一种螺旋藻多糖及其应用
[0046] (4)枯斑抑制率计算：接种72h后调查枯斑三生烟叶片产生枯斑数量，枯斑抑制率 计算公式如下：
[0047] X(V0) = (CK-Y)/CK X 100
[0048] 式中X为枯斑抑制率；CK为对照组叶片的平均枯斑数（个）；Y为螺旋藻多糖诱导 处理后叶片的平均枯斑数（个）。
[0049] 结果如表1所示，用0. 5mg/mL螺旋藻多糖处理过的烟草对烟草花叶病毒的抑制率 均在75%以上，效果明显优于同浓度下的海带多糖，
[0050] 说明螺旋藻多糖能够明显诱导烟草对烟草花叶病毒产生抗性。
[0051] 表1螺旋藻多糖抗烟草花叶病毒的结果
[0052]
[0053] 实施例4螺屁澡多椐沉畨加叶灰莓柄试验
[0054] 将实施例1所得到的螺旋藻多糖配制成0. lmg/mL的螺旋藻多糖水溶液，然后将螺 旋藻水溶液喷洒到已被灰霉病菌轻度感染的30cm高的番茄叶子上，每个处理重复3次。对 照组为同等浓度的海带多糖，空白组用清水替代。3天后通过计量实验组与空白对照组的病 斑面积比确定防治病的效果。结果见表2。
[0055] 表2螺旋藻多糖抗番爺灰霉病的结果
[0056]
[0057] 由表2可见，同海带多糖水溶液相比，螺旋藻多糖水溶液在防治番茄灰霉病的效 果上更好。
[0058] 实施例5螺旋藻多糖抗水稻白叶枯病的试验
[0059] 将实施例1所得的螺旋藻多糖配成浓度为0. 20mg/mL螺旋藻多糖水溶液。
[0060] 1、将水稻种子播种于盛有稻田土壤的塑料盆内，每盆10粒种子，每个处理重复3 次。
[0061] 2、将水稻白叶枯病菌调节浓度至10sCFU/mL。
[0062] 3、3个星期后，将螺旋藻水溶液喷洒到水稻幼苗上，每盆喷洒5mL，同时用同等浓 度的壳聚糖水溶液作对照。空白组用等量灭菌蒸馏水喷洒。
[0063] 4、风干后，将上述步骤2的菌液喷洒接种到步骤3中的水稻幼苗上，每盆喷洒5mL。
[0064] 5、用塑料袋覆盖所有接种过的幼苗24h，在温室中培养，温度为28°C，相对湿度 90%，每天光照16h黑暗8h交替培养。
[0065] 6、接种后7d，观察和记录病害发生率和病斑的平均直径大小，全部试验重复3次。 未接种白叶枯病病菌的水稻幼苗则未表现出病害症状。
[0066] 试验结果表明，螺旋藻多糖水溶液处理的水稻其白叶枯病发病率和病斑直径显著 低于空白组，并低于壳聚糖水溶液处理组（表3)。
[0067] 表3螺旋藻多糖抗水稻幼苗白叶枯病的结果
[0068]
[0069] 实施例6抗肿瘤试验
[0070] 1、接种取对数生长期的人胃癌MKN45细胞，调整细胞浓度为IX IO5个/mL，加入96 孔培养板中，每孔100 μ L。
[0071 ] 2、培养与药物处理置37 °C、5 % CO2孵箱中培养24h后，吸出培养液，分别加入不同 浓度螺旋藻多糖溶液作为试验组，同时以400 μ g/mL环磷酰胺作为阳性对照组，空白组只 加培养液，每个浓度3孔重复，继续培养48h。
[0072] 3、呈色培养结束前4h，每孔加 MTT溶液20 μ L，继续培养4h后吸弃上清液，然后加 DMSO 200 μ L/孔，震荡溶解结晶物。
[0073] 4、比色和计算酶标仪比色（570nm)，测吸光度值，并按以下公式计算生长抑制率：
[0074] 细胞抑制率=(1-给药组A值/对照组A值）X 100 %。
[0075] 本发明中的螺旋藻多糖浓度为100~800 μ g/mL在体外产生对人胃癌MKN45细胞 较明显的生长抑制，对胃癌MKN45细胞最大抑制率为45%，环磷酰胺对胃癌细胞抑制率为 25%。
[0076] 实施例7抗肿瘤试验
[0077] 1、接种取对数生长期的人宫颈癌（HELA)细胞，调整细胞浓度为I X IO5个/mL，加 入96孔培养板中，每孔100 μ L。
[0078] 2、培养与药物处理置37°C、5% CO2孵箱中培养24h后，吸出培养液，分别加入不同 浓度螺旋藻多糖溶液作为试验组，同时以400 μ g/mL环磷酰胺作为阳性对照组，空白组只 加培养液，每个浓度3孔重复，继续培养48h。
[0079] 3、呈色培养结束前4h，每孔加 MTT溶液20 μ L，继续培养4h后吸弃上清液，然后加 DMSO 200 μ L/孔，震荡溶解结晶物。
[0080] 4、比色和计算酶标仪比色（570nm)，测吸光度值，并按以下公式计算生长抑制率：
[0081 ] 细胞抑制率=(1-给药组A值/对照组A值）X 100 %。
[0082] 本发明中的螺旋藻多糖浓度为100~800 μ g/mL在体外产生对人宫颈癌（HELA) 细胞有较明显的生长抑制，最大抑制率为75%，环磷酰胺对宫颈癌细胞抑制率为65%。
[0083] 实施例8抗肿瘤试验
[0084] 1、接种取对数生长期的人结肠癌HT29细胞，调整细胞浓度为I X IO5个/mL，加入 96孔培养板中，每孔100 μ L。
[0085] 2、培养与药物处理置37°C、5% CO2孵箱中培养24h后，吸出培养液，分别加入不 同浓度螺旋藻多糖溶液作为试验组，同时以400 μ g/mL环磷酰胺作为阳性对照组，空白组 只加培养液，每个浓度3孔重复，继续培养48h。
[0086] 3、呈色培养结束前4h，每孔加 MTT溶液20 μ L，继续培养4h后吸弃上清液，然后 加 DMSO 200 μ L/孔，震荡溶解结晶物。
[0087] 4、比色和计算酶标仪比色（570nm)，测吸光度值，并按以下公式计算生长抑制 率：
[0088] 细胞抑制率=(1-给药组A值/对照组A值）X 100 %。
[0089] 本发明中的螺旋藻多糖浓度为100~800 μ g/mL在体外产生对人结肠癌HT29细 胞最大抑制率为25%，明显高于环磷酰胺15%的抑制率。
【主权项】
1. 一种富含葡萄糖的螺旋藻多糖，其特征在于：所述螺旋藻多糖为富含葡萄糖的螺旋 藻多糖，所述的富含葡萄糖的螺旋藻多糖由鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳 糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸9种单糖组成；其中葡萄糖含量超过50%。2. 根据权利要求1所述的螺旋藻多糖，其特征在于：其摩尔比（以半乳糖醛酸的摩尔 数为基数计算）为分别为鼠李糖：岩藻糖：阿拉伯糖：木糖：甘露糖：半乳糖：葡萄糖：葡萄 糖醛酸：半乳糖醛酸=2. 2~2. 8:1. 4~1. 7 :1· 4~1. 6 :1· 5~1. 7 :1. 1~1. 6 :2· 6~ 2. 8 :68· 4 ~73. 3 :1· 0 ~1. 1 :1。3. 根据权利要求1或2所述的螺旋藻多糖，其特征在于：分子量为10-100KDa。4. 根据权利要求1、2或3所述的螺旋藻多糖，其特征在于：所述的富含葡萄糖的螺旋 藻多糖提取制备方法为： 将经营养调控得到的高糖螺旋藻进行高压均质破壁，并用热水浸提法提取多糖，絮凝 剂除蛋白，再通过浓缩、沉淀和干燥，得到富含葡萄糖的螺旋藻多糖。5. 根据权利要求4所述的螺旋藻多糖，其特征在于： 所述高压破碎工艺为：将螺旋藻粉与水按质量体积比1:10~50 (g/ml)制备成悬浮液， 经过高压均质机破碎，高压匀质的压力为40~120MPa，高压匀质次数为1~5次，得螺旋藻 破碎液； 所述热水提取方法为：取上述螺旋藻破碎液，控制螺旋藻破碎液中螺旋藻与水质量体 积比为1:10~50,在30~90°C热水浸提法提取螺旋藻多糖，浸提时间为2~6h，提取后 3000~8000rpm离心5~20min，去除沉淀物，收集上清，得到多糖溶液； 所述絮凝剂除蛋白的絮凝剂为聚合硫酸铁、聚硅酸铁、聚硅酸硫酸铁、聚磷氯化铁或 ZTC1+1的一种或两种以上混合物；使用前2~24h絮凝剂分别配制成质量浓度0. 2~2% 溶液，絮凝1~3h，絮凝剂溶液添加量分别为多糖溶液体积的1~5% (v/v);絮凝后离心 去除沉淀物，收集上清液； 絮凝离心后的上清液加热浓缩；浓缩为过程为：于上述提取液在40~70°C，转速40~ 120rpm的条件下旋转蒸发至原溶液体积的1/2~1/8 ; 沉淀过程为：于浓缩液中加入浓缩液2~8倍体积沉淀剂，沉淀剂为乙醇、丙酮、丁醇、 2_ 丁醇的一种或者两种以上的混合物；然后3000~8000rpm离心5~30min，得到沉淀部 分，将沉淀部分进行干燥，得到螺旋藻多糖。6. 根据权利要求4或5所述的螺旋藻多糖，其特征在于： 所述絮凝剂絮凝除蛋白的过程，优选是将聚合硫酸铁、聚硅酸铁、聚硅酸硫酸铁或聚磷 氯化铁的一种或两种以上混合物与ZTC1+1联合使用；使用前2~24h絮凝剂分别配制成质 量浓度0. 2~2%溶液，在絮凝时先添加聚合硫酸铁、聚硅酸铁、聚硅酸硫酸铁、聚磷氯化铁 中的一种或两种以上混合物絮凝1~3h后，然后再添加 ZTC1+1，絮凝1~3h ;絮凝剂溶液 每次添加量分别为多糖溶液体积的1~5% (v/v);絮凝后离心去除沉淀物，收集上清液。7. -种权利要求1-6任一所述的螺旋藻多糖的应用，其特征在于： 所述富含葡萄糖的螺旋藻多糖具有诱导植物抗病活性，所述的螺旋藻多糖可作为植物 诱抗剂。8. -种权利要求1-6任一所述的螺旋藻多糖的应用，其特征在于： 所述富含葡萄糖的螺旋藻多糖具有抗肿瘤活性，所述的螺旋藻多糖在制备抗肿瘤药物 或保健食品中的应用。
【专利摘要】本发明涉及富含葡萄糖的螺旋藻多糖及其在植物绿色农药和抗肿瘤药物中的应用。本发明以经营养调控得到的高糖螺旋藻为原料，经热水浸提法、絮凝剂除蛋白、浓缩、沉淀和冷冻干燥，得到一种水溶性高糖螺旋藻多糖，分子量在10～200kDa，其单糖组成主要为鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸，其特点为单糖组成中，葡萄糖含量超过50％。该螺旋藻多糖可明显诱导植物抗病性，并对肿瘤具有明显的抑瘤效果，可作为一种生物农药和抗肿瘤药物。
【IPC分类】A01N43/16, A61K36/02, A01P3/00, A61P35/00, A01P1/00
【公开号】CN105707072
【申请号】CN201410729758
【发明人】刘启顺, 尹恒, 孙永欣, 陈玮, 王文霞
【申请人】中国科学院大连化学物理研究所
【公开日】2016年6月29日
【申请日】2014年12月3日
文档序号 :
【 9925799 】
技术研发人员：刘启顺,尹恒,孙永欣,陈玮,王文霞
技术所有人：中国科学院大连化学物理研究所
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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