一种螺旋藻多糖及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及到多糖及其生物活性研究，详细研究了一种经营养调控的高糖螺旋藻 中的富含葡萄糖的螺旋藻多糖的生物活性及其应用，属于糖工程和糖生物学领域。
【背景技术】
[0002] 随着农业的迅速发展，植物病害也越来越严重，极大影响了农业植物的产量。为了 控制植物病害，主要采用化学杀菌剂和培育抗性品种等，但化学杀菌剂不仅能引起环境污 染，还危机人类健康，而抗性新品种也由于选育时间长、耗资大、抗性易退化等原因而发展 缓慢，所以安全、环保、快速的控制植物病害方法迫在眉睫。
[0003] 已有研究结果表明，植物在长期进化过程中由于需要不断抵抗微生物的侵害，逐 渐形成一系列复杂而行之有效的防御系统，当植物受到侵染，防御系统便得到启动，达到清 除病菌保护自身目的。诱导机制比较复杂，主要在如下几方面：1、寄主的木质化反应；2、植 保素增加；3、酚类物质积累；4、病程相关蛋白积累，如几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶等；防御 酶系的变化，如过氧化物酶、多酚氧化酶等。相比其它病害防治方法，诱导抗病具有使用技 术简单、抗病谱广、病原菌无耐药性且对环境无污染等优点。
[0004] 目前已报道的具有诱导抗病性的寡糖类有寡聚半乳糖醛酸、壳聚糖、野菊 多糖等，还未见螺旋藻多糖作为植物诱导子应用于农业植物抗病的报道。螺旋藻 (Spirulinaplatensis)是单细胞藻类，属蓝藻门，生态分布广，易于培养，生长速度快，含有 大量的生物活性物质，如碳水化合物、蛋白质和维生素等。本发明提供一种螺旋藻多糖用于 植物抗病诱导剂，防治植物病害。
[0005] 肿瘤是现代社会人类健康面临的重大问题，化学药物在抑制肿瘤方面取得重要进 展，但是也有诸多不足，如耐药性、副作用等。从天然物质中发现和提取具有抗肿瘤活性的 物质，一直是抗肿瘤药物研究的重点和热点。另外，从食疗角度和提高天然产物的开发深度 来说，开发螺旋藻多糖的抗肿瘤活性也具有重要的意义。所以本发明则从经营养调控的高 糖螺旋藻提取到一种新型螺旋藻多糖，提供其在抗肿瘤方面的活性应用，具有重要意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种从经营养调控的高糖螺旋藻提取的新型螺旋藻多糖， 用于植物病害防控、壮苗及抗肿瘤药物的用途。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0008] -种富含葡萄糖的螺旋藻多糖，所述螺旋藻多糖为富含葡萄糖的螺旋藻多糖，所 述的富含葡萄糖的螺旋藻多糖由鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、 葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸9种单糖组成；其中葡萄糖含量超过50%。
[0009] 其单糖组成摩尔比（以半乳糖醛酸的摩尔数为基数计算）为分别为鼠李糖： 岩藻糖：阿拉伯糖：木糖：甘露糖：半乳糖：葡萄糖：葡萄糖醛酸：半乳糖醛酸=2. 2~ 2. 8:1. 4 ~L 7 :1· 4 ~L 6 :1· 5 ~I. 7 :1. 1 ~L 6 :2· 6 ~2. 8 :68· 4 ~73. 3 :1. 0 ~I. 1 : 1。分子量为l〇-l〇〇KDa。
[0010] 所述的富含葡萄糖的螺旋藻多糖提取制备方法为：
[0011] 将经营养调控得到的高糖螺旋藻进行高压均质破壁，并用热水浸提法提取多糖， 絮凝剂除蛋白，再通过浓缩、沉淀和干燥，得到富含葡萄糖的螺旋藻多糖。
[0012] 所述高压破碎工艺为：将螺旋藻粉与水按质量体积比1:10~50(g/ml)制备成悬 浮液，经过高压均质机破碎，高压匀质的压力为40~120MPa，高压匀质次数为1~5次，得 螺旋藻破碎液；
[0013] 取上述螺旋藻破碎液，控制螺旋藻破碎液中螺旋藻与水质量体积比为1:10~50， 在30~90°C热水浸提法提取螺旋藻多糖，浸提时间为2~6h，提取后3000~8000rpm离 心5~20min，去除沉淀物，收集上清，得到多糖溶液；
[0014] 所述絮凝剂除蛋白的絮凝剂为聚合硫酸铁、聚硅酸铁、聚硅酸硫酸铁、聚磷氯化铁 或ZTC1+1的一种或两种以上混合物；使用前2~24h絮凝剂分别配制成质量浓度0. 2~ 2%溶液，絮凝1~3h，絮凝剂溶液添加量分别为多糖溶液体积的1~5% (v/v);絮凝后离 心去除沉淀物,收集上清液；
[0015] 絮凝离心后的上清液加热浓缩；浓缩为过程为：于上述提取液在40~70°C，转速 40~120rpm的条件下旋转蒸发至原溶液体积的1/2~1/8 ;
[0016] 沉淀过程为：于浓缩液中加入浓缩液2~8倍体积沉淀剂，沉淀剂为乙醇、丙酮、丁 醇、2-丁醇的一种或者两种以上的混合物；然后3000~8000rpm离心5~30min，得到沉淀 部分，将沉淀部分进行干燥，得到螺旋藻多糖。
[0017] 所述絮凝剂絮凝除蛋白的过程，优选是将聚合硫酸铁、聚硅酸铁、聚硅酸硫酸铁或 聚磷氯化铁的一种或两种以上混合物与ZTC1+1联合使用；使用前2~24h絮凝剂分别配制 成质量浓度〇. 2~2%溶液，在絮凝时先添加聚合硫酸铁、聚硅酸铁、聚硅酸硫酸铁、聚磷氯 化铁中的一种或两种以上混合物絮凝1~3h后，然后再添加 ZTC1+1，絮凝1~3h ;絮凝剂 溶液每次添加量分别为多糖溶液体积的1~5% (v/v);絮凝后离心去除沉淀物，收集上清 液。
[0018] 所述富含葡萄糖的螺旋藻多糖具有诱导植物抗病活性，所述的螺旋藻多糖可作为 植物诱抗剂。
[0019] 所述富含葡萄糖的螺旋藻多糖具有抗肿瘤活性，所述的螺旋藻多糖在制备抗肿瘤 药物或保健食品中的应用。
[0020] 本发明具有如下优点：
[0021] 1本发明表明螺旋藻多糖具有诱导植物抗病性，来源天然，无副作用，可开发成植 物绿色农药或食品添加剂。
[0022] 2螺旋藻多糖原料为经过人工营养调控培养，其来源广泛、价格低廉，本发明有利 于螺旋藻的综合利用并提高其附加值。
[0023] 3该发明螺旋藻多糖具有明显抗肿瘤活性，有效率高，可用于新型抗肿瘤药物开 发，且无毒副作用。
【附图说明】
[0024] 图1.实施例1的螺旋藻多糖气相色谱图；
[0025] 图2.实施例1的螺旋藻多糖红外光谱图；
[0026] 其中：
[0027] 图1中，a:鼠李糖b:岩藻糖c:阿拉伯糖d:木糖e:甘露糖f:半乳糖g:葡萄 糖h:葡萄糖醛酸i:半乳糖醛酸低糖藻粉中9种单糖比例：4. I :1. 4 :1. 4 :2 :1. 3 :6 :22. 8 : 1. 4 :1 高糖藻粉中 9 种单糖比例：2. 8 :1. 7 :1. 6 :1. 7 :1. 6 :2. 8 :73. 3 :1. 1 :1。
[0028] 图2中，a :普通螺旋藻多糖；b :制备的新型螺旋藻多糖。
【具体实施方式】
[0029] 以下通过实施例来进一步阐述【具体实施方式】，但不用来限制本发明的范围。
[0030] 实施例1螺旋藻多糖的提取
[0031] 1.取高糖螺旋藻藻粉10g，采用水作为提取液，搅拌溶解至螺旋藻充分溶胀（固液 比1:30)，常温条件下高压匀质，压力为80MPa，连续3次。
[0032] 2.高压匀质液用80°C热水浸提法提取螺旋藻水溶性多糖，浸提时间为4h，提取后 6000rpm高速离心20min，去除沉沉物，收集上清。
[0033] 3.采用絮凝剂除蛋白，絮凝剂为聚硅酸硫酸铁和ZTC1+1 (A组分和B组分，由北京 中科圣源生物技术有限公司生产）联用，用前24h分别配制成1 %溶液，在絮凝时先后添加， 絮凝剂添加量分别为多糖溶液体积的1 %，3. 5 % (B组分）和2 % (A组分），絮凝时间为2h。
[0034] 4.絮凝后采用高速离心去除沉淀物，收集上清后在60°C，转速SOrpm的条件下旋 转蒸发至原溶液体积的1/3,加入3倍体积95%乙醇，5000rpm离心15min，得到沉淀部分， 最后直接进行干燥，得到螺旋藻水溶性固体，采用硫酸-苯酚法分析其多糖纯度为95%，多 糖收率为90%。
[0035] 5.采用高效凝胶过滤色谱法测定该多糖的相对分子质量为12、37、64、93和 163KDa，采用气相色谱法测定其单糖组成及摩尔比为鼠李糖：岩藻糖：阿拉伯糖：木糖：甘 露糖：半乳糖：葡萄糖：葡萄糖醛酸：半乳糖醛酸=2.8 :1. 7 :1. 6 :1. 7 :1. 6 :2. 8 :73. 3 : 1. 1 :1〇
[0036] 实施例2螺旋藻多糖的提取
[0037] 1.取高糖螺旋藻藻粉10g，采用水作为提取液，搅拌溶解至螺旋藻充分溶胀（固液 比1:40)，常温条件下高压匀质，压力为80MPa，连续3次。
[0038] 2.高压匀质液用90°C热水浸提法提取螺旋藻水溶性多糖，浸提时间为4h，提取后 6000rpm高速离心20min，去除沉沉物，收集上清。
[0039] 3.采用絮凝剂除蛋白，絮凝剂为聚硅酸铁，絮凝剂添加量分别为多糖溶液体积的 2%，絮凝时间为2h。
[0040] 4.絮凝后采用高速离心去除沉淀物，收集上清后在60°C，转速SOrpm的条件下旋 转蒸发至原溶液体积的1/3,加入3倍体积95%乙醇，5000rpm离心15min，得到沉淀部分， 最后直接进行干燥，得到螺旋藻水溶性固体，采用硫酸-苯酚法分析其多糖纯度为89%，多 糖收率为91%。
[0041] 5.采用高效凝胶过滤色谱法测定该多糖的相对分子质量为12、36、63、95和 163KDa，采用气相色谱法测定其单糖组成及摩尔比为鼠李糖：岩藻糖：阿拉伯糖：木糖：甘 露糖：半乳糖：葡萄糖：葡萄糖醛酸：半乳糖醛酸=2. 2:1.4 :1. 4 :1. 5 :1. I :2. 6 :68.4 : 1.0 :1〇
[0042] 实施例3螺旋藻多糖诱导烟草抗烟草花叶病毒试验
[0043] (1)喷雾处理：将实施例1制备的螺旋藻多糖分别用水稀释得到浓度为0. 1~ 0. 5mg/mL的溶液，然后分别对六至八叶期的枯斑三生烟进行全株喷雾，设三个重复，每个重 复三株；同时以同等浓度海带多糖作为对照，空白组用清水喷雾。
[0044] (2)病毒接种液的制备：病毒来源为本研究室保存普通株系，将感染烟草花叶病 毒的普通烟的叶片去除主脉，与PBS(pH8. 0, 0.0 lmol/L)按lg/20mL混合，每20mLPBS加 0. 015g金刚砂，充分研磨叶片，得到接种液。
[0045] (3)接种：按步骤⑴方法喷雾处理枯斑三生烟植株72h后，用步骤⑵得到的接 种液进行汁液摩擦接种（植病研究方法（第三版）
文档序号 :
【 9925799 】
技术研发人员：刘启顺,尹恒,孙永欣,陈玮,王文霞
技术所有人：中国科学院大连化学物理研究所
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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