一种肠道体外低温保存方法及应用

本发明涉及低温保存，具体而言，涉及一种肠道体外低温保存方法及应用。

背景技术：

1、小肠移植是治疗肠扭转、肠坏死及血栓脱落阻塞肠系膜上动脉导致的肠大面积坏死等肠道无法维持人体正常营养吸收情况的唯一途径。临床上应用静态冷保存来进行肠道的短期保存，相较于肾脏、肝脏等器官，小肠的保存时间短，保存效果差，其中主要原因是肠道对于缺血再灌注损伤(iri)敏感。与其他移植物类似，缺血/再灌注过程会导致各种细胞类型及组织成分的诸多变化，然而，小肠iri的特殊之处在于代谢活动以及空腔结构。

2、肠道内含有的细胞、微生物数量多，种类杂，为了更好地保存肠道，采用降低温度的方法来抑制代谢活动，然而当温度低于-5℃时，溶液就会形成冰晶，冰晶的形成和生长会对细胞结构造成不可逆的致命损伤，现有的保存方法是应用静态冷保存法在0-4℃的环境中进行，但是在此温度环境下，肠道的代谢活动依然较为旺盛，不利于肠道的长期体外保存，保存时限在10小时以内。

3、由于肠道本身的空腔结构，在体外保存过程中，肠道壁会自然黏连，这就导致肠道内腔部分无法接触到器官保存液，保存液中含有的各种能量物质，防氧化，抑水肿的功能因子也无法进入内腔发挥作用，肠道管腔的塌陷也是影响肠道保存效果的重要原因。

4、目前临床的肠道保存中，没有良好的解决小肠的代谢活动旺盛，空腔结构所带来的内腔无法接触到保存液的问题。因此小肠的保存时间短，保存效果差，进行肠道移植的病例少，手术成功率低。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种肠道体外低温保存方法及应用，该方法能够解决小肠在体外保存时间短，保存效果差的问题。

2、本发明所采取的技术方案是：

3、本发明的第一方面，提出一种肠道体外低温保存方法，包括：

4、将离体肠道置于保存液中，应用深度过冷法将离体肠道保存在低温环境中，使得离体肠道内水凝胶填充，并外加磁场。

5、将肠段置于保存液中，应用深度过冷法可将肠段保存在低温环境中。

6、在本发明的一些实施方式中，所述的低温环境为-5℃～-20℃。

7、在本发明的一些优选实施方式中，所述的低温保存环境为-10℃。

8、在本发明的一些实施方式中，所述的深度过冷法指在放有肠段的保存液的表面覆盖一层特定的油，以隔绝保存溶液与空气，将样品置于低温环境中，溶液处于过冷状态不会形成冰晶。

9、在本发明的一些实施方式中，所述的深度过冷法中的油为石蜡油(po)。

10、本发明的第二方面，提出一种离体肠道器官的保存液，所述保存液包括威斯康星大学溶液(uw,university of wisconsin solution)、1.4环己二醇、聚乙二醇。

11、在本发明的一些实施方式中，所述的1.4环己二醇浓度为0.1-0.4mol/l。

12、在本发明的一些优选实施方式中，所述的1.4环己二醇浓度为0.1-0.2mol/l。

13、在本发明的一些实施方式中，所述的聚乙二醇浓度为2％-10％。

14、在本发明的一些优选实施方式中，所述的聚乙二醇浓度为2％-5％。

15、本发明的第三方面，提出一种新型的肠道填充方法，肠道内加入水凝胶，对肠腔起到支撑作用，水凝胶中含有uw溶液、海藻酸钠，透明质酸，聚乙二醇，聚乙烯醇，聚丙烯酰胺或pa水凝胶。

16、在本发明的一些实施方式中，水凝胶的材料选择是明胶，海藻酸钠，透明质酸，聚乙二醇，聚乙烯醇，聚丙烯酰胺或pa水凝胶。

17、在本发明的一些优选实施方式中，水凝胶的材料是明胶。

18、在本发明的一些实施方式中，明胶的浓度为0.5％-5％。

19、在本发明的一些优选实施方式中，明胶的浓度为1％。

20、在本发明的一些实施方式中，水凝胶的制备过程是将明胶溶于uw溶液中并且灌注至肠道内腔，放在0-4℃环境中静置等待成胶。

21、在本发明的一些实施方式中，通过复温至37℃能够去除肠道中的凝胶。

22、本发明的第四方面，提出一种新型的应用磁场的器官保存方法，在肠道保存过程中外加磁场以达到抑制冰晶形成，改善保存效果的作用。

23、在本发明的一些实施方式中，磁场为交变磁场和恒定磁场。

24、在本发明的一些优选实施方式中，磁场为交变磁场，频率为10—200hz，磁场强度大小为50-1000μt。

25、在本发明的一些优选实施方式中，磁场为恒定磁场，磁场强度大小为50-10000μt。

26、本发明的有益效果是：

27、本发明提供了一种肠道体外保存方法，应用深度过冷法使用优化的器官保存液结合肠道水凝胶与外加磁场。应用此法，能够延长小肠的保存时间，提高保存效果。深度过冷法能够最大程度的避免肠道在体外保存过程中出现的代谢旺盛以及避免了可能出现的污染现象。肠道内部填充水凝胶能够解决肠道保存过程中肠腔内部无法接触到保存液而导致的保存效果差的问题，填充的水凝胶生物友好，容易填充和去除。外加磁场能够抑制低温保存过程中冰晶的形成，并且改善肠道的体外保存效果。应用新的肠段保存方法肠道的体外保存时间明显延长，保存效果好。

1.一种肠道体外低温保存方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的肠道体外低温保存方法，其特征在于，所述的低温环境为-5℃～-20℃。

3.根据权利要求1所述的肠道体外低温保存方法，其特征在于，所述的深度过冷法指在放有肠段的保存液的表面覆盖一层石蜡油，以隔绝保存溶液与空气，将样品置于低温环境中，溶液处于过冷状态不会形成冰晶。

4.根据权利要求1所述的肠道体外低温保存方法，其特征在于，所述的保存液包括威斯康星大学溶液、1.4环己二醇、聚乙二醇；所述的1.4环己二醇浓度为0.1-0.2mol/l；所述的聚乙二醇浓度为2％-10％；所述的聚乙二醇浓度为2％-5％。

5.根据权利要求1所述的肠道体外低温保存方法，其特征在于，所述的使得离体肠道内水凝胶填充，具体包括：

6.根据权利要求5所述的肠道体外低温保存方法，其特征在于，所述的水凝胶的材料选择是明胶，海藻酸钠，透明质酸，聚乙二醇，聚乙烯醇，聚丙烯酰胺或pa水凝胶；水凝胶的浓度为0.5％-5％。

7.根据权利要求1所述的肠道体外低温保存方法，其特征在于，所述的水凝胶的制备过程是将明胶溶于uw溶液中并且灌注至肠道内腔，放在0-4℃环境中静置等待成胶。

8.根据权利要求1所述的肠道体外低温保存方法，其特征在于，所述的磁场为交变磁场和恒定磁场。

9.根据权利要求1所述的肠道体外低温保存方法，其特征在于，所述的磁场为交变磁场，频率为10—200hz，磁场强度大小为50-1000μt；所述的磁场为恒定磁场，磁场强度大小为50-10000μt。

10.权利要求1～9任一项所述的肠道体外低温保存方法在保存离体肠道/或制备用于保存离体肠道的产品中应用。