用于在苯丙酮酸尿症中改善脑功能的营养组合物的制作方法
[0097] 实施例1
[0098] 4份/天；3份标准补充剂+1份本发明的补充剂。
[0099] 由3份标准的含氨基酸和微量营养素的补充剂+1份含每日量的本申请中公开的 营养素的补充剂提供每日的营养需要。
[0100] 特别地调整该额外补充剂的组合物，以确保其适合于PKU患者。此外，以可实现这 些营养素的每日预期摄入量且不超过可容许的上限的方式调整维生素、矿物质、微量元素 和长链多不饱和脂肪酸的水平。
[0101] 实施例1的表1
[0102]
[0103] *所有其他维生素、矿物质和微量元素以充分满足每日需求的水平
[0104] 加入。
[0105] **存在其他氨基酸以提供每份总共20g的PE。
[0106] 实施例2
[0107] 每日3份；2份标准补充剂+1份新的配方物
[0108] 由2份标准的含氨基酸和微量营养素的补充剂+1份含有每日需要量的本申请中 公开的营养素以及与另外2份补充剂相同量的氨基酸、维生素、矿物质和微量元素的补充 剂提供每日的营养需求。
[0109] 特别调整该额外补充剂的组合物，以确保其适合于PKU患者。此外，以可实现这些 营养素的每日预期摄入量且不超过可容许的上限的方式调整维生素、矿物质、微量元素和 长链多不饱和脂肪酸的水平。
[0110] 实施例2的表2
[0113] *所有其他维生素、矿物质和微量元素以充分满足每日需求的水平加入。
[0114] 实施例3
[0115] 每日3份；3份新的配方物
[0116] 由3份含氨基酸和微量营养素且含每日需求量的本申请中公开的营养素的补充 剂提供每日的营养需求。
[0117] 每份补充剂均提供每日预期摄入量的1/3的维生素、矿物质、微量元素和长链多 不饱和脂肪酸，以及每日量的1/3的本申请中公开的营养素。配方物特别地适合于PKU患 者。
[0118] 实施例3的表3
[0121] *所有其他维生素、矿物质和微量元素以充分满足每日需求的水平加入。
[0122] 实施例4本发明的营养组合物对行为认知功能及脑中的突触可塑性的积极效果。
[0123] 材料和方法
[0124] 在实验中使用的动物和饮食（FC)
[0125] FC是有效的补充剂，其在基础动物食物中被添加至三种不同的Phe水平。补充剂 由具体的营养素的结合物组成，所述营养素包括尿苷-5'-单磷酸、胆碱、和n-3多不饱和脂 肪酸（PUFA)二十二碳六烯酸（DHA)和二十碳五烯酸。
[0126] 在该实验中，使用了C57Bl/6Pahenu2小鼠模型。雄性和雌性纯合子（PKU)小鼠和 野生型（WT)同窝出生小鼠均通过我们自己的饲养获得。在相同的12:12亮/暗循环、温度 和湿度条件下，让雄性和雌性小鼠居住在分离的房间中。将60只PKU个体和10只WT小鼠 分成7个实验小组，接受不同的饮食。所有饮食的基础配方物是AIN93G(研究饮食服务业 (ResearchDietServices)，WijkbijDuurstede)。WT个体接受Phe含量为 8. 8g/kg的 正常食物。当FC的补充和三种不同的Phe含量被随机化时，六组PKU小鼠产生。
[0127] 这样得到以下组：前两组接受与之前对WT个体所描述的相同的AIN93G正常食物 (Phe含量为8.8g/kg)。这些组之一接受无FC的饮食，另一组接受含FC的饮食：分别表示 为Phe8. 8和Phe8. 8+FC。最后的组接受低Phe饮食。该饮食含有4.Og/kgPhe，且含有或 不含FC:分别表示为Phe4. 0和Phe4. 0+FC。最后，形成中等Phe含量组，其中Phe水平被 设置在高Phe和低Phe组之间。中等Phe饮食的含量为6. 4g/kg:分别表示为Phe6. 4和 Phe6.4+FC。食物中的氨基酸水平描述于表1中。所有饮食满足实验室动物的最低营养需 求。动物可随意获得这些饮食和水，历时12周。
[0128] 在实验开始的时候（出生后（PND) 28天），使这些动物断奶并通过尾静脉穿刺取得 血液样本。在PND31时，将动物暴露于圆形旷场区域，并随后放上不同的饮食，历时12周。 在实验第一周的16:00-18:00之间每日称重所有动物（PND31-PND38)，从那以后每周称 重一次。每日测定食物摄入量。在这12周内，在PND59和87时进行血液收集。在PND115 时，将所有动物聚集到相同的旷场区域，随后对其实施安乐死，通过心脏穿刺收集血液，之 后进行灌流。在此研究中涉及动物的所有过程均由荷兰格罗宁根大学伦理委员会批准。
[0129]
[0130] 基因型分型
[0131] 为了建立动物的基因型，对提取自尾部组织的DNA进行定量PCR(qPCR)分析。在 600转/分钟（rpm)和55°C下，在0· 5mL小鼠尾部裂解缓冲液（lOOmMTris-HCl，pH8· 5 ; 5mMEDTA，pH8.0;200mMNaCl;0·2% (w/v)SDS)和蛋白酶K(100yg/ml，比例 100:1)中， 通过过夜孵育尾部组织来启动DNA分离程序。第二天，在13000rpm下，将样品涡旋并离心 10分钟。随后，将450μL上清液转移到含0. 5mL异丙醇的新试管中。轻轻混合这些溶液 后，将试管在6000rpm下离心10分钟。将上清液移除，将沉淀DNA空气干燥至少30分钟。 为准备用于qPCR的DNA，将沉淀DNA重新悬浮在200μ1TE-缓冲液（10mMTris-HCl;lmM Η)ΤΑ)中，涡旋，并在55°C下孵育10分钟。随后，将样品在15000相对离心力（ref)下离心 10分钟，用矿化水稀释50倍，涡旋，再次在15000rcf下离心10分钟。
[0132] 将2μ1样品与5μL主混合物（Mastermix) -起加载到96孔板（Biorad， HSP-9601)中。该主混合物含有：
[0133] TE-缓冲液
[0134] PCR-混合物（BiolineSensiMixTMProbeKit(500 次反应））WT/PAH-enu2 正向引 物CCGTCCTGTTGCTGGCTTAC
[0135] WT/PAH-enu2 反向引物CAGGTGTGTACATGGGCTTAGATCWT探针CCGAGTCZZ LCALTGCA
[0136] PAH-enu2 探针CCGAGTCZLLCACTGCA
[0137] 引物基于Genbank，并且根据Eurogentec的指南进行复制。将WT探针用FAM焚光 团标记，并且将PKU探针用YakimaYellow焚光团（EpochBiosciences)标记。将该板在 ABIPrism7500序列系检测系统中运行。循环参数是95°C持续10分钟、95°C持续0. 15min 和60°C持续lmin。重复这种循环39次。
[0138] 行为测量
[0139] 在PND31和115时，将所有动物聚集到旷场。在该行为模型中，允许动物探索一 个具有白色表面和灰色侧面的圆形旷场（r= 40cm)。在每个实验开始前的几分钟，用30% 乙醇清洁该场地。在实验开始的时候，将动物置于该场地的中央，该动物可在该场地内自由 探索10分钟。记录每次实验并用EthoVision系统（Noldus，荷兰）追踪。由该系统得到以 下行为：到第一进入中心区域、中间区域和边界区域的时间、频率和等待时间（latency); 移动的距离；速度及区域转换的次数。
[0140] 将结果绘制在图1中。图1A示出对不同区域的定义；使用80cm的旷场。用分析 程序区分三种区域：中央、中间和边界。在图1B中，离开中心区域的时间代表不同干预和对 照组。
[0141] 免疫组织化学
[0142] 对于免疫组织化学，利用多聚甲醛（PFA)通过灌流收集动物的脑。在心脏刺穿后 立即准备动物，以使得心脏可见。将连接至栗系统的针插入左心室。随后，将右心房切除， 使冲洗溶液（〇. 9%NaCl;5mL肝素/L)以相当于15ml/min的速度9. 25rpm通过。当肝脏 变苍白时，将冲洗溶液改为固定液（4%的在0. 1M磷酸盐缓冲液（PB)中的PFA;pH7. 4)。灌 流后，收集脑并且在固定液中后固定24小时。24小时后，在4°C下，将脑储存于0. 1M磷酸 盐缓冲盐水（PBS)中。分批地，将脑置于蔗糖溶液（30%蔗糖0.01MPB)中。将该溶液用作 冷冻保护剂。在脑下沉到容器底部后立即（在脑浸入蔗糖溶液中约16小时后）用液氮将 其冷冻，且在-80°C下储存。在LeicaCM3050低温恒温器上将脑分两批切片。将切片切成 20μm，将室温度和物体温度保持在-16°C至-14°C之间。在4°C下，将切片存储在含有0. 1 % 叠氮化钠（NaN3)的0. 01MPBS中。
[0143] 按照以下方式进行PSD-95的免疫组织化学染色：在用TBS中的0. 3%H202孵育 前，用pH7. 4、0. 01MTris缓冲盐水（TBS)冲洗自由浮动切片（5个海马体切片、5个前额 骨切片和5个纹状体切片）3次。用TBS再次将切片冲洗4次，并在37°C下，在水浴中，用 1:1000 单克隆小鼠Anti-PSD-95,Mi11ipore,MABN68,TBS中的 1 %NGS和 0· 5 %Triton-X孵 育2小时。在37°C下孵育后，将切片置于振荡器上，室温保持24小时，并随后在4°C下储存 48小时。在用第二抗体溶液（l:500Biotin-SP偶联的affiniPure山羊抗小鼠，Jackson，编 码：115-0. 65-166Lot#l10630,TBS中的 1 %NGS和 0· 5 %Triton-X)于室温下孵育 2 个小时 之前，将切片用TBS冲洗6次。在用TBS中的1:400AB复合物，VectastainPK-6100standard 孵育2小时之前，用TBS冲洗切片4次，在4°C下储存过夜，并且再冲洗2次。孵育后，将切 片用TBS冲洗6次，并置于3, 3' -二氨基联苯胺（DAB;7mg/15mL)溶液中。通过向DAB溶 液中引入在H20中的100μL0.1 %H202而开始显色。通过用TBS冲洗3次来停止反应。 在用明胶溶液（Η20中的1%明胶、0.05%Aluin)固定前，将切片于4°C下储存过夜。在用 DPX盖片之前，使具有固定切片的载玻片通过一系列的7个浴器（2, 3-100%乙醇、4-70 %乙 醇30%二甲苯、5-
文档序号 :
【 9567836 】
技术研发人员：R·D·范安霍尔特,A·阿塔利
技术所有人：N·V·努特里奇亚
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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