异类叶升麻苷衍生物及其制造方法与用图
[0168] 样品1的试验浓度为5 μΜ与10 μΜ，样品2~8的试验浓度为10 μΜ与20 μΜ。 以未加入任何试验样品的SH-SY5Y-APP695细胞培养基中的Αβ 4Q含量定为对照组并设定 为100%，经各测试样品处理后的培养基中Αβ4(ι含量则与对照组相比较，并以百分比表示。 另以分泌酶抑制剂（β-secretase inhibitor，β-SI)作为正对照组。实验结果显示 于图IA~图1D，其中图IA及图IC是样品抑制A 累积的试验结果图，图IB及图ID是 经样品处理后的细胞存活率分析结果图。图IA~图ID的结果为四个实验组的平均值土 标准误差（η = 4)，而对照组与测试样品组间以杜纳多重比较检定（Dunnett' s multiple comparison test)分析其统计差异，其中以表示p < 0· 05 ;以表示p < 0· 01 ;以 " 表示 p < 〇· 〇〇 1 ;并以 " **** " 表示 ρ〈〇· 〇〇〇 1。
[0169] 实验例一是先使用较低浓度的样品做初步筛选，根据图IA~图ID的结果，样品3、 4以及6具有抑制A β 4(|累积的效果，其中以样品3对于细胞中A β 4(|累积的抑制效果最佳， 其抑制Αβ 4(|累积的效果是随着样品浓度的上升而增加。
[0170] 实验例二、抑制A β 4(|累积的试验（II)
[0171] 实验例二是依据实验例一的试验结果，选出具有明显抑制Αβ4(ι累积效果的样品 3、4以及6,提高样品的试验浓度至20、50、与100μΜ，并以实验例一的方法进行试验。每个 浓度的样品各4组，其实验结果是显不如图2Α~图2Β。图2Α是样品抑制A β 4(|累积的试 验结果图，图2Β是经样品处理后的细胞存活率分析结果图。图2Α~图2Β的结果为四个实 验组的平均值土标准误差（η = 4)，而对照组与测试样品组间以杜纳多重比较检定分析其 统计差异，其中以表示P < 0. 05 ;以"**"表示ρ < 0. 01 ;以"***"表示ρ < 0. 001 ;并 以 '' **** " 表示 ρ〈0· 0001。
[0172] 实验例二是增加样品3、4以及6的样品浓度，在不影响细胞毒性的状况下，以取得 试验样品抑制A β 4Q累积的最佳浓度与最佳效果。根据图2Α~图2Β的结果显示，在不造成 细胞毒性的状况下，样品3在20 μ M可抑制约20 %的累积，且样品6在50 μ M可抑制约40 % 的累积，而提高样品浓度则未能进一步促进样品4抑制Aβ累积的效果。
[0173] 因此，根据实验例一及实验例二的结果可知，本发明的异类叶升麻苷衍生物确实 具有抑制A β 4(|累积的功效。
[0174] 实验例三、抑制Αβ聚集的试验（I)
[0175] 实验例三是验证样品抑制A β 4(|聚集与抑制A β 42寡聚的功效。
[0176] A β 4。聚集：将A β 4。溶液以DMSO回溶至10mg/mL。每组反应包含0· 5 μ 1的IOmg/ mL的Αβ4(ι与4. 5 yL的以杜氏磷酸盐缓冲生理盐水（Dulbecco, s Phosphate-Buffered Saline，D-PBS)稀释后的试验样品。样品1的浓度为10 μΜ与100 μΜ，样品2~8的 浓度为20 μΜ与200 μΜ。反应总体积为5 μ L，每个浓度各6组，于37°C的培养箱反应 4小时后，加入200 μ L的硫代黄素 T工作溶液（Thioflavin T working solution，ThT working solution)，充分混合，其中硫代黄素 T为10 μ M的硫代黄素 T溶于磷酸钾缓冲液 (Potassium phosphate buffer，ρΗ6· 0)。取200 μ L的混合液置于黑色透明底的96孔盘， 并由盘子底部测量硫代黄素 T的荧光强度（Ex :440nm，Em :482nm)，藉以判定Αβ 4Q的聚集 程度。本实验例是以硫代黄素 T试验（thioflavin T assay，ThT assay)测量Αβ聚集的 程度。由于ThT与刚果红（Congo red)类衍生物可与聚合型态的Αβ蛋白形成键结，因此 Αβ聚集程度越高，键结的ThT数量则越多。藉由侦测ThT的含量变化，便可推估Αβ聚集 的改变程度。以未加入任何试验样品反应的读值（即只含有〇. 5 μ L的A β 4(|与4. 5 μ L的 D-PBS，其中Αβ4(ι的最终浓度为lmg/mL)作为对照组，将其读值设定为100%，并以异类叶 升麻苷（IsoA)正对照组。样品的读值则与对照组做比较并以百分比表示。实验结果如图 3A~图3B，其是显示六个实验组的平均值土标准误差（η = 6)，而对照组与测试样品组间 以杜纳多重比较检定分析其统计差异，其中以表示P < 0. 05 ;以"**"表示ρ < 0. 01 ; 以 " 表示 P < 〇· 001 ;并以 '' **** " 表示 ρ〈〇· 〇〇〇 1。
[0177] 图3Α是显示低浓度样品1~9抑制Aβ 4(|聚集的试验结果。样品1的浓度为10 μΜ， 样品2~9的浓度为20 μ Μ，而IsoA的浓度为10 μ g/mL。以未加入任何样品的对照组所 测得的读值设为100%，并将其余数值作相对应调整。图3B是显示高浓度样品1~9抑制 A β4(ι聚集的试验结果。样品1的浓度为100 μ M，样品2~9的浓度为200 μ M，而IsoA的 浓度为100 μ g/mL。以未加入任何样品的对照组所测得的读值设为100 %，并将其余数值 作相对应调整。根据图3A的试验结果显示，在低浓度时，样品2在20 μΜ的浓度可抑制约 20%的Αβ4(ι聚集，而在同样的浓度，样品4与样品8可抑制约30%的Αβ 4。聚集。根据图 3Β的提高试验样品浓度并重复试验的结果显示，在200 μ M的浓度，样品2与样品4可抑制 约50%的Αβ4(ι聚集，而样品8有抑制高达70%的Αβ 4(|聚集的效果。
[0178] 实验例四、抑制Αβ聚集的试验（II)
[0179] 实验例四是提尚样品浓度，验证样品抑制A β 42聚集的功效。
[0180] 实验方法：A β 42以DMSO回溶至2. 5mg/mL，样品1~9则以D-PBS稀释至适当浓 度。样品1的浓度为10 μ M与100 μ M，样品1~9的浓度为20 μ M与200 μ M，而IsoA的浓 度为10 μ g/mL与100 μ g/mL。每组反应包含1 μ L的A β 42 (最终浓度：0. 25mg/mL)与9 μ L 的试验样品，每个浓度的样品各8组，混合均匀后置于37°C下反应30分钟。反应完毕后加 入200 μ L的硫代黄素 T工作溶液充分混合，取200 μ L的混合液置于透明底的黑色96孔盘 并由盘子底部测量硫代黄素 T的荧光强度（Ex :440nm，Em :482nm)，藉以判定A β 42的聚集程 度。以未加入任何试验样品反应（即只含有IyL的Af34^9yL的D-PBS，其中Αβ 42的 最终浓度为〇.25mg/mL)作为对照组，将其读值设定为100%，并以异类叶升麻苷（IsoA)正 对照组。样品的读值则与对照组做比较并以百分比表示。实验结果示于图4A~图4B，其是 显示九个实验组的平均值土标准误差（η = 8)，而对照组与测试样品组间以杜纳多重比较 检定分析其统计差异，其中以表示P < 〇. 05 ;以"**"表示ρ < 0. 01 ;以"***"表示ρ <0· 001 ;并以 "****" 表示 ρ〈0· 0001。
[0181] 图4Α是显示低浓度样品1~9抑制A β 42聚集的试验结果。样品1的浓度为10 μ Μ， 样品2~9的浓度为20 μ Μ，而IsoA的浓度为10 μ g/mL。A β 42的聚集量是以硫代黄素 T 试验测量，以未加入任何样品的对照组所测得的读值设为100%，并将其余数值作相对应调 整。图4B是显示高浓度样品1~9抑制A β 42聚集的试验结果。样品1的浓度为100 μ M， 样品2~9的浓度为200 μ Μ，而IsoA的浓度为100 μ g/mL。A β 42的聚集量是以硫代黄素 T 试验测量，以未加入任何样品的对照组所测得的读值设为100%，并将其余数值作相对应调 整。
[0182] 根据图4Α的试验结果显示，在低样品浓度时，样品2在20 μM的浓度可抑制约 20 %的A β 42聚集，而样品4与样品8在20 μ M的浓度各别可抑制约50 %与60 %的A β 42聚 集。根据图4Β的试验结果显不，提尚样品浓度后，样品2在200 μ M的浓度可抑制约40%的 A β 42聚集，样品4在200 μ M的浓度也可抑制约70%的A β 42聚集，而样品8在200 μ M的浓 度可完全抑制任何的A β 42聚集。
[0183] 因此，根据实验例三及实验例四的结果可知，本发明的异类叶升麻苷衍生物确实 具有抑制A β 4(|聚集与抑制A β 42聚集的功效。
[0184] 综上所述，根据实验例一至实验例四的结果可知，样品3、4以及6能降低细胞生成 A β4(ι，其中以样品6的效果最佳。而在评估样品是否能抑制A β聚集的部份，以硫代黄素 T 试验测量Αβ聚集的程度。试验结果显示样品2、4以及8可有效抑制Αβ4(ι与Αβ 42的聚 集，其中以样品8的效果最佳，其在200 μΜ的浓度可抑制约70%的Αβ4(ι聚集与约100%的 A β 42聚集。因此，本发明的异类叶升麻苷衍生物确实具有抑制类淀粉胜肽聚集的功效。
[0185] 除了 类淀粉胜肽外，本发明亦利用不同氧化压力对于视网膜上皮细胞的影 响，观察本发明的异类叶升麻苷衍生物对于视网膜色素上皮细胞的保护作用。
[0186] 实验例五、Aβ降解的试验
[0187] 实验例五是验证样品活化细胞外（extracellular)分解A β 40酵素活性的药物， 提高酵素分解A β 40的能力、降低细胞外A β 40含量的功效。
[0188] 实验方法：将2χ107个老鼠神经母细胞（Neuro_2a)贴于一 Τ175培养皿，隔夜后换 以30mL的化学成分确定的培养基再培养24小时，2
文档序号 :
【 9257319 】
技术研发人员：苏慕寰,林汉钦,胡明宽,李易达,王昭日
技术所有人：杏辉天力(杭州)药业有限公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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