用于间充质干细胞诱导的免疫调节的组合物和治疗方法
[0118] 实施例1II
[0119] BMMSC通过募集T细胞介导的疗法需要Fas。
[0120] 为了产生FasL，使本文所用的分离BMMSC也表达Fas(图13A)。为了检验 Fas在基于BMMSC的免疫疗法中是否起作用，发明人将源自C3MRL-FaslpVj小鼠的 FasLv_BMMSC (IprBMMSC)注输给C57BL6小鼠，并发现FasL+lprBMMSC未能在外周血和骨髓 中减少CD3+T细胞数或增加凋亡CD3+T细胞数（图5A-5D)。作为广泛使用的自体免疫疾病 模型，无 FasL gld小鼠和无 Fas Ipr小鼠显示出CD62L-CD44+活化T细胞数的增加和Thl/ Th2及Thl7/Treg比例的提高（数据未示出）。另外，与对照T细胞相比，gld和Ipr T细 胞均显示出对⑶3和⑶28抗体刺激的响应降低（数据未示出）。gld和Ipr BMMSC显示 出相似的集落形成能力、多能分化以及表面分子表达（数据未示出）。另外，发明人还揭示 出，IprBMMSC移植未能在外周血中上调Treg和TGF-β水平和下调Thl7细胞水平（图5E、 5F和S6X)。而且，利用siRNA将Fas敲减的BMMSC显示出与在无 Fas IprBMMSC中所观察 到的相同的效果（图13Y-6EE)。虽然移植的无 Fas IprBMMSC在外周血中于24小时内消 失，但膜联蛋白V/7AAD双阳性BMMSC数量并未显著增加（数据未示出），这暗示了可能有另 一条途径在接受小鼠中辅助清除移植的IprBMMSC。当IprBMMSC被移植至DSS诱导的结肠 炎小鼠时，其未能在体重、疾病活性指数、组织学活性指数方面提供治疗效果，且IprBMMSC 也无法使Treg和Thl7细胞的水平重新平衡（图S6B-6G)。另外，IprBMMSC移植未能治疗 Tsk/+SS小鼠，从而没有显示出对ANA、抗dsDNA抗体IgG和IgM抗体、肌酐、尿蛋白、抓取距 离、Treg或Thl7细胞的水平的挽回（图S6H-6Q)。综上，这些数据表明FasL+lprBMMSC与 FasL^gldBMMSC类似，均无法减轻SS和结肠炎小鼠模型中的免疫病症。
[0121] 接着，发明人研宄了 IprBMMSC未能治疗所述疾病的根本机理。发明人通过蛋白印 迹分析显示出IprBMMSC表达正常FasL水平（图13R)并在共培养系统中诱导⑶3+T凋亡 (图5G)。这被抗FasL中和抗体所阻断（图5G)，从而表明IprBMMSC无法诱导体内T细胞 凋亡并不是由于功能性FasL表达的缺失。因此，发明人假定，Fas表达通过非FasL相关性 机理（例如，调节T细胞的募集）而影响BMMSC免疫调节性质。为了测试这一点，发明人利 用体外transwell共培养系统来显示出：活化的T细胞迀移至BMMSC从而启动细胞-细胞 接触（图5H)。然而，与对照BMMSC相比，IprBMMSC在共培养系统中显示出显著降低的募集 活化T细胞的能力（图5H和51)。然后，使用细胞因子阵列分析确定了 IprBMMSC表达了低 水平的单核细胞趋化蛋白I (MCP-I)，单核细胞趋化蛋白I (MCP-I)是C-C基序趋化因子家族 的成员并且是T细胞趋化细胞因子（Carr等，1994 ;图13S)。令人感兴趣的是，IprBMMSC中 MCP-I的过表达部分地挽回了其募集T细胞的能力（图5H-5J)。IprBMMSC中Fas的过表达 显示出，多种细胞因子的分泌水平得到恢复（图S6S和S6U)，并且完全挽回了其募集T细胞 的能力（图5H、5I、5K)。然而，IprBMMSC中MCP-I的表达水平比对照BMMSC中更高，且Fas 的过表达降低了 IprBMMSC中的MCP-I胞质蛋白水平（图5L)，从而表明Fas调节MCP-I的 分泌而非其表达。接着，检验了细胞上清液中的MCP-I水平，并发现IprBMMSC中的MCP-I水 平明显低于BMMSC中（图5M)。IprBMMSC中MCP-I和Fas的过表达挽回了培养物上清液中 的MCP-I水平（图5M)。接着，利用siRNA敲减方式证实了 Fas调节MCP-I分泌（图13T)。 BMMSC中Fas表达的下调导致MCP-I分泌的减少（图5N)，并且在共培养系统中募集活化T 细胞的能力也相应降低（图50和5P)。
[0122] 为了证实MCP-I有助于基于BMMSC的免疫调节，发明人从MCP-I突变体 B6. 12954-(^12^°1/^小鼠分离出BMMSC并显示出，与对照BMMSC相比，MCP-1+BMMSC在 C57BL6小鼠中减少⑶3+T细胞或增加凋亡⑶3+T细胞方面具有缺陷（图6A和6B)。此 外，在移植后72小时内，MCP-r^BMMSC未能使Treg和TGF- β的水平上调（图6C和6D)。 MCP-rh丽SC的对T细胞凋亡诱导和Treg上调的缺乏与FasL功能并不相关（图6Ε)。 当MCP-r^BMMSC与活化T细胞在transwell培养系统中共培养时，与对照BMMSC相比，向 BMMSC迀移的T细胞数显著减少（图6F)。此外，Fas和MCP-I在体外培养系统中吸引B 细胞、NK细胞和不成熟树突细胞（iDC)方面起着重要作用（图14A-7C)。这些数据表明， MCP-I的分泌调节BMMSC诱导的T细胞迀移（图6G)。而且，发明人还显示，Fas也调节着 其他细胞因子的分泌，例如C-X-C基序趋化因子IO(CXCL-IO)和基质金属蛋白酶的组织抑 制剂（??ΜΡ-1)的分泌（图S6V和6W)。
[0123] 实施例1V
[0124] 同种异体MSC移植（MSCT)诱导了患系统性硬化症（SS)的患者中⑶3+T细胞凋亡 和Treg上调。
[0125] 基于上述实验动物模型结果，发明人进行了评估在用MSCT治疗的SS患者中是否 出现了 T细胞凋亡和Treg上调的实验性临床研宄。年龄范围为44周岁至61周岁（平均 51. 2±7· 8周岁）且患SS持续48至480个月（平均163. 2± 182. 1个月）的5位患者（4 位女性和1位男性，表SI)被招募进行同种异体MSCT，并在指定的时间点收集外周血（图 7A)。同种异体MSC移植在MSCT后6小时诱导了 CD3+T细胞数的显著减少和膜联蛋白V-阳 性凋亡CD3+T细胞数的上调，然而到72小时时，CD3+T细胞数和凋亡率降低至基线水平（图 7B和7C)。此外，在MSCT后6小时还观察到了⑶4+T细胞数的减少（图7D)。重要的是，外 周血中Treg的频率在MSCT后72小时显著上调（图7E)，并伴随TGF-β水平的上升（图 7F)。对改良Rodnan皮肤评分（MRSS)和健康评估调查问卷（HAQ-DI)的评估表明，MSCT在 随访期为SS患者提供了最佳治疗（图7G和7Η)。此外，在12个月随访期观察到SS患者中 的ANA水平的下降（图7J)。令人感兴趣的是，与源自健康供体的MSC(MSC)相比，源自SS 患者的MSC(SSMSC)显示出FasL和Fas表达的缺乏（图7Κ和7Μ)。由于FasL和Fas表达 的降低，SSMSC显示出诱导T细胞凋亡（图7L)和分泌MCP-I (图7Ν)的能力下降。另外， 还发现MSCT显著了改善了患者的皮肤溃疡（图71)。这些早期临床数据证明了 MSCT在SS 患者中的安全性和效力以及同种异体MSCT后的疾病活性的改善。然而，MSCT对SS患者的 长期效果需进一步研宄。
[0126] 表1. SS患者信息
[0127]
【主权项】
1. 一种治疗有需要的受试对象中的系统性硬化症的方法，所述方法包括对所述受试对 象施用治疗有效量的间充质干细胞（MSC)，其中，所述MSC:a)表达Fas，b)表达FasI^Pc) 分泌MCP-I。
2. 如权利要求1所述的方法，其中，施用步骤包括施用包含分离纯化的所述MSC群的组 合物。
3. 如权利要求1所述的方法，其中，所述MSC是骨髓MSC(BMMSC)。
4. 如权利要求3所述的方法，其中，所述BMMSC是人BMMSC(hBMMSC)。
5. 如权利要求1所述的方法，其中，所述MSC是同种异体的MSC。
6. 如权利要求1所述的方法，其中，施用IX10 3个细胞/kg体重至IX10 7个细胞/kg体重的所述MSC。
7. 如权利要求1所述的方法，其中，施用IX10 5个细胞/kg体重至IX10 7个细胞/kg体重的所述MSC。
8. 如权利要求1所述的方法，其中，所述MSC通过注输施用。
9. 如权利要求1所述的方法，其中，所述MSC通过移植施用。
10. -种治疗有需要的受试对象中的系统性硬化症的方法，所述方法包括对所述受试 对象施用组合物，所述组合物包含治疗有效量的分离纯化的同种异体hBMMSC群，其中所述 hBMMSC:a)表达Fas，b)表达FasL和c)分泌MCP-I。
11. 如权利要求10所述的方法，其中，施用IX10 3个细胞/kg体重至IX10 7个细胞/ kg体重的所述hBMMSC。
12. 如权利要求10所述的方法，其中，施用IX10 5个细胞/kg体重至IX10 7个细胞/ kg体重的所述hBMMSC。
13. 如权利要求10所述的方法，其中，所述组合物通过注输施用。
14. 如权利要求10所述的方法，其中，所述组合物通过移植施用。
15. -种治疗有需要的受试对象中的结肠炎的方法，所述方法包括对所述受试对象施 用治疗有效量的间充质干细胞（MSC)，其中所述MSC:a)表达Fas，b)表达FasL和c)分泌 MCP-I0
16. 如权利要求15所述的方法，其中，施用步骤包括施用包含分离纯化的所述MSC群的 组合物。
17. 如权利要求15所述的方法，其中，所述MSC是BMMSC。
18. 如权利要求17所述的方法，其中，所述BMMSC是人类BMMSC。
19. 如权利要求18所述的方法，其中，施用IX10 3个细胞/kg体重至IX10 7个细胞/ kg体重的所述hBMMSC。
20. 如权利要求18所述的方法，其中，施用IX10 5个细胞/kg体重至IX10 7个细胞/ kg体重的所述hBMMSC。
21. 如权利要求17所述的方法，其中，所述BMMSC通过注输施用。
22. 如权利要求17所述的方法，其中，所述BMMSC通过移植施用。
23. -种分离纯化的MSC群，其中，所述MSC:a)表达Fas，b)表达FasL和c)分泌MCP-1。
24. 如权利要求23所述的分离纯化的MSC群，其中，所述MSC是骨髓间充质干细胞 (BMMSC)〇
25. 如权利要求24所述的分离纯化的MSC群，其中，所述BMMSC是人类BMMSC。
26. 如权利要求23所述的分离纯化的MSC群，其中，所述MSC已用载体转染，所述载体 包含与启动子可操作性连接的人FasL基因，且其中FasL由所述载体过表达。
27. 如权利要求26所述的分离纯化的MSC群，其中，所述MSC已用载体转染，所述载体 包含与启动子可操作性连接的人Fas基因，且其中Fas由所述载体过表达。
28. -种上调人的调节性T细胞（Treg)的方法，所述方法包括对所述人施用有效量的 hBMMSC，其中，所述hBMMSC:a)表达Fas，b)表达FasL和c)分泌MCP-I。
29. 如权利要求28所述的方法，其中，所述人罹患系统性硬化症。
30. 如权利要求28所述的方法，其中，所述人罹患结肠炎。
31. 如权利要求28所述的方法，其中，所述hBMMSC是同种异体hBMMSC。
32. 如权利要求28所述的方法，其中，施用IX10 3个细胞/kg体重至IX10 7个细胞/ kg体重的所述hBMMSC。
33. 如权利要求28所述的方法，其中，施用IX10 5个细胞/kg体重至IX10 7个细胞/ kg体重的所述hBMMSC。
34. 如权利要求28所述的方法，其中，所述hBMMSC通过注输施用。
35. 如权利要求28所述的方法，其中，所述hBMMSC通过移植施用。
36. 如权利要求28所述的方法，其中，所述施用导致CD4+T细胞数量的减少以及凋亡 CD4+T细胞数量的相应的增加。
37. 如权利要求36所述的方法，其中，所述施用导致CD8+T细胞数量的减少以及凋亡 CD8+T细胞数量的相应的增加。
38. 如权利要求37所述的方法，其中，所述施用导致CD3+T细胞数量的减少以及凋亡 CD3+T细胞数量的相应的增加。
39. 如权利要求38所述的方法，其中，所述hBMMSC通过注输施用。
40. 如权利要求38所述的方法，其中，所述hBMMSC通过移植施用。
41. 如权利要求38所述的方法，其中，在施用后约72小时外周血中的调节性T细胞水 平显著上调。
42. 如权利要求38所述的方法，其中，所述hBMMSC是同种异体的hBMMSC。
43. -种在有需要的受试对象中产生对免疫疗法的免疫耐受性的方法，所述方法包括 对所述受试对象施用有效量的hBMMSC，其中，所述hBMMSC:a)表达Fas，b)表达FasL和c) 分泌MCP-1，并且其中所述施用导致所述受试对象的外周血中的调节性T细胞水平的上调。
44. 一种药物组合物，所述药物组合物包含分散在药学可接受载剂中的权利要求23所 述的分离纯化的MSC群。
【专利摘要】本发明公开了表达Fas和FasL并分泌MCP-1的间充质干细胞(MSC)、包括源自骨髓的MSC(BMMSC)。还公开了通过施用MSC、包括BMMSC来上调受试对象中调节性T细胞的方法。还公开了通过施用MSC、包括BMMSC来治疗受试对象中的系统性硬化症或结肠炎的方法。
【IPC分类】A61P37-06, A61K35-28, C12N5-071, A61P29-00, A61P17-00
【公开号】CN104822384
【申请号】CN201380027628
【发明人】施松涛, 秋山谦太郎, 陈至达
【申请人】南加州大学
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2013年3月29日
【公告号】EP2833896A2, US20150104428, WO2013149211A2, WO2013149211A3
文档序号 :
【 8500371 】
技术研发人员：施松涛,秋山谦太郎,陈至达
技术所有人：南加州大学
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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