一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属生物制药领域，涉及血液制品的制备，具体讲是涉及一种从Cohn血浆组 分III中制备人凝血酶原复合物（PCC)的方法。
【背景技术】
[0002] 人凝血酶原复合物（PCC)是一种供静脉输注、促进血液凝固的止血制剂。PCC制品 中包括凝血因子II、VII、IX、X四种凝血因子，是四种凝血因子的混合物。PCC的四种因子 均属糖蛋白，分子中均含有特殊的氨基酸残基-γ羧基谷氨酸（Gla)，Gla是可以与钙离子 结合的氨基酸，它的存在使PCC具有与金属离子结合的性质。PCC与钙离子结合后会发生构 象改变，从而显露出与磷脂膜结合的特性，并进而参与血液凝固过程。
[0003] PCC包括的四种因子都是丝氨酸蛋白酶(原)，它们的催化区在结构和氨基酸顺序 上与糜蛋白和胰蛋白酶同源。这些因子有相似的理化性质，具有相似的分子量、等电点、电 泳迀移率。在临床上，PCC被广泛用于治疗乙型血友病和由肝疾患、维生素 K缺乏而继发的 凝血因子II、VII、IX、X低下所造成的出血，以及具有VIII因子抗体的甲型血友病的出血， 疗效确切。随着我国肝炎发病率的增加，PCC制剂被大量应用于临床肝脏出血的患者，需求 量逐年增加。
[0004] 现有的PCC制备方法，按原料来源分为两种，一种是直接从去冷胶血浆中用凝胶 吸附，一种是从预处理后的组分III中凝胶吸附；其中，前者大都采用经典的批式吸附法， 即，将溶胀的凝胶按一定比例加入去冷胶血浆中去，一边搅拌一边吸附，吸附结束后对血浆 进行过滤，收集吸附了 PCC的凝胶，进行后续处理；该方法不可避免的会有部分碎胶残留在 血浆中，对后续的蛋白分离产生不可预知的影响，另外，该工艺生产的PCC，其所含的凝血 因子VII明显偏少，一般只有凝血因子IX的四分之一至三分之一。后一种方法所用的组分 III沉淀，目前尚未被利用，属于废料，从此沉淀中分离制备PCC，则是变废为宝，充分利用 血浆资源，而且不存在污染血浆的问题，在整个血制品的生产工艺安排上，有独特的优势， 另外该法生产的PCC，四种因子的含量几乎相同，凝血因子VII甚至会高于凝血因子IX。 本发明开发了一种从血浆组分III中制备人凝血酶原复合物（PCC)的新工艺，该方法 用高效强阴离子交换填料连续柱层析，代替传统的批处理凝胶吸附，大大减少了操作的劳 动强度，并避免了批处理方法产生的交叉污染问题，同时在整个生产流程中，对制品采用三 步病毒灭活及去除工序，具有流程简洁，生产周期短，操作容易，制品使用安全可靠的优点。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种工艺先进、产品质量可靠、得率高及产品 使用安全的人凝血酶原复合物（PCC)的制备方法。
[0006] 1. -种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物的方法，其特征在于：包括 如下步骤： (1)血浆组分III溶解 按一定的稀释比，将冰冻的血浆组分III沉淀悬浮于溶解缓冲液中，在10-25Γ下，均 匀搅拌2-4小时，使沉淀充分溶解，得到均匀的悬浮液； (2) 聚乙二醇（PEG)沉淀去杂蛋白 在步骤（1)所述的悬浮液中加入50%PEG溶液，搅拌0. 5-1. 5小时后压滤，滤板为PALL 公司Supradur50P+l. Oum滤芯，过滤前用步骤（1)所述的溶解缓冲液预洗滤板及滤芯，收集 澄清滤液； (3) S/D病毒灭活 在步骤（2)所述的滤液中加入Tween80至L 0% (wt%)，TNBP (磷酸三丁酯）至0· 3% (wt%)，搅匀后升温至24-26°C，后保温6-8小时； (4) 强阴离子交换柱层析 将步骤（3)所述的S/D后的溶液降温至5-20°C，然后上强阴离子交换柱，柱子预先用平 衡缓冲液平衡；上柱结束后，用以上平衡缓冲液洗涤柱子，然后用洗脱缓冲液洗脱，收集洗 脱液即为凝血酶原复合物，用0. 45μπι或0. 22μπι滤芯过滤以上洗脱液，收集澄清滤液； (5) 超滤透析并浓缩 用5k-10k分子量的超滤膜浓缩步骤（4)所收集的滤液，并用透析液透析4-6倍，后再 次浓缩后移出超滤膜包； (6) 加稳定剂及调节 在步骤（5)所收集的浓缩液中加入稳定剂，并按照所需规格，调节人凝血因子IX的效 价至所需值(一般为20-30IU/ml)，后调PH值至6. 50-7. 50 ; (7) 纳米膜除病毒过滤 用15-20纳米滤芯对步骤（6)获得的PCC溶液进行除病毒过滤，收集滤液； (8) 除菌过滤并分装 用0. 22Mm除菌滤芯对步骤（7)获得的滤液进行除菌过滤并分装； (9) 冻干； (10) 干热病毒灭活 将步骤（9)获得的PCC冻干制剂置于KKTC沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活。
[0007] 2.根据权利要求1所述的一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物 的方法，其特征在于：步骤（1)所述的稀释比为1 :5~15,即一份重量的组分III沉淀投入到 5-15份重量的溶解缓冲液中；所述溶解缓冲液的组成为0. 01M-0. 02M柠檬酸钠，0. 1-0. 2M 氯化钠，PH6. 50-7. 50。
[0008] 3.根据权利要求1所述的一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物的 方法，其特征在于：步骤（2)所述的PEG分子量为3000-8000,最终浓度为3-8% (wt%)。
[0009] 4.根据权利要求1所述的一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物的 方法，其特征在于：步骤（4)所述的强阴离子交换柱所用填料为Capto-Q，Q Sepharose FF, Q Sepharose 4FF Q Sepharose HP, Q Sepharose XL 中的任意一种。
[0010] 5.根据权利要求1所述的一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复 合物的方法，其特征在于：步骤（4)所述的平衡缓冲液组成为0. 01M-0. 02M柠檬酸钠， 0. 075M-0. 15M氯化钠，PH6. 50-7. 50 ;所述的洗脱缓冲液的组成为0. 01M-0. 02M柠檬酸 钠，0· 5M-1. 5M 氯化钠，0· 02-0. 04M 精氨酸盐酸盐 PH6. 50-7. 50。
[0011] 6.根据权利要求1所述的一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物的 方法，其特征在于：步骤（5)所述的透析液的组成为0.0 lM柠檬酸钠，0. 075 M -0. 15M氯 化钠溶液，PH6. 50-7. 50。
[0012] 7.根据权利要求1所述的一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物的 方法，其特征在于：步骤（6)所述的稳定剂为精氨酸盐酸盐、甘氨酸及组氨酸中的一种或几 种组合；其中精氨酸盐酸盐的加入量为0. 5-3%，甘氨酸的加入量为0. 5-3%，组氨酸的加入 量为(λ 5-3%。
[0013] 8.根据权利要求1-7所述的一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合 物的方法，其特征在于：凝血酶原复合物制品在整个生产过程中采用了 S/D病毒灭活、纳米 膜除病毒过滤及干热病毒灭活三种病毒灭除方法。
[0014] 本发明的优越性： (1) 从Cohn血浆组分III中制备PCC工艺，流程简洁，变废为宝，不影响其它血液制品 的生产工艺，经济效益好； (2) 用一步柱层析工艺替代了传统的凝胶批处理工艺，劳动强度小，操作便捷，无交叉 污染； (3) 在洗脱缓冲液中加入蛋白保护剂，防止生产过程中凝血酶的激活，大大提高产品的 合格率； (4) 生产流程中采用三步病毒灭活及去除工序，极大降低了病毒污染的概率，产品更加 安全可靠。
【附图说明】 图1为从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物的工艺流程图。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合附图及实施例对本发明做进一步的说明，不能认为本发明的实施方式仅 限于此，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下所 做出的若干简单的改变或替换，都应视为属于本发明权利要求书确定的专利保护范围。
[0016] 实施例一 1，组分III溶解：将2kg组分III沉淀悬浮于IOkg溶解缓冲液中，溶解缓冲液配方为 0. 02M柠檬酸钠，0. 15M氯化钠，PH6. 50-6. 60 ;搅拌4小时，使沉淀充分溶解； 2, PEG沉淀去杂蛋白：在以上悬浮液中加入50%PEG溶液至悬浮液中PEG含量为3%，搅 拌1. 5小时后压滤，滤板为PALL公司Supradur50P+l. OMm滤芯，滤板预先用步骤（1)所述 的溶解缓冲液预洗，收集得澄清滤液； 3, S/D病毒灭活：以上滤液中加入Tween80至L 0% (wt%)，TNBP (磷酸三丁酯)至0· 3% (wt%)，搅勾后升温至24-26°C，后保温6小时； 4, 强阴离子交换柱层析：将上述S/D后的溶液降温至8°C，然后上Capto-Q柱，柱子预 先用平衡缓冲液（PH6. 50-6.60，0.0 lM柠檬酸钠，0.1 M氯化钠，）平衡；上柱结束后，用 以上平衡缓冲液洗涤柱子，然后用洗脱缓冲液（PH6. 50-6. 60，0.0 lM柠檬酸钠，1.0 M氯化 钠，0.02M精氨酸盐酸盐）洗脱，收集洗脱液，用0.45Mm滤芯过滤以上洗脱液，所收集澄清 滤液； 5, 超滤透析并浓缩：用IOk分子
文档序号 :
【 9548905 】
技术研发人员：李春洲
技术所有人：上海洲跃生物科技有限公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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