一种甘薯活性物质及其制备方法与应用
[0048] (2)该方法所用到的试剂、材料、仪器设备均是常见规格，生产成本低，且无毒环 保；
[0049] (3)该方法所制得的抗癌活性物质，对结肠癌细胞、乳腺癌细胞等均具有较强的增 殖抑制能力，具有较高的商业应用开发价值。
【附图说明】
[0050] 图1为甘薯抗癌活性物质对HT-29细胞增殖的影响（结晶紫法）。
[0051] 图2为甘薯抗癌活性物质对Bcap-37细胞增殖的影响（结晶紫法）。
【具体实施方式】
[0052] 下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
[0053] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所 用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0054] 结肠癌细胞HT-29、乳腺癌细胞Bcap-37均购自中国医学科学院基础医学研究所。 产品编号分别为 3111C0001CCC000109 和 3131C0001000700009。
[0055] 实施例1 :甘薯粉的制备
[0056] 将新鲜的甘薯1000 g洗净、浙干、切片后，放入托盘中于_40°C冰箱里预冻24h后， 取出放入真空冷冻干燥机，在50Pa真空度，-66 °C下干燥处理48小时后，采用万能粉碎机粉 碎，制得80-100目的甘薯粉。
[0057] 实施例2 :甘薯粉的制备
[0058] 将新鲜的甘薯1500g洗净、浙干、切片后，放入托盘中于_20°C冰箱里预冻36小时， 取出放入真空冷冻干燥机，在IOOPa真空度，-70°C干燥处理48小时后，采用万能粉碎机粉 碎，制得80-100目甘薯粉。
[0059] 实施例3 :甘薯粗提物的制备
[0060] 取实施例1得到的甘薯粉l〇〇g，加入3倍体积（300mL)的氯仿和甲醇混合液（2:1， v/v)，在-4°C条件下浸提24小时，浸提后过滤，收集上清液，残渣加入3倍体积（300mL) 的氯仿和甲醇混合液，在-4°C条件下浸提2小时后，重复提取2次，合并上清液，在温度为 35°C，真空度为0. 09MPa的条件下，以转速为70rpm旋转蒸发去除有机试剂（氯仿和甲醇） 后即得2g甘薯粗提物。
[0061] 实施例4 :甘薯粗提物的制备
[0062] 取实施例2得到的甘薯粉200g，加入2倍体积（400mL)的氯仿和甲醇混合液（3:1， v/v)，在-4°C条件下浸提12小时，浸提后过滤，收集上清液，残渣加入2倍体积（400mL) 的氯仿和甲醇混合液，在-4°C条件下浸提3小时后，重复提取2次，合并上清液，在温度为 40°C，真空度为0.0 SMPa的条件下，以转速为50rpm旋转蒸发去除有机试剂（氯仿和甲醇） 后即得4g甘薯粗提物。
[0063] 实施例5 :甘薯粗提物的制备
[0064] 取实施例1得到的甘薯粉100g，加入5倍体积（500mL)的氯仿和甲醇混合液（I: 1， v/v)，在-4°C条件下浸提36小时，浸提后过滤，收集上清液，残渣加入2倍体积（200mL)的 氯仿和甲醇混合液，在_20°C条件下浸提3小时后，重复提取2次，合并上清液，在温度为 35°C，真空度为0. 06MPa的条件下，以转速为60rpm旋转蒸发去除有机试剂（氯仿和甲醇） 后即得3g甘薯粗提物。
[0065] 实施例6 :甘薯粗提物的初步分离
[0066] 取实施例3得到的甘薯粗提物15g，溶于150mL氯仿和甲醇混合液（2:1，v/v)，得 到甘薯粗提物溶液；然后将该甘薯粗提物溶液加入到硅胶柱（硅胶柱规格为5mg/20mL，填 料为100目的硅胶）中，利用3倍柱体积的氯仿、丙酮依次进行洗脱，收集丙酮洗脱组分，在 温度为35°C，真空度为0. 07MPa的条件下，以转速为70rpm旋转蒸发去除丙酮，得到5g初步 纯化的甘薯粗提物。
[0067] 实施例7 :甘薯粗提物的初步分离
[0068] 取实施例4得到的甘薯粗提物10g，溶于IOOmL氯仿和甲醇混合液（I: I，v/v)中， 得到甘薯粗提物溶液；然后将该甘薯粗提物溶液加入到硅胶柱（硅胶柱规格为3mg/20mL， 填料为100目的硅胶）中，利用5倍柱体积的氯仿、丙酮和依次进行洗脱，收集丙酮洗脱组 分，在温度为35°C，真空度为0. 03MPa的条件下，以转速为60rpm旋转蒸发去除丙酮，得到 3g初步纯化的甘薯粗提物。
[0069] 实施例8 :甘薯粗提物的初步分离
[0070] 取实施例5得到的甘薯粗提物IOg,溶于50mL氯仿和甲醇混合液（3:1，v/v)，中， 得到甘薯粗提物溶液；然后将该甘薯粗提物溶液加入到硅胶柱（硅胶柱规格为4mg/20mL， 填料为100目的硅胶）中，利用4倍柱体积的氯仿、丙酮和依次进行洗脱，收集丙酮洗脱组 分，在温度为40°C，真空度为0. 05MPa的条件下，以转速为50rpm旋转蒸发去除丙酮，得到 3g初步纯化的甘薯粗提物。
[0071] 实施例9 :甘薯抗癌活性物质的制备
[0072] 取实施例6得到的初步纯化的甘薯粗提物10g，溶于IOOmL甲醇中，加入 100gD4020大孔吸附树脂，减压浓缩至干，使所述初步纯化的甘薯粗提物完全吸附于大孔吸 附树脂上，得到样品大孔吸附树脂混合物，将所述样品大孔吸附树脂混合物加于大孔吸附 树脂层析柱（规格（内径X长度）15X400mm)上层，其中空白大孔吸附树脂（即未与样品 混合的大孔吸附树脂）与样品大孔吸附树脂混合物体积比为5:1，分别以5倍柱体积的蒸馏 水、体积分数为40%的乙醇溶液、体积分数为60%的乙醇溶液、体积分数为80%的乙醇溶 液、体积分数为95 %的乙醇溶液依次进行洗脱，采用数显恒流泵控制流速为1.0 mL/min，分 别收集体积分数为60%的乙醇溶液的洗脱组分（记为提取物I )和体积分数为95%的乙 醇溶液的洗脱组分（即为甘薯抗癌活性物质），浓缩除去有机试剂后，-66°C冻干36小时， 分别得到3g提取物I和2g甘薯抗癌活性物质。
[0073] 实施例10 :甘薯抗癌活性物质的制备
[0074] 取实施例7得到的初步纯化的甘薯粗提物5g，溶于50mL甲醇中，加入50g D4020 大孔吸附树脂，减压浓缩至干，使所述初步纯化的甘薯粗提物完全吸附于大孔吸附树脂上， 得到样品大孔吸附树脂混合物，将所述样品大孔吸附树脂混合物加于大孔吸附树脂层析柱 (规格（内径X长度）（20X500mm))上层，其中空白大孔吸附树脂（即未与样品混合的大 孔吸附树脂）与样品大孔吸附树脂混合物体积比为3:1，分别以4倍柱体积的蒸馏水、体积 分数为20 %的乙醇溶液、体积分数为50 %的乙醇溶液、体积分数为70 %的乙醇溶液、体积 分数为90 %的乙醇溶液依次进行洗脱，采用数显恒流泵控制流速为2. OmL/min，收集体积 分数为90%的乙醇溶液的洗脱组分，浓缩除去有机试剂后，-60°C冻干24小时，得到Ig甘 薯抗癌活性物质。
[0075] 实施例11 :甘薯抗癌活性物质的制备
[0076] 取实施例8得到的初步纯化的甘薯粗提物5g，溶于50mL甲醇中，加入80g D4020 大孔吸附树脂，减压浓缩至干，使所述初步纯化的甘薯粗提物完全吸附于大孔吸附树脂上， 得到样品大孔吸附树脂混合物，将所述样品大孔吸附树脂混合物加于大孔吸附树脂层析柱 (规格（内径X长度）（30X500mm))上层，其中空白大孔吸附树脂（即未与样品混合的大 孔吸附树脂）与样品大孔吸附树脂混合物体积比为4:1，以3倍柱体积的蒸馏水、体积分数 为30 %的乙醇溶液、体积分数为50 %的乙醇溶液、体积分数为75 %的乙醇溶液、积分数为 95 %的乙醇溶液依次进行洗脱，采用数显恒流泵控制流速为0. 5mL/min，收集体积分数为 95%的乙醇溶液的洗脱组分，浓缩除去有机试剂后，-70°C冻干24小时，得到Ig甘薯抗癌活 性物质。
[0077] 实施例12 :癌细胞存活率测定
[0078] 为观察甘薯抗癌活性物质对癌细胞的毒性，添加I.OOmg/mL实施例9制备的甘薯 抗癌活性物质的溶液（溶剂为添加千分之一 DMSO的培养基）于培养基中作用48h后，用 PBS (磷酸盐缓冲液，pH7. 4)洗液清洗两次，胰酶消化后，加入一定量的McCoy' s5A培养基 终止消化。取100 U L细胞悬液，加入100 ii L用PBS配制的0. 40%台盼蓝染液，混合后于血 球计数板上分别计算细胞总数和被染蓝的细胞个数，用下列公式计算存活细胞比率：
[0079] 存活细胞比率=[(细胞总数-蓝色细胞数）/细胞总数]X 100%
[0080] 结果如表1所示。
[0081] 表1甘薯抗癌活性物质对结肠癌细胞HT-29和乳腺癌细胞Bcap-37存活率的影响 (% )
[0082]
[0083]
[0084] 表1中，小写字母表示甘薯提取物与空白组之间细胞毒性的差异性。
[0085] 由表1可知：添加1000 U g ? mL 1甘薯抗癌活性物质于培养基中分别作用48h后， 癌细胞HT-29和Bcap-37的存活率与未添加甘薯抗癌活性物质的对照组相比无显著变化（P < 0. 05)。说明在甘薯抗癌活性物质浓度低于1000 ii g ? mL 1及作用时间少于48h时，对上 述两种癌细胞均无毒性。
[0086] 实施例13 :采用MTT法测定所述甘薯提取物I与甘薯抗癌活性物质对癌细胞的增 殖抑制作用比较
[0087] 以每孔5 XIO4个浓度的细胞（结肠癌细胞HT-29或乳腺癌细胞Bcap-37)接种于 96孔板，用培养基调节每孔为200 ii L，在37°C和5%的CO2浓度的恒温培养箱中培养24h。 形成的单层
文档序号 :
【 9359637 】
技术研发人员：木泰华,赵仕婷,张苗,孙红男,陈井旺
技术所有人：中国农业科学院农产品加工研究所
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
技术研发人员：木泰华,赵仕婷,张苗,孙红男,陈井旺
技术所有人：中国农业科学院农产品加工研究所
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除