一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物的方法
[0017] 实施例二 1，组分III溶解：将2kg组分III沉淀悬浮于20kg溶解缓冲液中，溶解缓冲液配方为 0. 02M柠檬酸钠，0. 15M氯化钠，PH7. 40-7. 50 ;搅拌2小时，使沉淀充分溶解； 2，PEG沉淀去杂蛋白：以上悬浮液中加入50%PEG溶液至悬浮液中PEG含量为7%，搅 拌0. 5小时后压滤，滤板为PALL公司Supradur50P+l. OMm滤芯，滤板预先用步骤1所述的 溶解缓冲液预洗，收集得澄清滤液； 3, S/D病毒灭活：同实施例一； 4，强阴离子交换柱层析：将上述S/D后的溶液降温至20°C，然后上Q S印harose FF 柱，柱子预先用平衡缓冲液（PH7. 40-7. 50，0. 02M柠檬酸钠，0. 15M氯化钠，）平衡；上柱 结束后，用以上平衡缓冲液洗涤柱子，然后用洗脱缓冲液（PH7. 40-7. 50，0. 02M柠檬酸钠， 1.5M氯化钠，0.02M精氨酸盐酸盐)洗脱，收集洗脱液，用0.45Mm滤芯过滤以上洗脱液，收 集澄清滤液； 5, 超滤透析并浓缩：同实施例一； 6, 加稳定剂及调节：调节人凝血FIX效价至33IU/ml，加入精氨酸盐酸盐至1. 5%，甘氨 酸至2%，组氨酸至1. 5%，做为稳定剂；最后调PH值至6. 90-7. 10 7, 纳米膜除病毒过滤：同实施例一； 8, 除菌过滤并分装：用0. 22Mm滤芯对以上PCC溶液进行除菌过滤并分装；得到410. 5 克，活力 29.4IU/ml; 9-10,同实施例一。
[0018] 实施例三 1，组分III溶解：将2kg组分III沉淀悬浮于20kg溶解缓冲液中，溶解缓冲液组成为 0. 02M柠檬酸钠，0. 15M氯化钠，PH6. 90-7. 10 ;搅拌3小时，使沉淀充分溶解； 2, PEG沉淀去杂蛋白：在以上悬浮液中加入50%PEG溶液至悬浮液中PEG含量为5%，搅 拌1小时后压滤，滤板为PALL公司Supradur50P+l. OMm滤芯，滤板预先用步骤1所述的溶 解缓冲液预洗，收集得澄清滤液； 3, S/D病毒灭活：同实施例一； 4, 强阴离子交换柱层析：将上述S/D后的溶液降温至15°C，然后上Capto-Q柱，柱子 预先用平衡缓冲液（PH6. 90-7. 10，0.02M柠檬酸钠，0. 12M氯化钠，）平衡；上柱结束后， 用以上平衡缓冲液洗涤柱子，然后用洗脱缓冲液（PH6.90-7. 10，0.02M柠檬酸钠，0.8M氯 化钠，0.04M精氨酸盐酸盐）洗脱，收集洗脱液，用0.45Mm滤芯过滤以上洗脱液，收集澄清 滤液； 5, 超滤透析并浓缩：同实施例一； 6, 加稳定剂及调节：调节人凝血FIX效价至33IU/ml，加入精氨酸盐酸盐至1.0%，甘氨 酸至1. 5%，组氨酸至1. 0%，做为稳定剂；最后调PH值至6. 90-7. 10 ; 7, 纳米膜除病毒过滤：同实施例一； 8, 除菌过滤并分装：用0. 22Mm滤芯对以上PCC溶液进行除菌过滤并分装；得到381. 5 克，活力 32. 7IU/ml; 9-10,同实施例一。
[0019] PCC试制品FII、FVII、FIX、及FX技术数据统计一览表
*每吨血浆可得到约30kg组分III沉淀(不含硅藻土)。
【主权项】
1. 一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物的方法，其特征在于：包括如下 步骤： (1) Cohn血浆组分III溶解 按一定的稀释比，将冰冻的Cohn血浆组分III沉淀悬浮于溶解缓冲液中，在10-25°C下，均匀搅拌2-4小时，使沉淀充分溶解，得到均匀悬浮液； (2) 聚乙二醇（PEG)沉淀去杂蛋白 在步骤（1)所述的悬浮液中加入50%PEG溶液，搅拌0. 5-1. 5小时后压滤，滤板为PALL公司Supradur50P+l.Oum滤芯，用步骤（1)所述的溶解缓冲液预洗滤板及滤芯，收集澄清滤 液； (3)S/D病毒灭活 在步骤（2)所述的滤液中加入Tween80至1. 0% (wt%)，TNBP(磷酸三丁酯）至0· 3% (wt%)，搅匀后升温至24-26°C，后保温6-8小时； (4) 强阴离子交换柱层析 将步骤（3)所述的S/D后的溶液降温至5-20°C，然后上强阴离子交换柱，柱子预先用平 衡缓冲液平衡；上柱结束后，用以上平衡缓冲液洗涤柱子，然后用洗脱缓冲液洗脱，收集洗 脱液即为凝血酶原复合物，用0. 45μπι或0. 22μπι滤芯过滤以上洗脱液，收集澄清滤液； (5) 超滤透析并浓缩 用5k-10k分子量的超滤膜浓缩步骤（4)所收集的滤液，并用透析液透析4-6倍，后再 次浓缩后移出超滤膜包； (6) 加稳定剂及调节 在步骤（5)所收集的浓缩液中加入稳定剂，并按照所需规格，调节人凝血因子IX的效 价至所需值(一般为20-30IU/ml)，后调PH值至6.50-7. 50 ; (7) 纳米膜除病毒过滤 用15-20纳米的滤芯对步骤（6)获得的PCC溶液进行除病毒过滤，收集滤液； (8) 除菌过滤并分装 用0. 22Mm除菌滤芯对步骤（7)获得的滤液进行除菌过滤并分装； (9) 冻干； (10) 干热病毒灭活 将步骤（9)获得的PCC冻干制剂在100°C沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活。2. 根据权利要求1所述的一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物的方 法，其特征在于：步骤（1)所述的稀释比为1 :5~15,即一份重量的组分III沉淀投入到5-15 份重量的溶解缓冲液中；所述溶解缓冲液的组成为0. 01M-0. 02M柠檬酸钠，0. 1-0. 2M氯化 钠，PH6. 50-7. 50。3. 根据权利要求1所述的一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物的方法， 其特征在于：步骤（2)所述的PEG分子量为3000-8000,最终浓度为3-8% (wt%)。4. 根据权利要求1所述的一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物的方法， 其特征在于：步骤（4)所述的强阴离子交换柱所用填料为Capto-Q，QSepharoseFF,Q Sepharose4FFQSepharoseHP,QSepharoseXL中的任意一种。5. 根据权利要求1所述的一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物的方法， 其特征在于：步骤（4)所述的平衡缓冲液组成为0. 01M-0. 02M柠檬酸钠，0. 075M-0. 15M氯 化钠，PH6. 50-7. 50 ;所述的洗脱缓冲液的组成为0. 01M-0. 02M柠檬酸钠，0. 5M-1. 5M氯化 钠，0· 02-0. 04M精氨酸盐酸盐PH6. 50-7. 50。6. 根据权利要求1所述的一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物的方法， 其特征在于：步骤（5)所述的透析液的组成为0. 01M柠檬酸钠，0. 075Μ-0. 15M氯化钠 溶液，ΡΗ6. 50-7. 50。7. 根据权利要求1所述的一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物的方法， 其特征在于：步骤（6)所述的稳定剂为精氨酸盐酸盐、甘氨酸及组氨酸中的一种或几种组 合；其中精氨酸盐酸盐的加入量为〇. 5-3%，甘氨酸的加入量为0. 5-3%，组氨酸的加入量为 0. 5-3%〇8. 根据权利要求1-7所述的一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物的方 法，其特征在于：凝血酶原复合物制品在整个生产过程中采用了S/D病毒灭活、纳米膜除病 毒过滤及干热病毒灭活三种病毒灭除方法。
【专利摘要】本发明公开了一种从Cohn血浆组分III中制备人凝血酶原复合物（PCC）的方法,包括以下步骤：（1）Cohn血浆组分III溶解；（2）聚乙二醇（PEG）沉淀去杂蛋白；（3）S/D病毒灭活；（4）强阴离子交换柱层析；（5）超滤透析并浓缩；（6）加稳定剂及调节；（7）纳米膜除病毒过滤；（8）除菌过滤并分装；（9）冻干；（10）干热病毒灭活。本发明采用高效强阴离子交换柱层析，代替了传统的批处理凝胶吸附，大大减少了操作的劳动强度，并避免了批处理方法产生的交叉污染问题，同时在整个生产流程中，对制品采用三步病毒灭活及去除措施，具有流程简洁，生产周期短，操作容易，制品使用安全可靠的优点。
【IPC分类】A61P7/04, A61K38/36, A61K35/16, A61P1/16
【公开号】CN105326859
【申请号】CN201510751467
【发明人】李春洲
【申请人】上海洲跃生物科技有限公司
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2015年11月9日
文档序号 :
【 9548905 】
技术研发人员：李春洲
技术所有人：上海洲跃生物科技有限公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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