一种渤丰3号杨经愈伤法高效遗传转化体系的建立方法与流程

本发明涉及组织培养及基因编辑，特别是涉及一种渤丰3号杨经愈伤法高效遗传转化体系的建立方法。

背景技术：

1、渤丰3号杨(populus×euramaricana cl.‘bofeng 3’)，属欧美杨，是中国林业科学研究院针对东北南部地区天然林日渐枯竭、短轮伐期优良纸浆树种缺乏，选育并重点推广的速生杨树国家良种，树干通直圆满、窄冠、耐瘠薄、抗寒、抗病，适于短轮伐期速生杨纸浆材。在我国东北等北方地区已经大面积推广种植，将是三北平原地区杨树速生丰产林的更新换代新品种。以转基因为代表的生物育种是育种领域的革命性技术，是必须抢占的新领域新赛道，而基因编辑育种基因编辑是近年来作为生命科学技术发展中的一项突破性技术，实现了对受体基因组位点信息的精准修饰，能更加精准的的改良其抗旱耐盐等能力。由于我国气候条件各异，适宜生长的林木品种也各不相同。因此必须利用自主选育出的适于我国各杨树主产区有地域特色良种进行基因编辑育种，才更具推广应用价值。高效遗传转化体系的建立是利用良种创制基因编辑新品种的关键前提，但当前早期选育的欧美杨品种面临遗传转化效率不高，而近年新选育良种尤其适宜三北地区更新换代良种的高效遗传转化体系尚未建立的问题，如何建立更加高效且适于基因编辑的适宜北方地区推广种植的渤丰3号杨良种遗传转化体系成为科技工作者必须解决的问题。

2、现有杨树的遗传转化技术多依赖于传统的遗传转化体系，先通过植物茎段获得无菌苗，然后利用农杆菌对叶片、叶柄等进行侵染，然后诱导形成愈伤组织，再对愈伤组织诱导分化筛选出阳性植株后实现转化过程。本研究团队前期研究获得了渤丰1号杨高效再生体系，以叶片为外植体的分化率和生根率均达100％，叶片的平均分化芽数多达20个以上，组培苗移植成活率可达98％，40mg/l卡那霉素可以抑制渤丰l号杨叶片的诱导与分化，20mg/l卡那霉素可以抑制渤丰l号杨不定芽的生根。但是，其遗传转化效率较低仅为4.3％～6.25％。且植物的再生及遗传转化体系高度依赖于基因型，关于渤丰杨3号杨的遗传转化体系还尚未建立，研究团队经过前期研究发现渤丰杨3号杨无菌苗存在在组培瓶中继代时间过长容易导致蹲苗、不易生根，以及组培苗叶片薄对农杆菌、抗生素敏感等问题，需要频繁更新一代无菌苗，且利用无菌苗叶片进行直接诱导出芽的遗传转化，转化效率相对较低且其不稳定。在上述背景下，如何利用渤丰3号杨无菌叶片进行愈伤组织诱导进而进行遗传转化成为必须解决的技术问题，以提高渤丰3号杨愈伤组织遗传转化效率。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种渤丰3号杨经愈伤法高效遗传转化体系的建立方法，采用本发明提供的方法提高了渤丰3号杨愈伤组织遗传转化效率，达到11.48％。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明提供了一种渤丰3号杨经愈伤法高效遗传转化体系的建立方法，包括以下步骤：

4、1)将渤丰3号杨的半木质化茎段进行消毒处理，处理成1.5～2cm的单腋芽段后进行启动培养，得到1～2cm的腋芽；

5、2)将所述步骤1)得到的腋芽进行生根培养，得到组培苗；

6、所述生根培养使用的生根培养基为：wpm+0.02mg/l iba+0.02mg/lnaa+30g/l蔗糖+6.5g/l琼脂粉，ph 5.8～6.0；

7、3)取所述步骤2)得到的组培苗顶端2～3片嫩叶、去除边缘，处理成0.5×1cm的块后进行预培养，得到预培养叶片；

8、所述预培养使用的预培养基为：wpm+0.5g/l mes+1mg/l 2,4-d+0.1mg/l kt+20g/l蔗糖+5g/l凝胶，ph 5.8～6.0；

9、4)将所述步骤3)得到的预培养叶片进行农杆菌侵染、共培养后进行愈伤组织诱导，得到抗性愈伤组织；

10、所述共培养使用的培养基为：wpm+0.5g/lmes+1mg/l 2,4-d+0.1mg/lkt+100μmol/las+20g/l蔗糖+5g/l凝胶，ph 5.8～6.0；

11、所述抗性愈伤组织诱导使用的培养基为：wpm+0.5g/l mes+1mg/l2,4-d+0.1mg/lkt+3mg/l hyg+200mg/l tim+20g/l蔗糖+5g/l凝胶，ph 5.8～6.0；

12、5)将所述步骤4)得到的愈伤组织进行分化筛选培养，得到抗性芽；

13、所述分化筛选培养使用的培养基为：wpm+0.5g/lmes+0.5mg/l 6-ba+0.05mg/lnaa+3mg/l hyg+200mg/l tim+20g/l蔗糖+5g/l凝胶，ph5.8～6.0；

14、6)将所述步骤5)得到的抗性芽进行抗性生根培养，实现渤丰3号杨遗传转化；

15、所述抗性生根培养使用的培养基为wpm+0.01mg/l iba+3mg/l hyg+200mg/ltim+20g/l蔗糖+5g/l凝胶，ph 5.8～6.0。

16、优选的，所述步骤1)消毒处理的条件包括：在洗涤灵水中浸泡30min，于流动的自来水下冲洗2h，沥干水分后在无菌条件下用体积百分含量为70％乙醇溶液处理30s，用质量百分含量10％次氯酸钠溶液处理5～8min，再用无菌水冲洗4～5次，期间保持轻柔晃动。

17、优选的，所述步骤1)启动培养使用的培养基为：1/2ms+30g/l蔗糖+6.5g/l琼脂粉，ph 5.8～6.0；

18、所述启动培养的条件包括：光周期16h/8h，光照强度2000lux，培养温度25℃，湿度为60％～70％，时间为15～20d。

19、优选的，所述步骤2)生根培养的条件包括：光周期16h/8h，光照强度2000lux，培养温度25℃，湿度为60％～70％，时间为30d。

20、优选的，所述步骤3)预培养的条件包括：光周期16h/8h，光照强度2000lux，培养温度25℃，湿度为60％～70％，时间为1～2d。

21、优选的，所述步骤4)农杆菌以农杆菌菌液进行侵染，所述农杆菌菌液的od600值为0.4～0.6，所述侵染的时间为10～15min。

22、优选的，所述步骤4)共培养的条件包括：避光培养3～4d，培养温度25℃。

23、优选的，所述步骤4)抗性愈伤组织诱导的条件包括：光周期16h/8h，光照强度2000lux，培养温度25℃，每10d更换1次培养基。

24、优选的，所述步骤5)分化筛选培养的条件包括光周期16h/8h，光照强度2000lux，培养温度25℃，湿度为60％～70％，每10～15d更换1次培养基。

25、优选的，所述步骤6)抗性生根培养的条件包括：光周期16h/8h，光照强度2000lux，培养温度25℃，湿度为60％～70％，时间为30d。

26、有益效果：

27、采用本发明提供的方法提高了渤丰3号杨愈伤组织遗传转化效率，达到11.48％。