用于间充质干细胞诱导的免疫调节的组合物和治疗方法
[0095] 小鼠骨髓间充质干细胞（BMMSC)的分离。将来自股骨和胫骨的骨髓来源的全部 有核细胞（ANC)的单一悬浮体以IOOmrn培养皿（Corning)中15X10 6的密度于37°C和 5% 0)2的条件下接种。48小时后移除未粘附细胞，并将附着的细胞在补充有20%胎牛血 清（FBS，Equitech-Bio，Inc.)、2mM L-谷氨酰胺、55μΜ 2-疏基乙醇、100U/ml 青霉素和 100 μ g/ml 链霉素（Invitrogen)的 Alpha 最低基本培养基（a_MEM, Invitrogen)中维持 16 天。将形成集落的附着细胞传代一次以用于进一步的实验。流式细胞分析显示，0.95%的 BMMSC对于⑶34+CD117+抗体染色呈阳性。
[0096] 小鼠 B细胞、NK细胞、不成熟树突细胞（iDC)/巨噬细胞的分离。在利用ACK裂解 缓冲液除去红细胞后，将小鼠脾细胞与抗小鼠⑶19-PE、⑶49b-FITC和⑶Ilc-FITC抗体温 育30分钟，随后根据制造商说明用抗PE或抗FITC微珠 （Milteny biotech)进行磁性分离。
[0097] T细胞培养。完全培养基含Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，Lonza)以及10% 热失活FBS、50yM 2-巯基乙醇、IOmM HEPESUmM丙酮酸钠（Sigma)、l%非必需氨基酸 (Cambrex)、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素。
[0098] 免疫荧光显微术。将巨噬细胞或BMMSC在四孔室载玻片（Nunc) (2X IO3/ 孔）上温育，然后用4%多聚甲醛固定。将室玻片与包含⑶Ilb抗体（1:400，BD)、 抗 CD90. 2 (1:400, BD)和抗 FasL (1:200, SantaCruz)的一抗在 4 °C 温育过夜，随后用 缀合有罗丹明的二抗（1:400, Southern biotech)或缀合有AlexaFluoro 488的二 抗（1:200, Invitrogen)在室温处理30分钟。最后用Vectashield封固剂（Vector Laboratories)将载玻片封固。
[0099] 蛋白印迹分析。利用M-PER哺乳动物蛋白提取试剂（Thermo)提取总蛋白。利用 NE-PER核和胞质提取试剂（Thermo)获得核蛋白。将蛋白涂敷并在4%~12% NuPAGE胶 (Invitrogen)上分离，并且转移至ImmobiIonTM-P膜（Millipore)上。将膜用5 %脱脂奶 和0. 1 % Tween 20封闭1小时，随后与所述一抗在4°C温育过夜。使用缀合有辣根过氧化物 酶的 IgG(Santa Cruz Biosciences ;1:10,000)来处理膜 1 小时，随后用SuperSignal? West Pico化学发光底物（Thermo)增强。在BIOMAX MR胶片（Kodak)上检测条带。此外还将每 个膜用剥离缓冲液（Thermo)进行剥离并用抗P-肌动蛋白抗体重新检测以对加载的蛋白进 行定量。
[0100] 实时聚合酶链式反应（RT-PCR)。根据制造商规程用SV总RNA分离试剂 盒（Promega)从培养物中分离出总RNA，并用DNA酶I消化。利用Superscript III (Invitrogen)从IOOng总RNA合成cDNA。利用基因特异性引物和Cybergreen supermix(BioRad)进行PCR。在3个独立样品中重复进行RT-PCR。基因特异性引物对 如下：人 FasUGeneBank 登录号；NM 000639. 1，正义：5' -CTCTTGAGCAGTCAGCAACAGG-3'， 反义：5'-ATGGCAGCTGGTGAGTCAGG-3'） ；人 Fas (GeneBank 登录号；NM 000043.4，反 义：5'-CAACAACCATGCTGGGCATC-3' ，正义：5'-TGATGTCAGTCACTTGGGCATTAAC-3'）和 人 GAPDH(GeneBank 登录号；NM002046. 3，反义：5' -GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，正义： TGGTGAAGACGCCAGTGGA)〇
[0101] 酶联免疫吸附检测（ELISA)。利用含有肝素的微红细胞压积管（VWR)从小鼠收集 外周血样品，并在1000 g离心10分钟以取得血清样品。利用商购试剂盒根据制造商说明来 测定 TGFp (eBioscience)、小鼠 ANA、抗 dsDNA IgG 和抗 dsDNA IgM (Alpha Diagnosis)、人 ANA(EUR0IMMUN)、小鼠 MCP-I、人MCP-I (eBioscience)和肌酐（R&D Systems)水平。将每组 结果平均。在平均值间计算组内差异。
[0102] 吞噬细胞的耗竭。为抑制吞噬细胞，将氯膦酸盐-脂质体（200nl/小鼠 ；Encapsula Nano-Science，LLC)经腹膜内注射至小鼠，使用PBS-脂质体作为对照。
[0103] Treg的耗竭。为抑制DSS诱导的实验性结肠炎小鼠中的Treg分化，在DDS诱导3 天后经腹膜内施用抗⑶25抗体（250~g/小鼠，biolegend)。
[0104] 细胞因子阵列分析。根据制造商说明利用小鼠细胞因子阵列组A阵列试剂盒（R&D Systems)分析来自BMMSC或IprBMMSC的培养物上清液。将结果扫描并利用Image J软件 分析以计算印迹强度。细胞因子阵列在2个独立样品中重复。
[0105] 免疫组织化学染色和TUNEL染色。为检测⑶3,收集BMMSC注射后24小时的股骨 并用于石蜡包埋切片。对于共培养的样品，移走培养物上清液并在4°C通过1%多聚甲醛固 定过夜。将样品用与二抗匹配的血清封闭、与⑶3特异性抗体（eBioscience, 1:400)于室温 温育30分钟并根据制造商说明用VECTASTAIN Elite ABC试剂盒（UNIVERSAL)和ImmPACT VIP过氧化物酶底物试剂盒（VECTOR)进行染色。对于TUNEL染色，根据制造商说明使用凋 亡检测试剂盒（Millipore)，随后进行TRAP染色和用H&E进行复染色。进行3次独立实验。
[0106] 实施例1
[0107] BMMSC中的Fas配体（FasL)诱导T细胞凋亡。
[0108] 将来自 C57BL6 小鼠和 FasL 突变 B6Smn. C3-Faslgld/J 的小鼠（gldBMMSC)的 BMMSC 以及FasL转染的gldBMMSC(FasL+gldBMMSC)注射至正常C57BL6小鼠（图1A)。与正常 BMMSC类似，无 FasL的gldBMMSC表达了间充质干细胞标记物并具有多能分化能力（数据未 示出）。在BMMSC移植后0、1. 5小时、6小时、24小时和72小时收集外周血和骨髓样品以进 行后续分析（图1A)。同种异体BMMSC注输在外周血和骨髓中减少了 CD3+T细胞数并增加 了凋亡⑶3+T细胞数，其从1. 5小时开始，在6小时时达到峰值，并持续直至移植后72小时 (图IB至图1E)。为了比较同系和同种异体BMMSC，发明人发现源自同窝仔畜的BMMSC与同 种异体BMMSC在诱导T细胞凋亡方面相同（图S2A-2G)。同时，FasLfgldBMMSC的注输未 能在外周血和骨髓中减少⑶3+T细胞数或增加凋亡⑶3+T细胞数（图1B-1E)。然而，通过 慢病毒转染的gldBMMSC中FasL的过表达（图8N)挽回了 BMMSC在外周血、骨髓、脾脏和淋 巴结中同时减少⑶3+T细胞数和提高凋亡⑶3+T细胞数的能力（图1B-1E ;S1P-1S)。BMMSC 注输还导致外周血中CD4+和CD8 +T细胞数的减少以及凋亡CD4+和CD8 +T细胞数的相应的增 加（图SlE和1F)。令人感兴趣的是，BMMSC移植在OTl TCR TG小鼠中诱导了 CD4+细胞凋 亡和Treg上调。然而，⑶8+T细胞（其与OVA-MHC I类抗原反应）百分比在BMMSC移植后 没有变化，从而表明移植的BMMSC需要被识别为抗原以便启动对CD8+T细胞凋亡的诱导（图 S1T-1AA)。TUNEL染色证实，BMMSC注输增加了骨髓中的凋亡T细胞数（图1F)。接着，发明 人验证了 BMMSC诱导的T细胞死亡是由凋亡所致，所述凋亡基于通过中和性FasL抗体和半 胱天冬酶3、8和9抑制剂体外阻断BMMSC诱导的⑶3+T细胞凋亡（图1G-1I)。FasL中和抗 体注射能够部分地阻断外周血和骨髓中的BMMSC诱导的⑶3+T细胞凋亡、Treg上调和Thl7 细胞下调（图8G-M)。这些数据表明，BMMSC能够通过FasL/Fas信号传导途径来诱导T细胞 凋亡（图1J)。另外，BMMSC抑制能够在C57BL6小鼠中诱导瞬时⑶19+B细胞和⑶49b+NK细 胞，但不能诱导CDllc+F4/80 +巨噬细胞/不成熟树突细胞凋亡（数据未示出）。虽然BMMSC 未能在共培养系统中诱导天然T细胞凋亡（数据未示出），但它们能够在体外诱导活化的T 细胞凋亡（图IG和II)。
[0109] 为了证实FasL在BMMSC介导的体内T细胞凋亡中的作用，使用siRNA敲减了 BMMSC中的FasL表达（图10A)并将FasL敲减的BMMSC注输给C57BL6小鼠。FasL敲减的 BMMSC(FasL siRNA BMMSC)的注输未能在外周血和骨髓中减少⑶3+T细胞数或诱导⑶3+T细 胞凋亡（图2A-2D)。而且，FasL敲减的BMMSC的注输未能在外周血中增加 CD4+CD25+Foxp3+ 调节T细胞（Treg)的水平（图2E)。本研宄证实，BMMSC诱导的T细胞凋亡和Treg上调 需要FasL。令人感兴趣的是，在初始BMMSC移植后6小时，进行对C57BL6小鼠的第二次 BMMSC移植，并发现与单次注射组相比，二次BMMSC移植没能进一步减少⑶3+T细胞数或上 调Treg(数据未示出）。
[0110] 由于凋亡T细胞触发通过巨噬细胞的TGF-β生产并上调Treg，这导致体内的免 疫耐受（Perruche等，2008)，发明人检验了 BMMSC诱导的T细胞凋亡是否也能促进Treg的 上调。发现小鼠和人BMMSC的系统注输的确在移植后24小时和72小时提高了外周血中的 Treg水平（图2F和S2H-2M)，并且在外周血中提高了 TGF-β水平并降低了 T辅助17 (Th 17) 细胞水平（图2G和S10)。BMMSC与泛T细胞的共移植导致在移植后1. 5小时和5小时显著 的T细胞凋亡。然而，BMMSC和Treg的共移植未能显著影响Treg的水平，这表明BMMSC移 植可能不会影响Treg的存活（数据未示出）。另外，发明人发现源自移植了 BMMSC的小鼠 和对照小鼠的Treg在凋亡诱导下显示出相同的凋亡速率（数据未示出）。FasL+gldBMMSC 注输未能使Treg或TGF- β的水平上调（图2F和2G)，从而表明FasL介导的T细胞凋亡在 Treg上调中起着关键作用。事实上，FasL+gldBMMSC中FasL的过表达在移植后24小时挽 回了 BMMSC诱导的Treg上调和TGF- β生产（图2F和2G)。
[0111] 为检验BMMSC注输在外周血中导致TGF-β上调的机理，发明人使用荧光分析来证 实巨噬细胞在体内吞噬了凋亡的T细胞（Perruche等，2008 ;图2Η)。随后，本发明人测定 了脾细胞中的⑶Ilb+巨噬细胞数并发现在BMMSC注输组中的数量显著增加（图21)。相比 之下，采用巨噬细胞抑制剂氯膦酸盐脂质体的处理显著减少了脾细胞中的CDllb +巨噬细胞 数（图21)并阻断了 BMMSC注输所诱导的TGF-β和Treg的上调（图2J和2Κ)。然而，注 射TGF- β未能在C57BL6小鼠中诱导T细胞凋亡或使Treg上调（数据未示出），从而表明 升高的TGF-β水平并非促进Treg的唯一体内因素。这些数据表明，由BMMSC注输所诱导 T细胞凋亡使巨噬细胞活化而生产TGF- β，从而导致Treg上调（图2L)。
[0112] 接着，发明人对注输的BMMSC的凋亡是否也会影响Treg上调提出了疑问。将羧基 荧光素二乙酸N-琥珀酰亚氨基酯（CFSE)标记的BMMSC、gldBMMSC和FasL敲减的BMMSC注 输给C57BL6小鼠。注输后1. 5小时，所有CFSE+细胞都被检测到且在外周血和骨髓中达到 峰值，其后细胞数逐渐下降，在注输后24小时变得不可被检测（图S3C和3D)。相比之下， CFSE+凋亡细胞在注输后6小时在外周血和骨髓中达到峰值并在注输后24小时变得不可 被检测（图S3E和3F)。还通过免疫荧光分析观察了移植的BMMSC的凋亡（图10B)。虽然 观察到注输的FasL缺乏性BMMSC的凋亡，但在外周血中不存在TGF- β或Treg的上调（图 2E、2F和2G)。这些数据表明，Treg上调需要T细胞而非BMMSC的凋亡（图2L)。
[0113] 实施例1I
[0114] 紧肤（Tsk/+)系统性硬化症和诱导型实验性结肠炎小鼠中的基于BMMSC的免疫疗 法需要FasL。
[0115] 为了进一步研宄BMMSC移植的治疗机理，将两种小鼠模型（遗传性紧肤（Tsk/+)系 统性硬化症和诱导型实验性结肠炎）用来评估BMMSC移植的治疗效果。将同种异体的正常 BMMSC或gldBMMSC (I X IO6)系统性植入8周龄的Tsk/+系统性硬化症小鼠（Green等，1976)， 且在12周龄时收集样品以进行进一步评估（图3A)。在移植后6至72小时，BMMSC移植组 显示出在外周血中CD3+T细胞数的显著减少以及凋亡CD3+T细胞数的相应的增加（图3B和 3C)。另一方面，FasL+gldBMMSC移植未能诱导⑶3+T细胞凋亡（图3B和3C)。
[0116] 在BMMSC移植后4周，Tsk/+小鼠显示出抗核抗体（ANA)、抗双链DNA (dsDNA) IgG和 IgM抗体和血清中肌酐的水平的增加以及尿蛋白水平的增加（图3D-3H)。正常BMMSC而非 FasL+gldBMMSC移植显著减少了 ANA、dsDNA IgG和IgM以及血清肌酐的水平和尿蛋白水平 (图3D-3H)。而且，BMMSC移植挽回了 Tsk/+小鼠中Treg水平的降低和Th 17细胞水平的增 加（图3I、3J和S4B)。如同预期，gldBMMSC移植未能调节Tsk/+小鼠中Treg和Thl7细胞 的水平（图31和3J)。组织学分析还显示，在Tsk/+小鼠中，皮下组织（HD)厚度显著增加 (图3K)。在BMMSC移植后，HD厚度减小至与对照组相等的水平（C57BL6)，而gldBMMSC未 能减小HD厚度（图3K)。另外，通过抓取距离测定的皮肤紧度在BMMSC移植组中显著改善， 而在gldBMMSC移植组中则没有（图11A)。
[0117] 如前所述（Alex等，2009 ;Zhang等，2010)制造诱导型实验性结肠炎模型。在3% 葡聚糖硫酸钠（DSS)诱导后第3天，将同种异体正常BMMSC或FasL+gldBMMSCaxiO 6)系 统移植至实验性结肠炎小鼠（Zhang等，2010 ;Figure 4A)。正常BMMSC移植在外周血中减 少了⑶3+T细胞数并增加了膜联蛋白V+7AAD+双阳性凋亡⑶3 +T细胞数，这从移植后1. 5小 时开始并持续至72小时（图4B和4C)。然而，就CD3+T细胞数和凋亡CD3+T细胞数而言， gldBMMSC移植组没有显示出与结肠炎组的差异（图4B和4C)。在DSS诱导后5至10天，患 诱导型结肠炎的小鼠的体重与对照C57BL6小
文档序号 :
【 8500371 】
技术研发人员：施松涛,秋山谦太郎,陈至达
技术所有人：南加州大学
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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