用于间充质干细胞诱导的免疫调节的组合物和治疗方法
[0019] 图5. Fas通过调节单核细胞趋化蛋白I (MCP-I)的分泌而在BMMSC介导的⑶3+T 细胞凋亡和Treg上调中起到关键作用。（A~D)在指定时间点，BMMSC移植（BMMSC)诱 导了外周血单个核细胞（PBMNC ;A，B)和骨髓单个核细胞（BMMNC，n = 5 ;C，D)中的⑶3+T 细胞数的减少和膜联蛋白V+7AAD+双阳性凋亡CD3 +T细胞数的增加，然而来自Ipr小鼠的 FasL+BMMSCaprBMMSC，η = 5)未能使外周血（A, Β)和骨髓（C，D)中的CD3+T细胞数减少或 使⑶3+凋亡T细胞数增加。（E，F)在指定的时间点，与BMMSC移植组相比，IprBMMSC移植 未能使C57BL6小鼠中的Treg水平（E)和TGF- β (F)升高。（G) IprBMMSC在BMMSC/T细胞 体外共培养系统中诱导了活化的T细胞凋亡，而这被抗FasL中和抗体（1 μ g/mL)所阻断。 (H~K)在transwell共培养系统中，活化的T细胞（绿色）向BMMSC(红色）迀移（H)。 IprBMMSC显示出诱导活化的T细胞迀移的能力显著降低（I)，而在IprBMMSC中这能通过 MCP-I过表达部分地恢复（J)和通过Fas过表达完全恢复（K)。结果是三次独立实验中的 代表。（L)定量RT-PCR分析显示，就MCP-I表达水平而言，BMMSC和IprBMMSC之间没有显 著差异。然而，IprBMMSC中MCP-I和Fas的过表达使MCP-I的基因表达水平显著升高。（M) 蛋白印迹显示，IprBMMSC比BMMSC表达了更高的细胞质MCP-I水平。IprBMMSC中Fas的过 表达降低了细胞质中的MCP-I表达水平。（N)ELISA分析显示，与BMMSC相比，IprBMMSC的 培养物上清液中MCP-I分泌显著降低。IprBMMSC中MCP-I和Fas的过表达使培养物上清液 中的MCP-I分泌显著增加。（O)ELISA数据表明，与对照siRNA组相比，利用siRNA敲减的 Fas表达导致培养基中的MCP-I水平降低。（P-Q)与对照siRNA组（P)相比，Fas siRNA处 理的BMMSC(Q)显示出在transwell共培养系统中T细胞迀移的减少（*P〈0. 05, #P〈0. 01， ***Ρ〈0· 001。条形图表示平均值土 SD)。
[0020] 图6. MCP-I在T细胞募集中起着重要作用。⑷MCP-r^BMMSC移植显示出外周血 中的CD3+T细胞数的略微减少，但减少水平明显低于BMMSC移植组中的减少水平。（B)在 MCP-r^B^SC移植组中，膜联蛋白V+7AAD+双阳性凋亡⑶3 +T细胞百分比略微增加。（C)移 植后72小时，MCP-r/_BMMSC移植组中的Treg水平略微增加，但显著低于BMMSC移植组。 (D)与0小时相比，移植后72小时时的MCP-1+BMMSC移植组中TGF-β血清水平略微增 加，但增加的水平低于BMMSC移植组。（E/F)当T细胞受CD3和CD28抗体刺激并与BMMSC 或MCP-1+BMMSC在transwell培养系统中共培养时，BMMSC组中的迀移T细胞数显著高于 MCP-r^BMMSC组。（G)显示出BMMSC诱导的免疫疗法的机理的示意图。#P〈0. 01，*#P〈0. 0 =0· 005,条形图表示平均值土 SD)
[0021] 图7.同种异体MSC移植诱导了患系统性硬化症（SS)的患者中的⑶3+T细胞凋亡 和Treg上调。（A)SS患者中的MSC移植的图示。（B)流式细胞分析显示出移植后2至72小 时的CD3+T细胞数的减少。（C)MSC移植后6小时，膜联蛋白V +阳性凋亡CD3 +T细胞百分比显 著增加。（D)流式细胞分析显示出移植后2至72小时的CD4+T细胞数的减少。（E)同种异 体MSC移植后72小时，外周血中Treg水平显著增加。（F)移植后72小时，MSC移植组中的 TGF β血清水平显著增加。（G，H)同种异体MSC移植后，改进的Rodnan皮肤评分（MRSS，G) 和健康评估问卷疾病活性指数（HAQ-DI) (H)显著降低。（I)MSC移植前（pre-MSC)和移植 后6个月（post-MSC)的代表性皮肤溃疡图像。（J)MSC移植后12个月，降低的ANA水平得 到维持。（K)实时PCR分析表明，与来自健康供体的MSC(MSC)相比，SS患者MSC(SSMSC)中 的FasL表达显著减少。（L)与体外正常MSC相比，SSMSC显示出显著降低的诱导T相比凋 亡的能力。（M)通过实时PCR分析可知，SSMSC显示出Fas表达减少。（N) SSMSC中的MCP-I 分泌水平显著低于MSC培养上清液（*P〈0. 05, #P〈0. 01，*林P〈0. 005 ;条形图表示平均值 土 SD)。
[0022] 图8. Fas配体（FasL)在基于BMMSC的免疫疗法中起着重要作用。（A, B)蛋白印迹 分析显示，小鼠 BMMSC(mBMMSC)和人BMMSC(hBMMSC)表达了 FasL。使用CD8+T细胞作为阳性 对照。（C)免疫细胞染色显示，mBMMSC共表达了 FasL(绿色冲栏）和间充质干细胞表面标 记物⑶73 (红色；上行）或⑶90 (红色；下行）（条形=50~m)。（D)蛋白印迹显示，通过抗⑶3 抗体（3jig/mL)和抗⑶28抗体（2jig/mL)处理活化的T细胞比天然T细胞表达更高水平的 Fas。（E) BMMSC移植诱导了外周血中⑶4+和⑶8 +T细胞数的瞬时减少。（F) BMMSC移植后，⑶4+ 和CD8+T细胞中的膜联蛋白V+7AAD+双阳性凋亡细胞百分比均升高（#P〈0. 01，*#P〈0. 005， 相对于CD4+T细胞组中的BMMSC移植后0小时；##P〈0. 01，###P〈0. 005,相对于CD8+T细胞组 中的BMMSC移植后0小时。条形图表示平均值土SD)。（G)C57BL6小鼠中BMMSC和抗Fas 配体中和抗体（FasLnAb)移植的图示。（Η, I)伴随FasLnAb注射的BMMSC移植显示出对外 周血中BMMSC诱导的CD3+T细胞数的减少⑶以及凋亡CD3+T细胞的增加⑴的显著阻断。 (J，K)伴随FasLnAb注射的BMMSC移植未能在骨髓中减少CD3+T细胞数（J)和诱导CD3+T细 胞凋亡（K)。（L)移植后72小时，与BMMSC移植组相比，伴随FasLnAb注射的BMMSC移植在 外周血中显示出更低的Treg水平。（M)伴随FasLnAb注射的BMMSC移植显示出对外周血 中BMMSC所诱导的Thl7细胞减少有明显抑制。（N)流式细胞分析显示，在gldBMMSC中转 染FasL能显著提高FasL的表达水平。（O)移植后6至72小时BMMSC移植显示出Thl7细 胞水平的下调，而gldBMMSC未能减少外周血中的Thl7细胞数。（P，Q)脾脏中BMMSC移植 在移植后1. 5小时和6小时显著减少了 CD3+T细胞水平（P)和诱导了 CD3+T细胞凋亡（Q)。 (R，S)BMMSC移植诱导了淋巴结中CD3+T细胞数的瞬时减少（R)和凋亡CD3+T细胞的增加 ⑶。（T)OTITCRTG小鼠中的BMMSC移植的图示。（U，V)BMMSC移植显示出外周血（U)和骨髓 (V)中⑶4+T细胞凋亡的上调。（W，X) BMMSC移植没有显示出外周血（W)和骨髓（X)中⑶8+T 细胞凋亡的上调。（Y) 0T1TCRTG小鼠中的BMMSC移植显示出在移植后24小时和72小时的 Treg的上调。（Z) 0T1TCRTG小鼠中的BMMSC移植显示出在移植后24小时和72小时外周血 中Thl7细胞水平的减少。（AA)OTITCRTG小鼠中的⑶8+T细胞在BMMSC移植组中没有显示 出变化（*P〈〇. 05, #P〈0. 01，*#P〈0. 005。条形图表示平均值土SD)。
[0023] 图9.同系小鼠 BMMSC和人BMMSC移植的免疫调节性质。（A) C57BL6小鼠中的同系 和同种异体BMMSC移植的图示。（B，C)同系和同种异体BMMSC移植在减少CD3+T细胞数（B) 和诱导CD3+T细胞凋亡（C)方面在外周血中均显示出类似的效果。（D，E)同系和同种异体 BMMSC移植均在骨髓中减少CD3+T细胞数（D)和诱导CD3+T细胞凋亡（E)。（F，G)同系和同种 异体BMMSC移植在外周血中均使Treg水平上调（F)和使Thl7细胞水平下调（G)，而在移植 后24小时和72小时，同种异体BMMSC移植比同系BMMSC移植显示出更为显著的Thl7细胞 减少。（H)流式细胞分析表明，培养物扩增的人BMMSC (hBMMSC)表达了干细胞标记物CD73、 ⑶90、⑶105、⑶146和Strol，但其对造血标记物⑶34和⑶45呈阴性。将同位素 IgG用作 阴性对照。（I)C57BL6小鼠中的人骨髓间充质干细胞（hBMMSC)移植的图示。（J，K)hMSC注 输诱导了 C57BL6小鼠中外周血（J)和骨髓⑷中的CD3+T细胞凋亡。（L，M)hMSC注输诱导 了外周血中Treg的上调（L)和Thl7细胞的下调（M) (*P〈0. 05, #P〈0. 01，*#P〈0. 005。条 形图表示平均值土 SD)。
[0024] 图10.经移植的BMMSC的凋亡。（A)蛋白印迹显示出FasL siRNA的效力。（B) 免疫荧光分析显示出在外周血（上行）和骨髓（下行）中于移植后6小时的膜联蛋白 +/7AAD+双阳性凋亡细胞，包括移植的GFP +BMMSC(白色箭头）和接受细胞（橙色箭头）。条 形=50Vm。（C-F)将羧基荧光蛋白二乙酸N-琥珀酰亚氨基酯（CFSE)标记的对照BMMSC、 Fas!/-gldBMMSC和FasL siRNA BMMSC移植至C57BL6小鼠中。在指定时间点收集外周血和 骨髓样品以用于细胞分析。CFSE阳性的移植BMMSC在外周血（C)和骨髓（D)中于移植后 1. 5小时达到峰值，然后降低，在移植后24小时降低至不可检测的水平。膜联蛋白V+7AAD+ 双阳性凋亡BMMSC的数量在外周血（E)和骨髓（F)中于移植后6小时达到峰值，然后降低， 在移植后24小时降低至不可检测的水平（条形图表示平均值土SD)。
[0025] 图11. BMMSC介导的系统性硬化症（SS)小鼠皮肤表型减轻需要FasL。（A)与对照 C57BL6小鼠相比，系统性硬化症小鼠模型（Tsk/+)显示出紧皮（tight skin)表型。BMMSC 而非FasL+gldBMMSC移植就抓起的皮肤距离（grabbed skin distance)而言显著改善了 皮肤表型。（B) BMMSC移植在移植后2个月维持了如同在对照小鼠中观察到的脾Treg水平 (*P〈0. 05, #P〈0. 01。条形图表示平均值土 SD)。
[0026] 图12. DSS诱导的实验性结肠炎的BMMSC介导的免疫疗法需要Treg。（A)DSS诱导 的结肠炎小鼠中BMMSC移植以及利用抗CD25抗体阻断Treg的图示。（B)结肠炎小鼠（结 肠炎，η = 5)、BMMSC处理的结肠炎小鼠 （η = 6)和BMMSC处理并进行抗⑶25抗体注射的 结肠炎小鼠（BMMSC+antiCD25ab, η-5)在DDS诱导后5至10天显示出体重减少。BMMSC移 植、而不是伴随抗CD25ab注射的BMMSC移植能够在DSS诱导后第10天部分地抑制结肠炎 引起的体重减少。（C)在DSS诱导后5至10天，与C57BL6小鼠相比，结肠炎小鼠中的疾病 活性指数（DAI)显著增加。与结肠炎模型相比，BMMSC移植显著减少了 DAI评分，但仍高 于在C57BL6小鼠中观察到的评分。BMMSC+anti⑶25ab组在所有的观察时间点均未能减少 DAI评分。（D)DSS诱导后第7天，与C57BL6小鼠相比，结肠炎小鼠的Treg水平明显降低。 BMMSC移植组显示出结肠炎小鼠中Treg水平的上调。BMMSC+anti⑶25ab组在所有时间点均 显示出Treg水平的降低。（E)DSS诱导后第7天，与C57BL6小鼠相比，结肠炎小鼠的Thl7 细胞水平明显升高。在DSS诱导后7至10天，BMMSC移植降低了结肠炎小鼠中的Thl7细 胞水平。在DSS诱导后第10天，BMMSC+anti⑶25ab组显示出比结肠炎组更低的Thl7细胞 水平，但仍高于BMMSC组。（F)苏木精和曙红染色显示出结肠炎小鼠的结肠中的炎性细胞浸 润（蓝色箭头）以及上皮层的破坏（黄色三角形）。BMMSC移植组显示出得到缓和的结肠 疾病表型和组织学活性指数，而BMMSC+anti⑶25ab组在DSS诱导后第10天未能减轻疾病 表型（条形=200~m ;*P〈0. 05, #P〈0. 01，*#P〈0. 001。条形图表示平均值土SD)。
[0027] 图13.在诱导的实验性结肠炎和系统性硬化症（SS)中减轻疾病表型需要Fas。（A) 蛋白印迹分析显示出小鼠 BMMSC表达了 Fas。使用⑶8+T细胞作为阳性对照。（B)实验性 结肠炎小鼠中的BMMSC移植的图示。（C) IprBMMSC移植未能抑制结肠炎小鼠中的体重损失。 (D)在IprBMMSC移植组中，结肠炎小鼠中增加的疾病活性指数未得到减少。（E)结肠组织 学分析没有显示出实验性结肠炎小鼠和IprBMMSC移植组之间的显著差异。条形=200nm。 (F) IprBMMSC移植未能使实验性结肠炎小鼠中的Treg水平上调。（G)在IprBMMSC移植组 中，实验性结肠炎小鼠中增加的Thl7水平没有得到减少。（H) Tsk/+小鼠中BMMSC移植的图 示。（I)在IprBMMSC移植组中，SS(Tsk/+)小鼠中增加的ANA水平未得到减少。（J，K)在 IprBMMSC 处理的 Tsk/+小鼠中，抗 dsDNA 的水平未降低（IgG: J, IgM ;K)。（L)在 IprBMMSC 移植组中，Tsk/+小鼠中增加的肌酐水平未得到减少。（M) IprBMMSC未能降低Tsk/ +小鼠中 的尿蛋白水平。（N)在IprBMMSC移植组中，通过Tsk/+小鼠中脊椎弯曲和抓取距离所指示 的紧肤未得到改善。（O)在IprBMMSC移植组中，Tsk/+小鼠中下降的Treg水平未得到上调。 (P) IprBMMSC移植未能降低Tsk/+小鼠中的Thl7水平。（Q) IprBMMSC移植未能减少Tsk/ +小 鼠中的皮下组织厚度。（R)蛋白印迹分析显示，FasL^lprBMMSC表达了与在BMMSC中所观察 到的水平相同的FasL。（S)细胞因子阵列分析显示，BMMSC在培养物表达了比IprBMMSC更 高的上清液中的MCP-I水平。在通过cDNA转染在FasL+lprBMMSC中过表达Fas后（FasL + IprBMMSC)，多种细胞因子/趋化因子
文档序号 :
【 8500371 】
技术研发人员：施松涛,秋山谦太郎,陈至达
技术所有人：南加州大学
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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