用于间充质干细胞诱导的免疫调节的组合物和治疗方法
【专利说明】用于间充质干细胞诱导的免疫调节的组合物和治疗方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求提交于2012年3月30日的第一署名发明人/申请人姓名为Songtao Shi的题为"用于间充质干细胞诱导的免疫调节的组合物和治疗方法"的美国临时专利申请 第61/618636号的权益，通过援引将其全部内容整体并入本文。
[0003] 关于联邦资助的研宄或开发的声明
[0004] 本发明根据R01DE017449、R01DE019932和R01DE019413号合约在国家牙科和颅面 科研宄所（National Institute of Dental and Craniofacial Research)、国家卫生研宄 院（National Institutes of Health)和卫生与公众服务部（Department of Health and Human Services)的政府资助下完成的。政府具有本发明的某些权利。 发明领域
[0005] 本发明涉及用于间充质干细胞诱导的免疫调节的组合物和治疗方法。
【背景技术】
[0006] 包括骨髓在内的各种组织含有用于非造血细胞的干样前体，例如，成骨细胞、 软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞（Owen等，1988, in Cell and Molecular Biology of Vertebrate Hard Tissues, Ciba Foundation Symposium 136,Chichester, UK, 42-60 页； Caplan, 1991，J. Orthop. Res 9:641-650 ;Prockop, 1997, Science 276:71-74)。这些各种 组织的非造血性前体细胞称作间充质干细胞（MSC)。在体内，MSC多种多样且是表达各种 不同的蛋白和表面抗原的组的子群。MSC通过抑制数种主要免疫细胞如树突细胞、T淋巴 细胞和B淋巴细胞以及自然杀伤（NK)细胞的增殖和功能而展现出免疫调节性质（Nauta 和 Fibbe, 2007 ;Uccelli 等，2007, 2008 ;Aggarwal 和 Pittenger, 2005)。这些性质促使研 宄人员去研宄MSC减轻各种各样的免疫病症的机理（Nauta和Fibbe, 2007 ;Bernardo等， 2009)。事实上，基于MSC的疗法已成功应用于各种人类疾病，包括移植物抗宿主病（GvHD)、 系统性红斑狼疮（SLE)、糖尿病、类风湿性关节炎、自身免疫性脑脊髓炎、炎性肠疾病和 多发性硬化（Aggarwal 和 Pittenger, 2005 ;Le Blanc 等，2004 ;Chen 等，2006 ;Polchert 等，2008 ;Sun 等，2009 ;Lee 等，2006 ;Augello 等，2007 ;Parekkadan 等，2008 ;Zappia 等， 2005 ;Gonzalez等，2009 ;Liang等，2009)。MSC的免疫抑制性质与细胞因子诸如白细胞介 素10 (IL10)、一氧化氮（NO)、吲哚胺2, 3-二氧合酶（IDO)、前列腺素（PG) E2和TSG-6的 生成相关（Batten 等，2006 ;Zhang 等，2010 ;Ren 等，2008, Sato 等，2007 ;Meisel 等，2004 ; Aggarwal 和 Pittenger, 2005 ;Choi 等，2011 ;Roddy 等，2011 ;Nemeth 等，2009)。另外，MSC 诱导的免疫耐受性涉及到⑶4+CD25+F〇Xp3+调节性T细胞（Treg)的上调以及促炎性T辅助 17(Thl7)细胞的下调（Sun 等，2009;Gonzalez 等，2009;Park 等，2011)。然而，基于 MSC 的 免疫疗法的详细机理尚未得到完全理解。在本研宄中，发明人显示了 MSC诱导的通过Fas 信号转导的T细胞凋亡是对于小鼠中的SS和实验性结肠炎的MSC介导的治疗性效果所需 的。
[0007] 基于MSC的免疫疗法已被广泛用于临床前动物模型和临床中以试图治愈多种 免疫相关疾病（Kikuiri 等，2010 ;Schurgers 等，2010 ;Park 等，2011 ;Liang 等，2010 和 2011 ;Wang等，2011 ;Zhou等，2008)。已经报道了许多有助于基于MSC的免疫疗法的因素 (Augello 等，2005 ;Aggarwal 和 Pittenger, 2005 ;Selmani 等，2008 ;Nasef 等，2008 ;Ren 等，2010 ;Choi等，2011 ;Roddy等，2011)。然而，决定基于MSC的免疫疗法的效力的详细机 理尚未得到充分理解。据提出，MSC对T细胞增殖的抑制效果是由于对T细胞凋亡的诱导， 这与色氨酸被吲哚胺2, 3-二氧合酶转化为犬尿氨酸有关（Plumas等，2005)。
【发明内容】
[0008] 间充质干细胞（MSC)、优选源自骨髓的间充质干细胞（BMMSC)的系统性注输显示 出对多种自身免疫疾病的治疗性效果，但基于MSC的免疫调节的根本机理尚未得到完全理 解。此处，发明人展示出BMMSC的系统性注输通过Fas配体（FasL)依赖性Fas途径诱导了 瞬时的T细胞凋亡，由此微纤维蛋白-1突变的系统性硬化症（SS)和葡聚糖硫酸酯钠诱导 的实验性结肠炎小鼠中的病变表型得到减轻。另一方面，FasL+BMMSC没有诱导接受体中 的T细胞凋亡，并因此无法减轻SS和结肠炎，而FasL+BMMSC中FasL的过表达挽救了这些 表型。出人预料的是，具有正常FasL表达的Fas+BMMSC也没能对SS和结肠炎小鼠诱导T 细胞凋亡和提供治疗效果。机理性研宄揭示，BMMSC中的受Fas调节的单核细胞趋化蛋白 I (MCP-I)的分泌在将T细胞募集至BMMSC以进行FasL介导的凋亡中起着至关重要的作用。 凋亡T细胞随后触发巨噬细胞产生高水平的转化生长因子β (TGF-β )，后者又导致Treg的 上调并最终导致对于BMMSC介导的免疫疗法的免疫耐受性。这些数据证实了在基于BMMSC 的免疫疗法中BMMSC通过Fas和FasL的偶联效应而与T细胞凋亡相关的此前未被认知的 作用。
[0009] 本发明的一个实施方式涉及以下发现：受Fas调节的单核细胞趋化蛋白I (MCP-I) 在MSC、优选BMMSC中的分泌在将T细胞募集至MSC、优选BMMSC以进行FasL介导的凋亡中 起着至关重要的作用。
[0010] 本发明的一个实施方式涉及以下发现：通过诱导T细胞凋亡的基于MSC、优选 BMMSC的免疫疗法中需要FasL。
[0011] 本发明的一个实施方式涉及以下发现：出人预料地，表达Fas和FasL的MSC、优选 BMMSC比不表达这两种蛋白的MSC、优选BMMSC对于诱导T细胞凋亡和使Treg水平上调而 言更为有效。
[0012] 本发明的一个实施方式涉及以下发现：凋亡的T细胞随后触发巨噬细胞产生高水 平的转化生长因子β (TGF-β)，后者又导致Treg的上调并最终导致对于BMMSC介导的免疫 疗法的免疫耐受性。
[0013] 本发明的一个实施方式涉及以下发现：用表达Fas和FasL并分泌MCP-I的MSC、 优选BMMSC来治疗罹患系统性硬化症的受试对象有效地减轻和/或改善了该疾病的症状。
[0014] 本发明的一个实施方式涉及以下发现：用表达Fas和FasL并分泌MCP-I的MSC、 优选BMMSC来治疗罹患结肠炎的受试对象有效地减轻和/或改善了该疾病的症状。
【附图说明】
[0015] 图I. BMMSC通过Fas配体（FasL)诱导T细胞凋亡。⑷BMMSC移植程序概图。将 1父106个8丽5(：(11 = 5)、卩&81//>1(18丽5(：(11 = 4)或卩&814专染的81(18丽5(：$&81^1(18丽5(：，11 =4)经尾静脉注输于C57BL6小鼠内。在指定时间点将各组处死以进行样品收集。0小 时表示在BMMSC注射后立即将小鼠处死。（B~E)在指定的时间点，BMMSC移植（BMMSC) 诱导了 CD3+T细胞数量的瞬时减少并增加了外周血单个核细胞（PBMNC ;B、C)和骨髓单 核细胞（PBMNC ;D、E)中的膜联蛋白V+7AAD+双阳性凋亡CD3 +T细胞，而来自gld小鼠的 Fas+BMMSCfeldBMMSC)未能减少CD3+T细胞或使提高周血（B、C)和骨髓（D、E)中的CD3+T 细胞凋亡。FasL转染的gldBMMSC移植（FasL+gldBMMSC)部分地挽回了在外周血（B、C) 和骨髓（D、E)中减少⑶3+T细胞数量并诱导⑶3+T细胞凋亡的能力。*P〈0. 05 ;#P〈0. 01 ; ***Ρ〈0· 001，相对于 gldBMMSC ;#Ρ〈0· 05 ;###Ρ〈0· 001，相对于 FasL+gldBMMSC ;$Ρ〈0· 05 ; $$$P〈0. 001相对于gldBMMSC。（F)当BMMSC注输给小鼠后，TUNEL和免疫组织化学染色显示 出，骨髓中的BMMSC注射组比对照组的⑶3阳性T细胞（紫色，黄色箭头）中的TUNEL阳 性凋亡细胞（棕色，白色箭头）的数量更高。（G)当将BMMSC与T细胞共培养时，与IgG抗 体对照组相比，抗FasL中和抗体（1 μ g/mL)明显阻断了 BMMSC诱导的膜联蛋白V+7AAD+双 阳性凋亡T细胞。（H) TUNEL和免疫组织化学染色显示，当⑶3T细胞（紫色，黄色箭头）与 BMMSC在体外共培养时，在CD3T细胞中观察到TUNEL阳性凋亡T细胞（棕色，白色箭头）。 在抗FasL中和抗体（FasL Ab)的存在下，TUNEL阳性细胞百分比显著低于未经处理的对照 组。⑴另外，BMMSC诱导的膜联蛋白V+7AAD+双阳性凋亡T细胞的数量通过半胱天冬酶3、8 和9抑制剂处理而被显著阻断。结果是三次独立实验的代表性结果。（J)表明BMMSC诱导T 细胞凋亡的Schematic图表（*P〈0. 05 ;#P〈0. 01 ;#*P〈0. 001。条形图表示平均值土SD)。
[0016] 图2. BMMSC诱导的T细胞凋亡和CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞（Treg)的上调需要 FasL。（A、B)BMMSC移植（BMMSC，n-5)诱导了外周血中⑶3+T细胞数量的瞬时减少（A)和膜 联蛋白V+7AAD+双阳性凋亡CD3+细胞的升高（B)。FasL敲减的BMMSC(FasL siRNA BMMSC，n =3)的移植未能在外周血中减少CD3+T细胞（A)或增加 CD3+凋亡T细胞的数量（B)。（C，D) BMMSC移植（BMMSC，n = 5)显示出骨髓中的⑶3+T细胞的瞬时减少（C)和膜联蛋白V+7AAD+ 双阳性凋亡CD3+T细胞的增加（D)。FasL敲减的BMMSC (FasL siRNA BMMSC, η = 3)的移植 未能在骨髓中减少CD3+T细胞（C)或增加 CD3+凋亡T细胞（D)。（E)BMMSC而非FasL敲减 的FasL的移植在移植至C57BL6小鼠后24小时和72小时显著地使Treg水平上调。（F)移 植后24小时和72小时，与gldBMMSC移植组相比，BMMSC移植导致Treg的显著上调。FasL 转染的gldBMMSC移植（FasL+gldBMMSC)部分地挽回了 BMMSC诱导的Treg上调。（G)移植 后24小时，BMMSC和FasL+gldBMMSC中的外周血TGF-β水平均显著增加。FasL+gldBMMSC 移植未能上调TGF-β水平。（H)凋亡的泛T细胞在体内被巨噬细胞吞噬。绿色指示T细 胞，而红色指示⑶Ilb+巨噬细胞。条形=50 μ m。（I)与对照组（C57BL6)相比，BMMSC移 植组增加了外周血中的CDllb+细胞数。如流式细胞分析所评估，通过氯膦酸盐-脂质体处 理对巨噬细胞的耗尽显示出在BMMSC移植组中有效减少⑶Ilb +细胞（BMMSC+氯膦酸盐）。 (J)BMMSC移植后外周血中的TGF-β水平显著增加。氯膦酸盐脂质体处理阻断了 BMMSC诱 导的TGF-β上调（BMMSC+氯膦酸盐）。（K)与对照组（C57BL6)相比，BMMSC移植使外周血 中的Treg水平上调。氯膦酸盐脂质体处理抑制了 BMMSC诱导的Treg上调（BMMSC+氯膦酸 盐）。（L)示意图表明，通过Treg上调证明，BMMSC诱导的T细胞凋亡导致免疫耐受。结果 是3次独立实验的代表（*P〈0. 05, #P〈0. 01，*#P〈0. 001。条形图表示平均值土 SD)。
[0017] 图3. BMMSC介导的系统性硬化症（SS)表型的减轻需要FasL。（A)显示出BMMSC 移植如何减轻SS表型的图。（B，C)如流式细胞分析所评估，BMMSC移植（η = 6)显示出SS 小鼠中CD3+T细胞数的显著减少（B)和膜联蛋白V+7AAD+双阳性凋亡CD3 +T细胞数的增加 (C)。然而，FasLfgldBMMSC移植（η = 6)未能减少CD3+T细胞数量⑶或增加凋亡CD3+T 细胞数量（C)。（D~F)与对照C57BL6小鼠相比，Tsk/+SS小鼠显示出抗核抗体（ANA，D) 和抗双链DNA抗体IgG(E)和IgM(F)的水平的升高。BMMSC移植减少了 ANA水平⑶和抗 双链DNA抗体IgG(E)和IgM(F)的水平。相比之下，FasL^gldBMMSC移植未能减少抗核抗 体（ANA，D)水平或抗双链DNA抗体IgG(E)和IgM(F)的水平。（G) Tsk/+小鼠中的血清肌 酐水平显著增加。在BMMSC移植后，肌酐水平显著降低至在C57BL6小鼠中观察到的水平。 然而，gldBMMSC移植未能降低肌酐水平。（H)Tsk/+小鼠中的尿蛋白浓度显著增加 。BMMSC 移植将尿蛋白降至对照水平。gldBMMSC移植未能降低Tsk/+小鼠中的尿蛋白水平。（I)与 C57BL6小鼠相比，Tsk/+小鼠中的Treg水平显著降低。BMMSC移植后，Treg水平显著升高， 而gldBMMSC移植未能增加 Tsk/+小鼠中的Treg水平。（J)与C57BL6小鼠相比，Tsk/ +小 鼠中的⑶4+IL17+Thl7细胞显著增加。在BMMSC移植组中，升高的Thl7水平被显著降低，而 gldBMMSC移植未能降低Tsk/+小鼠中的Thl7水平。（K)与对照小鼠（C57BL6, η = 5)相比， Tsk/+小鼠（Tsk/+，η = 5)中的皮下组织厚度（hyperdermal thickness)显著增加 。BMMSC 而非FasL+gldBMMSC移植减小了皮下组织厚度（*P〈0. 05, **P〈0. 01，***P〈0. 001。条形图 表示平均值土 SD)。
[0018] 图4. FasL在针对葡聚糖硫酸钠（DSS)诱导的实验性结肠炎的BMMSC介导免疫疗 法中起着关键作用。（A)显示在DSS诱导的实验性结肠炎小鼠中移植BMMSC的图。（B，C) 如流式细胞分析所评估，结肠炎小鼠中BMMSC移植（η = 6)显示出在移植后24小时CD3+T 细胞数的显著减少（B)和移植后24至72小时膜联蛋白V+7AAD+双阳性凋亡CD3 +T细胞的增 加（C)。然而，FasL+gldBMMSCOi = 6)未能减少CD3+T细胞数⑶或增加凋亡CD3+T细胞 (C)。（D)在DSS诱导后5至10天，结肠炎小鼠（结肠炎，η = 5)、BMMSC移植组和gldBMMSC 显示出显著的体重减少。在DSS诱导后10天，与结肠炎组和gldBMMSC移植组相比，BMMSC 移植组显示出对体重减少的抑制。（E)在DSS诱导后5至10天，与C5
文档序号 :
【 8500371 】
技术研发人员：施松涛,秋山谦太郎,陈至达
技术所有人：南加州大学
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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