用于间充质干细胞诱导的免疫调节的组合物和治疗方法
[0028] 图14. Fas和MCP-I在体外调节BMMSC介导的B细胞、NK细胞和不成熟树突细胞 (iDC)迀移。（A ~C)当 B 细胞、NK 细胞和 iDC 与 BMMSC、Fas~lprBMMSC、利用 siRNA 的 Fas 敲减的BMMSC (Fas siRNA BMMSC)或MCP-1""BMMSC在transwell培养系统中共培养时， BMMSC组中迀移的B细胞（A)、NK细胞⑶和iDC(C)的数量明显更高（#P〈0. 01。条形= l〇〇~m。条形图表示平均值土SD)。
【具体实施方式】
[0029] 缩写：
[0030] MSC :间充质干细胞
[0031] BMMSC :骨髓间充质干细胞；
[0032] BMMSCT :骨髓间充质干细胞移植；
[0033] FasL :Fas 配体；
[0034] hMSC :人间充质干细胞；
[0035] hBMMSC :人骨髓间充质干细胞；
[0036] MCP-I :单核细胞趋化蛋白-1
[0037] SS :系统性硬化症；
[0038] Treg :CD4+CD25+Foxp3+调节性 T 细胞。
[0039] 定义
[0040] 如本文所用，"同种异体（allogenic) "是指具有不同的遗传构造，例如，来自两种 不同物种或者来自相同物种的两个不相关的对象。
[0041] 本发明的方法中所用的组合物的"有效量"是足以执行具体所说明的目的的量。 "有效量"可以根据经验并以与所说明的目的相关的常规方式来确定。
[0042] 如本文所用，"表达"包括将多核苷酸转录至mRNA并翻译为肽、多肽或蛋白的过 程。"表达"可以包括自然表达和过表达。如果多核苷酸源自基因组DNA，若选择了适当的 真核宿主，表达可以包括mRNA的剪切。表达所需的调节元件包括与RNA聚合酶结合的启动 子序列和用于核糖体结合的转录启动序列。例如，细菌表达载体包括启动子（如Iac启动 子）以及用于转录启动的Shine-Dalgamo序列和起始密码子AUG (Sambrook, J.，Fritsh, E. F.和Maniatis, T. Molecular Cloning:A Laboratory Manual.第2版，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.，1989)〇 类似地，真核表达载体包括用于RNA聚合酶II的异源性或同源性启动子、下游聚腺苷酸化 信号、起始密码子AUG以及用于脱开核糖体的终止密码子。此类载体可以商购获得或者通 过本领域公知方法（例如，下文所述的构建载体的一般方法）中所述的序列组装。在优选 实施方式中，通过本领域已知技术所测定，MSC表达Fas的水平比Fas+IprBMMSC细胞展示 出的Fas表达水平更高，并且MSC表达FasL的水平比FasL^gldBMMSC细胞展示出的FasL 表达水平更高。
[0043] 本文所用术语"表达载体"或"载体"是指含有所需编码序列和合适的核酸序列的 重组DNA分子，所述核酸序列是在特定的宿主生物体中表达可操作性连接的所述编码序列 所必需的。在原核细胞中表达必需的核酸序列通常包括启动子、操纵子（可选）和核糖体 结合位点，以及通常还有其它序列。已知真核细胞会利用启动子、增强子以及终止和聚腺苷 酸化信号。
[0044] 本文所用术语"以可操作性组合"、"可操作性顺序"和"可操作性连接"是指核酸 序列的连接方式产生能够指导给定基因的转录和/或所需蛋白分子的合成的核酸分子。该 术语也指可产生功能性蛋白氨基酸序列的连接方式。
[0045] "分离"和"纯化"的MSC群是见于脱离其天然环境且脱离在其天然环境中的其它组 成成分（例如，血液和动物组织）的条件下的MSC群。在其优选形式中，分离纯化的MSC群 针对a)表达Fas、b)表达FasL和c)分泌MCP-I的MSC进行了富集。在优选形式中，分离 纯化的MSC群基本不含非MSC细胞的细胞和动物组织，且更优选基本不含如下的其它MSC : 这些其它MSC a)不表达Fas、b)不表达FasL和c)不分泌MCP-I。优选地，以高度纯化的 形式来提供MSC群，所述高度纯化的形式即大于50%纯度（作为a)表达Fas、b)表达FasL 和c)分泌MCP-I的细胞占细胞群总体的百分比）、大于80 %纯度、大于90 %纯度、大于95 % 纯度且更优选大于99%纯度。本文提供了分离和纯化MSC的方法的非限制性实例。
[0046] 术语"过表达"用来参照mRNA或蛋白的水平来表明来自转基因或人工诱导的细胞 的表达水平高于来自未经改变和/或未经诱导的对照物的表达水平。对于本发明的BMMSC 而言，优选的是FasL的过表达水平比FasL+gldBMMSC所表现出的FasL表达水平高至少5 倍（图8N)。对于本发明的BMMSC而言，优选的是Fas的过表达水平比Fas^lprBMMSC所 表现出的Fas表达水平高至少5倍（图13U)。mRNA水平利用本领域技术人员已知的多种 技术中的任一种进行测量，所述技术包括但不限于RNA印迹分析。在RNA印迹上包括有适 当的对照以便控制从每个所分析的组织中加载的RNA的量（例如，可以利用存在于每个样 品中的28S rRNA(其为以几乎相同的量出现在所有组织中的丰量RNA转录物）的量来作为 对在RNA印迹上观察到的mRNA特异性信号进行归一化或标准化的方式）。对于出现在条 带中的在尺寸上与经正确剪接的转基因 RNA相对应的mRNA的量进行了定量；在对转基因 mRNA表达的定量中，不考虑与转基因探针杂交的其它次要RNA物种。蛋白水平利用任意数 量的本领域技术人员已知的技术来测定，所述技术包括但不限于流式细胞仪分析。如本文 所用，"同系的（syngenic)"是指具有相同或极为相似的基因构造，例如来自宿主或来自家 族亲属。
[0047] 本文所用术语"上调"意味着直接或间接地增加所测定的物质的存在或量。
[0048] 除非另外指明，本文所用的所有术语均具有下文给出的含义，且通常与该术语 对于本发明所属领域的技术人员而所具有的相同含义相一致。对于本领域的定义和术 语，实践人员特别可参照 Alberts 等，（2008)Molecular Biology of the Cell (Fifth Edition (Reference Edition)) Garland Science, Taylor&Francis Group, LLC〇 应该理角军， 本发明不限于所描述的特定方法、规程和试剂，因为这些可以变化。
[0049] 任何类型的分离的间充质干细胞（MSC)均可适用于本发明的目的。这些间充质细 胞可以分离自多种生物体。优选地，MSC分离自鼠类或人类来源。最优选地，MSC分离自人 类来源。MSC可以分离自许多组织类型。例如，MSC可以分离自骨髓、脐带组织和脐带血。 MSC可以分离自存在于生物体的口腔中的组织。例如，可以使用分离自人口腔中存在的组 织的根尖乳头干细胞（apical papilla stem cell，SCAP)、牙周韧带干细胞（periodontal ligament stem cell，F1DLSC)和牙髓干细胞（dental pulp stems cell，DPSC)。这类 人MSC公开于例如Shi等的题为"间充质干细胞介导的功能性牙齿再生"的公开号为 2010/0196854的美国专利申请中，本文通过援引并入其全部内容。在一个实施方式中，人间 充质干细胞（hMSC)可以分离自人骨髓。
[0050] 本发明的一个实施方式涉及一种治疗有需要的受试对象中的系统性硬化症的方 法，所述方法包括对所述受试对象施用治疗有效量的间充质干细胞（MSC)，其中所述MSC : a)表达Fas，b)表达FasL和c)分泌MCP-1。
[0051] 优选地，所述方法包括施用包含分离纯化的所述MSC群的组合物。优选地，所述方 法包括施用作为骨髓MSC(BMMSC)、更优选人BMMSC的MSC。
[0052] 本发明的MSC可以是同系的或同种异体的，且优选为同种异体的。优选地，施用的 所述MSC为I X IO3细胞/kg体重至I X 10 7细胞/kg体重。更优选地，施用的所述MSC为 I X IO5细胞/kg体重至I X 10 7细胞/kg体重。优选地，所述MSC的施用通过注输或通过移 植进行。
[0053] 本发明的另一个实施方式涉及一种治疗有需要的受试对象中的系统性硬化症的 方法，所述方法包括对所述受试对象施用组合物，所述组合物包含治疗有效量的分离纯化 的同种异体hBMMSC群，其中所述hBMMSC :a)表达Fas，b)表达FasL和c)分泌MCP-1。
[0054] 优选地，施用的所述hBMMSC为I X IO3细胞/kg体重至I X 10 7细胞/kg体重。更 优选地，施用的所述hBMMSC为I X IO5细胞/kg体重至I X 10 7细胞/kg体重。优选地，所述 施用通过注输或通过移植进行。
[0055] 本发明的另一个实施方式涉及一种治疗有需要的受试对象中的结肠炎的方法，所 述方法包括对所述受试对象施用治疗有效量的间充质干细胞（MSC)，其中所述MSC :a)表达 Fas，b)表达 FasL 和 c)分泌 MCP-1。
[0056] 优选地，所述方法包括施用包含分离纯化的所述MSC群的组合物。优选的是，所述 MSC是BMMSC，并且更优选所述MSC是人BMMSC。优选地，施用的所述hBMMSC为I X IO3细胞 /kg体重至I X IO7细胞/kg体重。更优选地，施用的所述hBMMSC为I X 10 5细胞/kg体重 至I X IO7细胞/kg体重。优选地，所述BMMSC的施用通过注输或通过移植进行。
[0057] 本发明的另一方面涉及一种分离纯化的MSC群，其中所述MSC :a)表达Fas，b)表 达FasL和c)分泌MCP-I。所述MSC优选为BMMSC，更优选为人BMMSC。
[0058] 本发明的另一方面涉及一种分离纯化的MSC群，其中所述MSC :a)表达Fas，b)表 达FasL和c)分泌MCP-1，所述MSC已用包含与启动子可操作性连接的人FasL基因的载体 转染，且其中FasL从所述载体过表达。本发明的另一方面涉及一种分离纯化的MSC群，其 中所述MSC :a)表达Fas，b)表达FasL和c)分泌MCP-I，所述MSC已用包含与启动子可操 作性连接的人Fas基因的载体转染，且其中Fas从所述载体过表达。本发明的MSC可以用 FasL和/或Fas的基因转染。
[0059] 本发明的另一方面涉及一种上调人的调节性T细胞（Treg)的方法，所述方法包 括对所述人施用有效量的hBMMSC，其中所述hBMMSC :a)表达Fas，b)表达FasL和c)分泌 MCP-1。优选地，所述人罹患系统性硬化症。优选地，所述人罹患结肠炎。
[0060] 优选地，所述上调调节性T细胞（Treg)的方法通过施用同种异体hBMMSC来实施。 优选地，施用的所述hBMMSC为I X IO3细胞/kg体重至I X 10 7细胞/kg体重。更优选地，施 用的所述hBMMSC为I X IO5细胞/kg体重至I X 10 7细胞/kg体重。优选地，所述BMMSC的 施用通过注输或通过移植进行。
[0061] 优选地，根据本发明上调调节性T细胞（Treg)的方法的施用导致⑶4+T细胞数量 的减少以及凋亡CD4+T细胞数量的相应增加。优选地，所述方法导致CD8+T细胞数量的减 少以及凋亡CD8+T细胞数量的相应增加。优选地，所述方法导致CD3+T细胞数量的减少以 及凋亡CD3+T细胞数量的相应增加。优选地，所述方法导致所述T细胞子群中的两种以上 或全部的数量的减少，同时导致所述T细胞子群中的同样两种以上或全部的数量的相应增 加。
[0062] 更优选地，本发明的上调调节性T细胞（Treg)的方法导致外周血中的调节性T细 胞水平在施用后约72小时得到显著上调。
[0063] 本发明的另一个实施方式涉及一种在有需要的受试对象中产生对免疫疗法的免 疫耐受性的方法，所述方法包括施用有效量的hBMMSC，其中所述hBMMSC :a)表达Fas，b)表 达FasL和c)分泌MCP-I，且其中所述施用导致所述受试对象的外周血中的调节性T细胞水 平的上调。
[0064] 本发明的另一个实施方式涉及一种药物组合物，该药物组合物包含分散在药学可 接受载剂中的分离纯化的MSC群，其中所述MSC :a)表达Fas，b)表达FasL和c)分泌MCP-I。
[0065] 本文提供了以下实验证据：MSC诱导的体内活化的经Fas/FasL途径的T细胞凋亡 在诱导免疫耐受性方面起着关键作用，并因此对系统性硬化症和诱导型实验性结肠炎小鼠 提供了新型治疗选择。
[0066] FasL/Fas介导的细胞死亡途径代表了许多细胞类型中的典型凋亡信号传导 (Hohlbaum 等，2000 ;Pluchino 等，2005 ;Andersen 等，2006 ;Zhang 等，2008)。源自骨髓的 MSC(BMMSC)表达FasL并在体外诱导肿瘤细胞凋亡（Mazar等，2009)。然而，尚未知晓的是 BMMSC是否经由Fas/FasL途径诱导T细胞凋亡从而引起免疫耐受性。本发明人将BMMSC 移植至C57BL6小鼠并证明表达FasL的BMMSC而非FasL缺乏性BMMSC诱导了瞬时T细胞 凋亡。此外，发明人还发现在包括外周血、骨髓、脾脏和淋巴结的多种器官中出现了 T细胞 数量的减少。出于T细胞再分布的原因，似乎T细胞数量的改变没有得到实验证据的支持。 由于CD3抗体诱导的T细胞凋亡导致了免疫耐受（Chatenoud等，1994和1997)，因此发明 人在此证实了 BMMSC诱导的T细胞凋亡通过高水平的巨噬细胞释放的TGF- β而使Treg上 调（Kleinclauss 等，2006 ;Perruche 等，2008)。虽然移植的 FasL+gldBMMSC 和 FasL 敲减
文档序号 :
【 8500371 】
技术研发人员：施松涛,秋山谦太郎,陈至达
技术所有人：南加州大学
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
技术研发人员：施松涛,秋山谦太郎,陈至达
技术所有人：南加州大学
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除