组，建模组肉鸭的绒毛、微绒毛损伤更严重，紧密连接蛋白结构不完整，且杯状细胞数量显著降低，即建模组的空肠绒毛损伤情况指标检测合格。

21、所述的空肠黏膜屏障功能基因包括黏蛋白基因 muc-2和紧密连接蛋白基因 claudin-1、 occludin和 zo-1；所述空肠黏膜屏障功能基因表达水平的检测方法如下：

22、采用实时荧光定量pcr法分别测得空肠黏膜屏障功能基因的扩增的ct值(循环阈值)，并以内参基因 β-actin的ct值进行标准化校正，得到空肠黏膜屏障功能基因表达水平；若建模组与对照组的 muc-2、 claudin-1、 occludin和 zo-1基因表达量相比具备显著性差异，且建模组中 muc-2、 claudin-1、 occludin和 zo-1基因表达量均低于对照组，即建模组的空肠黏膜屏障功能基因表达水平指标检测合格。

23、所述的促炎细胞因子包括il-2、il-6和tnf-α；所述促炎细胞因子基因表达量的检测方法如下：

24、采用实时荧光定量pcr法测得促炎细胞因子的扩增的ct值，并以内参基因 β-actin的ct值进行标准化校正，得到促炎细胞因子基因表达量；若建模组与对照组的 il-2、 il-6和 tnf-α基因表达量相比均具备显著性差异，且建模组中 il-2、 il-6和 tnf-α基因表达量均高于对照组，即建模组的促炎细胞因子含量及其基因表达水平指标检测合格。

25、所述肠道微生物菌群多样性和菌群组成的检测方法如下：

26、采集建模组和对照组中28日龄肉鸭的肠道内菌群的α-多样性和β-多样性；若相比于对照组，建模组肉鸭的α-多样性显著降低，β-多样性显著分离，菌群成分有益菌丰度降低，致病菌丰度显著增加，即建模组的肠道微生物菌群多样性和菌群组成指标检测合格。

27、具体地，肠道微生物菌群多样性指标包括α-多样性和β-多样性，其中α-多样性包括均匀度指数(chao指数和ace指数)和多样性指数(simpson指数和shannon指数)。肠道微生物菌群多样性和菌群组成的分析检测方法如下：

28、对建模组和对照组的盲肠内容物基因组进行提取，并基于运算分类单元otu聚类分析结果进行α-多样性和β-多样性指数分析。与对照组相比，若建模组均匀度指数(chao指数和ace指数)及多样性指数(simpson指数和shannon指数)均显著降低，菌群结构pca主成分分析(β-多样性)显著分离，菌群成分有益菌丰度降低，致病菌丰度显著增加，即为合格。

29、一种dss诱导肠道炎症损伤动物模型在动物肠道屏障受损引起的肠道炎症的药物筛选中的应用。

30、利用引物检测黏蛋白基因 muc-2、紧密连接蛋白基因 claudin-1、紧密连接蛋白基因 occludin和闭锁小带蛋白1抗体 zo-1的基因表达量；内参基因 β-actin的前引物和后引物分别如seq id no.1～2所示； muc-2的前引物和后引物分别如seq id no.3～4所示； claudin-1的前引物和后引物分别如seq id no.5～6所示； occludin的前引物和后引物分别如seq id no.7～8所示； zo-1的前引物和后引物分别如seq id no.9～10所示；

31、seq id no.1： β-actin-f：tctgcgagtacgaaggagga

32、seq id no.2： β-actin-r：ataaccgaccctgccctttg

33、seq id no.3： muc-2-f：agtggtggagactgcgattg

34、seq id no.4： muc-2-r：ggcctcagccttggtacatt

35、seq id no.5： claudin-1-f：tcagccctcttcattggctg

36、seq id no.6： claudin-1-r：atttttggggtagcctcggg

37、seq id no.7： occludin-f：gtcaatgtttaaccagccgtg

38、seq id no.8： occludin-r：gacgcgcttggttcgga

39、seq id no.9： zo-1-f：ccttggtaatgtgtgggcct

40、seq id no.10： zo-1-r：ccaggttttggggtcacagt

41、利用引物检测番鸭的 il-2(白细胞介素-2)、 il-6(白细胞介素-6)和 tnf-α(肿瘤坏死因子)基因表达量，检测 il-2的前引物和后引物分别如seq id no.11～12所示；检测 il-6的前引物和后引物分别如seq id no.13～14所示；检测 tnf-α的前引物和后引物分别如seqid no.15～16所示；

42、seq id no.11： il-2-f：taattcccccaggaacggga

43、seq id no.12： il-2-r：aagttggtcagctcttggcg

44、seq id no.13： il-6-f：cgtgttctcagcccggattt

45、seq id no.14： il-6-r：gggcatccctgaacgtgtat

46、seq id no.15： tnf-α-f：tctgcgagtacgaaggagga

47、seq id no.16： tnf-α-r：ataaccgaccctgccctttg

48、本发明可应用于研究肉鸭肠道炎症损伤的相关发病机制、筛选或评价改善肠道炎症损伤的药物或饲料添加剂，减少集约化高密度养殖过程中因肉鸭肠道疾病引起的经济损失。

49、本发明方法能够成功构建出现肠道炎症损伤和肠道菌群紊乱为主要症状的肉鸭肠道炎症损伤模型，其优势在于建立方法操作简单方便、模型病理程度一致性好、可重复性强、肠道炎症病情轻微且持续时间久，有利于在实验中进行大规模的推广和应用，可为肉鸭肠道疾病机理研究和饲料、药物添加剂筛选提供很好的手段。

50、本发明通过采用多轮dss溶液进行灌喂、并在dss溶液灌喂期间进行恢复处理，以此来建立精准的肉鸭肠道慢性炎症模型。本发明通过多轮dss溶液的灌喂，优势在于用小剂量进行致肠炎处理，在不会轻易致死的情况下更好地控制肠炎损伤程度；在dss溶液灌喂期间进行恢复处理，优势在于恢复期间可对模型肉鸭病理表现进行细致观察，更好控制肠炎损伤程度；由此可以建立出更准确的肉鸭慢性肠道炎症模型。

51、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

52、1、现有技术的细菌、病毒和寄生虫感染等诱导的肠道炎症损伤模型需要专门的动物隔离区进行试验，本发明的损伤动物模型可在实际生产环境中实施。

53、2、lps诱导的肠道炎症需进行腹腔注射，本发明模型应用更加简便，仅需通过口服灌喂构建肠道炎症损伤模型，有利于在实验中进行大规模的推广和应用。

54、3、与lps、寄生虫、病毒和致病菌构建的肉鸭肠炎损伤模型相比，dss诱导的炎症模型病理程度可控，且发病一致性好、可重复性强、肠道炎症病情轻微且持续时间久。