用于间充质干细胞诱导的免疫调节的组合物和治疗方法
[0067] 虽然Fas+lprBMMSC表达了功能性FasL，其未能在体内诱导T细胞凋亡和上调 Treg。在机理上，Fas控制了 BMMSC中的趋化细胞因子MCP-I的分泌。来自IprBMMSC的 MCP-I分泌的减少导致无法将活化的T细胞募集至BMMSC (Carr等，1994 ;Xu等，1996)，且因 此Fas^lprBMMSC的注输未能在体内诱导T细胞凋亡。然而，当将IprBMMSC与⑶3+T细胞 直接共培养时，其能够诱导T细胞凋亡，从而表明IprBMMSC可能未能在体内启动与T细胞 的细胞-细胞接触。而且，Fas+lprBMMSC显示出比对照BMMSC更高的胞质MCP-I水平，表 明Fas调节MCP-I分泌而不是MCP-I生成。当将MCP-r^BMMSC系统性植入C57BL6小鼠时， 与MCP-I分泌性BMMSC组相比，⑶3+T细胞凋亡和Treg上调显著减少，从而表明MCP-I是 调苄基于MSC的免疫耐受性的因素之一。据报道，BMMSC能抑制⑶4/Thl7T细胞同时MCP-I 旁分泌从激动剂转化为拮抗剂（Rafei等，2009)。此处，发明人展示出MCP-I帮助募集T细 胞以使Treg上调。据报道，BMMSC移植通过诱导延迟的T细胞凋亡、上调的Treg以及下调 的Thl7细胞而诱导了空Fas (Fas null) Ipr小鼠中的免疫耐受性（Sun等，2009)，从而表明 BMMSC能够通过非Fas/FasL途径来诱导T细胞凋亡和免疫耐受。当Fas/FasL途径被阻断 时，BMMSC能够通过替代性途径与T细胞相互作用而导致T细胞凋亡。
[0068] 重要的是，本发明人的主要临床调研显示出，表达Fas和FasL的MSC的注输在同 种异体MSC注输的SS患者中诱导了⑶3+T细胞凋亡和Treg上调。在本发明的1至12个月 随访期中，未能发现任何副作用的临床指征，所述副作用包括心血管和肺功能不全、感染、 恶性肿瘤或代谢紊乱，这表明了所述MSC疗法在SS患者中的安全性。除生活品质的改善外， MRSS、HAQDI的减少表明同种异体MSC移植的治疗效果显著。此外，本发明人证明了所述移 植显著改善了难治性皮肤溃疡。
[0069] 因此，本发明人揭示了此前未被认知的BMMSC介导的治疗机理，通过这种机理， BMMSC利用Fas调节MCP-I分泌以进行T细胞募集，并随后利用FasL来诱导T细胞凋亡。 随后，巨噬细胞摄取凋亡的T细胞的碎片并释放高水平的TGF-β，从而导致Treg的上调并 最终导致对免疫疗法的免疫耐受。因此，Fas和FasL之间协同实现治疗效果可能代表了基 于细胞的疗法中受体/配体的新的功能性作用。
[0070] 在本文所述的方法中，MSC的有效量的范围可以为从是实施对象所安全接受的最 大细胞数量到实现所预定效果所必需的最小细胞数量。优选地，所述有效量为IX IO3细胞 /kg体重至I X IO7细胞/kg体重，更优选为I X 10 5细胞/kg体重至I X 10 7细胞/kg体重。 更优选地，所述有效量为约IX IO6细胞/kg体重。
[0071] 可以将有效量的MSC悬浮在药学可接受载剂或赋形剂中。此类载剂可以包括但不 限于适当的培养基加上1%血清白蛋白、盐水、缓冲盐水、右旋葡萄糖、水及其组合。制剂应 该与施用模式相适应。
[0072] 在优选实施方式中，根据常规程序将MSC制剂或组合物配制为适于系统施用至人 类的药物组合物。典型地，用于系统施用的组合物是无菌等渗水性缓冲液中的溶液。当组 合物将通过注输施用时，可将其用容纳有无菌药用级别的水或盐水的注输瓶来分配。当组 合物通过注射施用时，可以提供注射用无菌水或者盐水的安瓿瓶，从而可以在施用前将成 分混合。
[0073] 对于本领域技术人员而言，将细胞施用至受试对象的各种方式是显而易见的。此 类方法可以包括将细胞系统性施用或注射至受试对象的靶位点。可将细胞插入输送装置， 该输送装置有助于通过注释或植入而引入到受试对象中。此类输送装置可以包括用于将细 胞和液体注入接受者对象体内的管，例如导管。在优选实施方式中，所述管额外具有针管， 例如注射器，通过该针管可将本发明的细胞在所需位置引入受试对象体内。可以将细胞制 备为以各种不同形式输送。例如，可以将细胞悬浮于溶液或凝胶中。可以将细胞与药学可接 受载剂或稀释剂混合，其中本发明的细胞在所述药学可接受载剂或稀释剂中保持存活。药 学可接受载剂或稀释剂包括盐水、水性缓冲溶液、溶剂和/或分散介质。此类载剂和稀释剂 的应用是本领域中所公知的。所述溶液优选是无菌和液态的溶液，且往往是等渗溶液。优 选地，所述溶液在制造和储存的条件下是稳定的，并且可通过使用例如对羟基苯甲酸酯、苯 酚、抗坏血酸和硫柳汞等而抵抗如细菌和真菌等微生物的污染作用，从而得到保存。
[0074] MSC的施用模式包括但不限于系统性静脉内或动脉内注射、直接注射至作用和移 植的预期位点处的组织。制备物可以通过任何方便的途径（例如，注输或弹丸注射）施用， 并且能与其它生物活性剂一同施用。施用优选为系统施用。在某些条件下，可能有利的是 使用靠近或最接近预期作用位点的施用位点。不希望受机理束缚，GMSC在施用时将响应于 因炎症或损伤而产生的趋化因子，从而迀移或归巢至所述组织。
[0075] 提供以下实施例以便展示并进一步说明本发明的某些实施方式和方面，且不应被 认为是对其范围的限制。
[0076] 实验方法
[0077] 实验程序
[0078] 动物和抗体。雌性 C57BL/6J(BL6)、B6CgFblnTSK+/+pldnPa/J、 C57BL/6-Tg (TcraTcrb) 1100Mjb/J (OT1TCRTG)、B6Smn. C3-Faslgld/J(BL6gld)、C3MRL-Faslpr/ J(C3H lpr)和 B6. 129S4-Ccl2tmlK()1/J 小鼠购自 Jackson 实验室。gld 和 Ipr 品系分别在 FasL(Faslgld)和Fas(Faslpir)中具有自发突变，而没有其它自发突变。雌性免疫受损小鼠 (Beige nude/nude XIDIII)购自Harlan。所有动物实验均在制度许可用于动物研宄的规 程（USC#10941和11327)下进行。本研宄中所用的抗体在本文中有所描述。
[0079] 人MSC的分离和纯化。hMSC可以通过任何此前公开的方法来进行分离。例如，出 于此目的可以使用 Shi 等，（2003"Perivascular Niche of Postnatal Mesenchymal Stem Cells in Human Bone Marrow and Dental Pulp"J. Bone Miner. Res. ,18(4) ,696-704)的 公开中所披露的间充质干细胞分离方法。本文将该公开的全部内容以其整体并入。在一个 实施方式中，可以使用识别包含hMSC的组织中的抗原的抗体STRO-I来通过免疫选择而分 离 hMSC。
[0080] 小鼠骨髓间充质干细胞（BMMSC)的分离。小鼠 BMMSC分离自股骨和胫骨并保存。
[0081] ⑶Ilb阳性细胞的分离。为了分离⑶Ilb阳性吞噬细胞，分离出小鼠脾细胞并与缀 合有PE的抗CDllb抗体（BD)温育。在冰上温育30分钟后，利用抗PE的磁珠 （Miltenyi Biotech)根据制造商说明分选出⑶Ilb阳性细胞。
[0082] 流式细胞分析。将全外周血用抗⑶45、抗⑶3、抗⑶4和抗⑶8a抗体染色并用 BD FACS?裂解溶液（BD Bioscience)处理以得到单个核细胞（MNC)。通过用⑶3抗体染 色、随后用Annexine-V凋亡检测试剂盒I(BD Pharmingen)来检测凋亡T细胞。对于细 胞的荧光标记，根据制造商说明将BMMSC或T细胞与羧基荧光素二乙酸N-琥珀酰亚氨基 酯（CFSE，SIGMA)温育15分钟或与PKH-26(Invitrogen)温育5分钟。对于Foxp3胞间染 色，在冰上将T细胞用抗⑶4、抗⑶8a和抗⑶25抗体（各1 μ g)染色30分钟。随后，利用 Foxp3染色缓冲剂试剂盒（eBioscience)将细胞用抗Foxp3抗体染色。对于IL17染色，利 用Foxp3染色缓冲剂试剂盒将T细胞用抗⑶4抗体染色、然后用抗IL17抗体染色。所有样 品用 FACSealibmr(BD Bioscience)分析。
[0083] 蛋白印迹分析。使用20 μ g蛋白，并根据标准程序执行SDS-PAGE和蛋白印迹。处 于相同膜上的肌动蛋白充当加载对照。详细程序如本领域中所述。
[0084] 实时聚合酶链式反应（RT-PCR)。使用IOOng总RNA用于cDNA合成 和RT-PCR。基因特异性引物对如下：人FasUGeneBank登录号；NM 000639. 1，正 义：5,-CTCTTGAGCAGTCAGCAACAGG-3,，反义：5,-ATGGCAGCTGGTGAGTCAGG-3' ）；人 Fas (GeneBank 登录号；NM 000043. 4,反义：5' -CAACAACCATGCTGGGCATC-3'，正义：5' -TG ATGTCAGTCACTTGGGCATTAAC-3'）；和人GAPDH (GeneBank 登录号；NM002046. 3，反义： 5' -GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，正义：TGGTGAAGACGCCAGTGGA)。详细程序如本领域中所述。
[0085] T细胞与BMMSC的共培养。将BMMSC(0. 2X IO6)接种在24孔培养板（Corning) 中并温育24小时。将经预先刺激的T细胞直接加载于BMMSC上并共培养2天。在一些实 验中，在共培养物中添加抗Fas配体中和抗体（BD)或者半胱天冬酶3、8或9抑制剂（R&D systems)。如上所述检测凋亡T细胞。
[0086] T细胞迀移检测。对于T细胞迀移检测，使用transwell系统。将PKH26染色的 BMMSC(0. 2X IO6)接种至具有transwell的12孔培养板（Corning)的下层腔室并温育24 小时。将经抗⑶3抗体和抗⑶28抗体预先刺激48小时的T细胞加载至transwell的上层 腔室并共培养48小时，并在荧光显微镜下观察。对绿色标记的细胞数计数并通过5个代表 性图像中的红色标记的MSC数量进行标准化。
[0087] Fas配体的过表达。将慢病毒生产用293T细胞接种至IOcm培养皿（Corning) 中，直至80 %融合。根据制造商规程，将具有适当比例的质粒（FasL基因表达载 体：psPAX:pCMV-VSV_G(均来自 Addgene) = 5:3:2)与 Lipofectamin LTX(Invitrogen)在 opti-MEM(Invitrogen)中混合。将EGFP表达质粒（Addgene)用作对照。在转染后24h和 48h收集上清液，并通过0. 45 μ m过滤器过滤以除去细胞碎片。为进行感染，将含慢病毒的 上清液在4 μ g/ml凝聚胺（SIGMA)的存在下添加至靶细胞培养物中，并在显微镜观察下通 过GFP验证转基因表达。
[0088] Fas和MCP-I的过表达。为产生Fas和MCP-I过表达载体，使用了 pCMV6-AC-GFP TrueORF 哺乳动物表达载体系统（Origene)。从购自 Open Biosystems(Huntsville)的 C57BL/6J种系小鼠产生Fas和MCP-IcDNA克隆体，并用Sgf I和Mlu I限制酶切位点通过 PCR扩增。利用Zero Bluntli TOPCT PCR克隆试剂盒（Invitrogene)将PCR产物直接亚克 隆至pCR-Blunt II-T 0 F 0载体。在测序后，将具有Sgfl/Mlul位点的Fas和MCP-IcDNA 亚克隆至PCMV6-AC-GFP表达载体。所有构建体在转染至细胞前通过测序进行验证。在构 建后，根据制造商说明利用 LIPOFECTAMINE PLUS 试剂（LIFE TECHNOLOGIES)将 IprBMMSC 用cDNA转染48小时。
[0089] Fas和FasL的抑制。根据制造商说明利用siRNA转染将BMMSC中Fas和FasL的 表达水平敲减。使用缀合有荧光蛋白的对照siRNA作为对照，并作为评估转染效率的方法。 所有siRNA产品均购自Santa Cruz。
[0090] 急性结肠炎小鼠中的同种异体BMMSC移植。通过经饮用水施用3% (w/v)葡聚糖 硫酸钠（DSS，分子量36000至50000Da;MP Biochemicals)来诱导急性结肠炎，随意饲养10 天（Zhang 等，2010)。在饲以 DSS 水后第 3 天将第一代 BMMSC、gldBMMSC 或 IprBMMSC (I X IO6 细胞）静脉内注输给疾病模型小鼠 （η = 6)。在对照组中，小鼠接受PBS(n = 6)。在饲以 DSS水后第10天，收集所有小鼠并进行分析。如此前所述（Alex等，2009)，评估诱导的结肠 炎。
[0091] 系统性硬化症（SS)小鼠中的同种异体BMMSC移植。将第一代的BMMSC、gldBMMSC 或IprBMMSCd X IO6细胞）静脉内注输给8周龄的SS小鼠 （η = 6)。在对照组中，SS小鼠 接受PBS(n = 5)。在12周龄时将所有小鼠处死以进行进一步分析。利用Bio-Rad蛋白检 测（Bio-Rad)测定尿中的蛋白浓度。
[0092] 系统性硬化症（SS)患者中的同种异体MSC移植。依照此前的报道（Liang等， 2009)将来自脐带的MSC分选并扩增。将扩增的MSC静脉内注输给SS接受者（IX IO6/ kg体重）。遵循目前的优良临床试验规范标准并根据1989年赫尔辛基声明所阐明的 原则下进行试验。本规程为中国南京医科大学钟楼医院（Drum Tower Hospital of Nanjing, University Medical School, China)的IRB所许可。从每位患者处获得了知情同 意书。
[0093] 统计分析。使用Student t检验来分析统计差异。小于0. 05的p值认为显著。
[0094] 抗体。抗-小鼠 CD4-PerCP、CD8-FITC、CD25-APC、CDllb-PE、CD34-FITC、 CD45-APC、CD73-PE、CD90. 2-PE、CD105-PE、CD117-PE、Sca-1-PE、CD3s、CD284jlACD73-PE、 CD90-PE、CD105-PE、CD146-PE、CD34-PE 和 CD45-PE 的抗体购自 BD Bioscience。抗小鼠 CDS-APC、Foxp3-PE、IL17-PE、抗人 CD3-APC、CD4-APC、CD25-APC 和 Foxp3-PE 的抗体购自 eBioscience。抗小鼠 IgG、Fas 和 Fas 配体的抗体购自 Santa Cruz Biosciences。MCP-1 抗体购自Cell Signaling。抗大鼠 IgG-罗丹明抗体购自Southern Biotech。抗大鼠 IgG-AlexaFluoro 488抗体购自Invitrogen。
文档序号 :
【 8500371 】
技术研发人员：施松涛,秋山谦太郎,陈至达
技术所有人：南加州大学
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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