从微藻制备和提取角鲨烯的方法
【专利摘要】本发明涉及一种以属于破囊壶菌目物种家族的微藻生产角鲨烯的方法，优选以在每100g干生物质2g与12g之间的浓度生产。该方法其特征在于它包括由以下项组成的步骤：在25℃与35℃之间、优选在28℃与32℃之间、并且更优选在大约30℃的温度下培养属于破囊壶菌目物种家族的微藻；并且向所述培养基以每升培养基添加1μg与1000μg之间的维生素B12。
【专利说明】从微藻制备和提取角鲨烯的方法
[0001]本发明涉及从破囊壶菌目物种家族的微藻通过发酵而最优化生产角鲨烯的一种方法。
[0002]出于本发明的目的，表述“破囊壶菌目物种家族的微藻”旨在指代属于裂殖壶菌属物种(Schizochytrium sp.)、Aurantiochytrium 物种(Aurantiochytrium sp.)以及破囊壶菌属物种(Thraustochytrium sp.)的微藻。
[0003]角鲨烯是一种三萜烯，一种包含30个碳原子和50个氢原子的类异戊二烯，具有以下化学式:2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22- 二十四碳六烯。
[0004]它是由所有较高级别的有机体，包括人类(在皮脂中发现)天然产生的一种脂质。角鲨烯实际上是胆固醇、类固醇激素和维生素D生物合成中的一种重要的中间产物(胆固醇代谢途径的的一种酶一角鲨烯单加氧酶，通过氧化角鲨烯分子末端之一，将诱导其环化并且产生羊毛留醇，该羊毛留醇被转化成胆固醇和其他类固醇)。
[0005]在工业上，角鲨烯尤其被用于食品部门、化妆品领域和制药领域。
[0006]作为一种食品补充剂，角鲨烯通常被配制成胶囊或者油类。
[0007]在化妆品领域中，这个分子可以用作一种抗氧化剂，在保湿霜中用作抗静电剂和润肤剂，快速渗透进皮肤而不留下脂肪痕迹或者感觉，并与其他油类和维生素类很好地混合。
[0008]在这个领域，应该注意到，由于角鲨烯非常高的不稳定性(6个不饱和状态)，饱和形式的角鲨烷(通过氢化作用得到)是比角鲨烯更好的抗氧化剂，这种角鲨烷在市场上可以找到，一般具有非常高的纯度(99%)。
[0009]毒理学研究显示，按照在化妆品中使用的浓度，角鲨烯和角鲨烷都不会展示出任何毒性，并且对人体皮肤没有刺激性或者敏感性。
[0010]在制药领域，角鲨烯用作疫苗的佐剂。
[0011]这些佐剂是刺激免疫系统并且增加对疫苗的反应的物质。
[0012]自从1997年在一种流感疫苗(Fluad,来自Chiron公司，对抗季节性流感)中以每个剂量大约10mg角鲨烯使用角鲨烯以来，角鲨烯已经以添加到接种物质中的乳剂的形式使用以便使得疫苗更易产生免疫性。
[0013]如所有含有角鲨烯的疫苗，这些乳剂具有乳白色的外观。
[0014]角鲨烯还被用作一种疫苗佐剂，特别是实验疫苗、抗疟疾物质或者靶向新出现的病毒H5N1及2009H1N1的流感疫苗的佐剂，如:
[0015]-葛兰素史克公司在对抗2009年流感流行时使用的Pandemrix和Arepanrix疫苗中的AS03佐剂系统的获专利成分，
[0016]-诺华公司使用的MF59佐剂系统的获专利成分。
[0017]角鲨烯还被添加在流感疫苗中以通过产生记忆⑶4细胞来刺激人体的免疫应答。
[0018]流感疫苗的第一个水包油佐剂已经与季节性流感病毒抗原联合上市。
[0019]角鲨烯的纯度水平在这个应用领域中是至关重要的。
[0020]实际上，如果口服使用，角鲨烯被认为是完全安全的；但是，注射途径是争议主题。[0021]实际上，在医学领域，在角鲨烯被杂质污染的情况下，对人接受者的伤害的风险增加，因为通过确定，这种佐剂还可以诱导对抗其自身杂质的强免疫应答。
[0022]因此拥有高质量的无杂质(痕量金属，特别是汞，以及痕量的其他毒素类)的角鲨烯至关重要。
[0023]在文献中建议了一些生产角鲨烯的路径。
[0024]它是常常发现储存在软骨鱼(例如深海鲨)的肝脏中的一种化合物(因此而得名)。
[0025]因此这是它们为什么被过度捕渔的原因之一，鲨鱼已经由于其鱼鳍而被猎杀。现在又将鲨鱼的肝脏出售以生产描述为“有益健康”的凝胶胶囊。
[0026]然而，虽然上市的角鲨烯因此主要从鲨鱼的肝脏中提取，但是并非没有健康问题。
[0027]这是因为鲨鱼能被一些病原体感染，这些病原体可以产生对人体有害的物质。另外，鲨鱼的肝脏，它是有机体消除和纯化的器官，可能包含对人体有害的例如真鲨毒素的毒素类。
[0028]这些环境问题(大大降低了鲨鱼的数量)以及健康问题(鱼的肝脏还储存了涉及健康的毒素类)促使了从植物类的提取。
[0029]因此有可能将它从橄榄油、和棕榈油中分离，以及从来自谷物类的或者源于苋菜、种子、米糠或小麦胚芽的其他油类中分离。
[0030]但是，这种情况中的主要缺点是角鲨烯被提取出的量非常少，按重量计大约为从0.1% 至 0.7%。
[0031]通常从鲨鱼肝脏或从植物类提取的这些方法由于进行大量富集和纯化过程而很昂贵，已经提出了作为这些方法的第一个替代方法，该第一个方法是从以下微生物中产生角S烯:天然酵母或重组酵母，特别是酵母菌属(Saccharomyces)类型。
[0032]由此，酿酒酵母以其产生角鲨烯的能力而为人了解，但是产生的量非常少:大约0.041mg/g生物量(巴塔查尔吉(Bhattachar jee，P.)等人，2001，《世界微生物生物技术杂志》(World J.Microb.Biotechnol.) 17,第 811-816 页)。
[0033]因此已经通过基因重组的方式进行了优化这些生产能力的工作。
[0034]产生角鲨烯的重组酵母因此具有以下优势:
[0035]-受益于与宿主细胞相同的GRAS(通常认为安全)状态，
[0036]-跟宿主细胞一样没有病原体、没有朊病毒或没有毒素类，以及
[0037]-已经被用在疫苗领域(例如这些表达了包含乙肝抗原的载体的酵母菌)。
[0038]然而，如专利申请W02010/023551对于医学领域所呈现的(生产纯度高于97%的角鲨烯作为疫苗佐剂)，只有使得重组酵母菌超生产角鲨烯(高于菌体干重的15%)变得有可能，这第一个替代方法才可以工业化。
[0039]如果可以发生的话，获得这些重组细胞需要:进行大量的、艰苦的、冗长并复杂的代谢工程化步骤，使用分子生物学工具，导致刺激角鲨烯生物合成路径并且抑制角鲨烯的分解代谢途径。
[0040]实际上，如所述专利申请W02010/023551另外介绍的，在角鲨烯生物合成中涉及很多基因:包含甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶、异戊二烯焦磷酸异构酶、HMGR (3-羟基-3-甲戊二酰-辅酶A还原酶)以及角鲨烯合成酶 。
[0041]对于分解代谢途径，基因编码在角鲨烯转化成麦角固醇中涉及的众多酶，包括角鲨烯环氧酶(ERG1)、羊毛留醇合成酶、C14-二甲基化酶、dl4-还原酶、C4-甲基氧化酶、C4-脱羧酶(ERG26)、3-酮还原酶、C24-甲基转移酶、C8-异构酶、C5-去饱和酶、d22_去饱和酶和d24-还原酶。
[0042]另外，还必须考虑到其他分解代谢酶:LEU2 ( [ β ]_异丙基苹果酸脱氢酶)，环氧角鲨烯环化酶，酵母留醇-24-甲基转移酶以及麦角留-5，7，24 (28)-三烯醇-22-脱氢酶。
[0043]作为从鲨鱼肝脏或从植物类提取方法的第二个替代方法，已经提出了从破囊壶菌目家族 (包含破囊壶菌属、Aurantiochytrium属和裂殖壶菌属)、更特别地从Schizochytrium mangrovei 或 Schizochytrium Iimacinum 的微藻中生产角藍烯的有希望的方法。
[0044]这些微藻在异养条件下(无光；提供葡萄糖作为碳源)产生角鲨烯，并且因此可以由微生物发酵领域的普通技术人员容易地操作。
[0045]因此，这些方法通过可控制的发酵条件提供高质量的角鲨烯，这些角鲨烯的纯化可以很容易地进行以满足食品、化妆品和医学需求。
[0046]然而在破囊壶菌目家族的这些微藻中，角鲨烯是感兴趣的其他脂质化合物(例如二十二碳六烯酸(或DHA)、ω 3族的多元不饱和脂肪酸)的副产品，。
[0047]因此似乎角鲨烯被特别描述为商业DHA油类的非皂化部分(连同类胡萝卜素类和甾醇类)的成分之一。
[0048]相比较而言，Schizochytrium mangrovei FBI菌株产生DHA的比例为菌体干重的
6.2%，角鲨烯为0.017%。
[0049]结论是，天然产生角鲨烯的这些微生物类其产量是非常低的:
[0050]对于Thraustochytrid ACEM6063,大约为 0.lmg/g 生物质(参见 Lewis 等人，《海洋生物技术》(Mar.Biotechnol.)，2001，439-447)，
[0051]对于Schizochytrium mangrovei FBI,大约为 0.162mg/g 生物质(参见 Jiang 等人，《农业与食品化学杂志》(J.Agric.Food Chem.)，2004，52，第1196-1200页)。
[0052]为了增加产量，由此显现出优化这些发酵条件至关重要。
[0053]在Qian Li等人在《农业与食品化学杂志》(J.Agric.FoodChem.，2009, 57，4267-4272)的文章中描述了角鲨烯是留醇生物合成的一种关键中间体，并且角鲨烯转化成留醇的第一个步骤是由一种氧依赖性角鲨烯环氧酶进行催化。
[0054]因此，反之，如果希望的话，应禁止富含溶解氧的条件从而累积细胞内的角鲨烯。
[0055]因此，在一个低的溶解氧水平(O至5%饱和度)下培养ThraustochytridACEM6063，使得有可能累积超过lmg/g的角鲨烯，然而在一个较高的溶解氧水平(40%至60%)下的生长使得有可能获得仅仅0.0 lmg/g的角鲨烯。
[0056]相似地,在15°C的温度下培养使得由Thraustochytrid ACEM6063生产出1.2mg/g角鲨烯，然而在20°C的温度下培养仅仅产生0.7mg/g (参见Lewis等人，《海洋生物技术》(Mar.Biotechnol.),2001,3,439-447)。
[0057]在G.Chen 等人在《新生物技术》(New Biotechnology, 2010, 27-4, 382-389 页)的文章中，回顾了裂殖壶菌主要通过聚酮合酶(首字母缩略词:PKS)途径产生DHA，然而角鲨烯是通过胆固醇生物合成途径合成，这意味着产生这两种化合物时破囊壶菌的营养需求是不同的。[0058]因此他们工作的目标是系统地研究在生产角鲨烯中不同氮源的效果。
[0059]G.Chen等人由此发现，在包含由谷氨酸钠、酵母提取物和胰蛋白胨组成的氮源混合物的培养基中，裂殖壶菌可以快速生长并且累积“高”量的角鲨烯。[0060]尽管这样，所谓的“高”的角鲨烯产量完全是相对而言的。
[0061]虽然相对于基础培养基的值，这些作者成功地分别以26.3%和10.1%显著增加角鲨烯的含量和产率，但是这些优化的条件实际上产生含量为0.72mg/g和滴度为5.90mgl/l的角鲨烯。
[0062]带着优化角鲨烯产量的相同目标，K.ff.Fan等人(在《世界微生物生物技术杂志》(World J.Microbiol.Biotechnol.) , 2010, 26-3, 1303-1309 页中)使用了角S烯单加氧酶(甾醇生物合成中的一种关键酶)的抑制剂:特比萘芬羟基氯化物。
[0063]已知角鲨烯含量和产率与微生物培养的年龄相联系。
[0064]细胞培养年龄越长，它累积的角鲨烯越少；实际上，它在留醇生物合成路径中消耗所述角鲨烯越多。
[0065]因此特比萘芬通过防止角鲨烯向甾醇路径的这种消耗而起作用，并且因此使得其有可能刺激角鲨烯在细胞内累积至相对于对照品高达36%至40%。
[0066]但是,在这个研究中从所使用的Aurantiochytrium mangrovei FB3菌株获得的最高的角S烯产量，即使比对于酿酒酵母(s.cerevisiae) (0.04lmg/g生物质)所描述的高很多、或者甚至比对于戴尔有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii) (0.24mg/g生物质)所描述的还高，却仅仅是0.53mg/g生物质。
[0067]此外，虽然这些代谢途径的转移允许产生相对更高量的角鲨烯，它的风险是通过相应地限制对产生这些相同细胞的类脂膜至关重要的留醇类的产生而弱化这些细胞。
[0068]在这些最高的角鲨烯产量结果中，使用如在由C-J Yue和Y.Jiang在《过程生物化学》(Process Biochemistry, 2009, 44, 923-927)的文献文章中所报道的微藻,表明最大角S烯含量为1.17±0.6mg/gSchizochytrium mangrovei生物质,其中使用茉莉酸甲酯通过直接作用于角鲨烯合成酶(一种所述代谢途径的关键酶)来调节角鲨烯合成的代谢途径。
[0069]因此，尽管作了所有的努力，这些值远远低于橄榄油的参考值(大约4.24mg/g)，并且远非工业规模所需的值。
[0070]考虑到开发比现有技术中描述的那些更有效并且更便宜的一种生产方法，本 申请人:公司已经发展了自己在破囊壶菌目物种家族的微藻的发酵条件优化上的研究。
[0071]因此本发明涉及一种用于获得对于100g的干生物质而言Ig角鲨烯规模的方法，也就是，超过这个领域的文献中通常所描述的量高达1000倍。
[0072]本发明还涉及一种从得到的发酵培养基提取和纯化角鲨烯的方法。
[0073]通过发酵裂殖壶菌来生产角鲨烯
[0074]对本 申请人:公司最主要的荣誉是发现，在控制发酵的所有参数中，其中两个使得它们本身有可能在这些微藻中大量提高角鲨烯的产量水平。
[0075]这两个关键参数是培养基的温度、以及维生素类的添加，更准确地说是维生素BI和B6并且尤其是维生素B12的添加。
[0076]因此本发明涉及由属于破囊壶菌目物种家族的微藻来生产角鲨烯的一种方法，其特征在于它包含以下步骤:[0077]-在25°C与35 °C之间、优选在28 °C与32 °C之间、更优选大约30 V的温度下，培养属于破囊壶菌目物种家族的微藻，并且
[0078]-向该培养基中以每升培养基添加Iμ g至1000 μ g的维生素B12。
[0079]优选地，如以下将表明的，本 申请人:公司推荐添加:
[0080]〇每升培养基0.1mg至200mg的维生素BI,和/或
[0081]〇每升培养基0.1mg至200mg的维生素B6。
[0082]当然，该方法可以包括回收富含角鲨烯生物质的一个步骤和/或回收或提取角鲨烯的一个步骤。
[0083]更具体地，已经测试了以下可商购的菌株:
[0084]-裂殖壶菌属物种，参考号ATCC20888，
[0085]-Aurantiochytrium 物种，参考号 ATCC PRA276。
[0086]此外，本 申请人:公司还拥有自己的生产菌株一裂殖壶菌属物种，于2011年4月14日保藏在法国巴斯德研究所的法国国家微生物保藏中心[Collection Nationale deCultures de Microorganisms],保藏号为CNCM 1-4469,并且还保藏在中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心(中国武汉，430072)，保藏号为M209118。
[0087]还将Schizochy trium mangrovei的一个菌株作为对照进行了测试，以下将举例说明。
[0088]具体地，根据本发明的方法使得有可能获得对于100g干生物质而言大于或等于2g、优选对于100g干生物质而言在2g与12g之间的角鲨烯含量。具体地，可以根据实验部分详述的方法对所产生的角鲨烯进行定量。
[0089]由此，在根据本发明的方法中，首要的基本特征是选择进行微藻培养和生产角鲨烯的温度。
[0090]因此将该温度选择在25°C与35°C之间，优选在28°C与32°C之间，更优选大约在
30。。。
[0091]因此本 申请人:公司克服了第一个技术偏见，即要求这些微藻的培养不应超过
25。。。
[0092]事实上，在以上所引用的破囊壶菌目生产角鲨烯的大部分文献中，基于所研究的微藻的生长温度(即15 °C、22 °C或25 °C )来设置生产温度。
[0093]根据本发明的方法，本 申请人:公司建议，相反地，在28°C和32°C培养这些微藻，因为已经能够注意到:
[0094]-虽然由菌体生物质生产的角鲨烯的浓度随着温度高达33°C而增加，超过30°C生物质的量将显著降低，因此限制角鲨烯滴度，
[0095]-在25°C的温度下，角鲨烯浓度无法检测到或者非常低。
[0096]因此这个温度范围是微藻最佳培养温度和角鲨烯有效生产温度之间的一个折衷。
[0097]因此最高25°C的温度与现有技术中通常使用的温度不矛盾，这个温度最佳地促进角鲨烯的生产。
[0098]在根据本发明的方法中，第二个基本特征是提供给裂殖壶菌培养基来生产角鲨烯的维生素B12的量，即以每升培养基从1μ g至1000 μ g的维生素B12的比例。
[0099]优选地，添加维生素B12时还可以补充:[0100]〇每升培养基0.1mg至200mg的维生素BI,和/或
[0101]〇每升培养基0.1mg至200mg的维生素B6。
[0102]在涉及用以上提及的微藻生产角鲨烯的文献中，维生素类的作用没有考虑。维生素类的提供常规地通过添加酵母提取物来进行。
[0103]事实上本领域的普通技术人员熟知这些维生素类是按以下比例天然存在于酵母提取物中的:
[0104]_50mg/kg 至 120mg/kg 的维生素 BI (硫胺素)，
[0105]-40mg/kg 至 80mg/kg 的维生素 B6 (批多辛)，
[0106]-1 μ g/kg 至 5.5 μ g/kg 的维生素 B12 (氰钴胺)，
[0107]-仅仅提及这三种维生素B。
[0108]但是，对于100ml培养基，仅提供Ig至2g引入培养基中的酵母提取物(参见上面列出的科学文章)，这对应着极其低的维生素剂量(例如，对于维生素B12，由酵母提取物提供的维生素B12对应为0.07 μ g/1)。
[0109]即使这样，这套文件既没有描述也没有建议为了在微藻中生产角鲨烯而控制维生素B1、B6或B12的含量。
[0110]没有受任何理论的约束，本 申请人:公司已经发现在生产角鲨烯中维生素B12的卓越作用(以下将会示例)表明它是角鲨烯生物合成所涉及的一些关键酶的辅因子。
[0111]对于维生素BI，它刺激亮氨酸降解途径，这将增加细胞内角鲨烯前体的量，而维生素B6通过改变细胞色素类的作用而阻止角鲨烯降解。
[0112]因此本 申请人:公司已经发现维生素B12的提供(使温度达到28°C和30°C的情况下)是极大增加角鲨烯产量(在lg/100g干生物质规模上)的关键，并且事实上维生素BI和B6的提供使得尤其有可能增加角鲨烯的生产率，如以下将证明。
[0113]根据本发明的方法的另一个特征是添加维生素类可以在整个发酵过程中、或者在一些步骤中、并且不仅仅在生产阶段进行。
[0114]但是，必须坚持在整个发酵过程中提供在I μ g/Ι与1000 μ g/Ι之间的维生素B12。
[0115]常规地，在涉及优化实验室中进行的由微藻生产角鲨烯的条件的工作的文献中，发酵是基于常规微生物接种和生产链进行的，并且通常是最大多数使用的生产条件。
[0116]实际上从破囊壶菌生产角鲨烯需要三个连续步骤:在一个琼脂培养皿上从一个分离的菌落开始，预培养以恢复菌株，并且最后实质培养(=生产)。
[0117]例如，上面提到的G.Chen的文章描述了包含以下连续步骤的方法:
[0118]-从在包含葡萄糖、谷氨酸钠、酵母提取物和各种微量元素(traceelement)的琼脂营养培养基上保存的菌株开始，
[0119]-在一个定轨摇床上在锥形烧瓶(Erlenmeyerflask)中，在pH为6、温度为25°C时，制备预培养物，以便获得恢复的生物质，
[0120]-向具有与在预培养中所用的培养基相同的培养基的另一系列锥形生产烧瓶接种大约0.5% (v/v)的前述步骤获得的生物质，并且保持在25°C的温度下。
[0121]如果发生的话，如可以在所述文章中读到(但是在本领域的其他文章中也证实这是真实的)的，在后面培养步骤的水平上，专家们为了优化发酵条件而采取行动。
[0122]换句话说，现有技术优化研究包含改变生产培养基的一种或多种组分以便研究其对角鲨烯生产的影响。
[0123]但是正相反，如以下将被开发的，本 申请人:公司建议从第一步骤就开始控制发酵条件，即使证实在工业规模上实现更加复杂。
[0124]在这个规模上，事实上，接种链可以在实际生产步骤之前包含一系列的几个预培
养步骤。
[0125]根据本发明的方法的一个优选实施例因此可以包含以下连续步骤:
[0126]-在锥形烧瓶中，在28°C的温度下，从一个琼脂培养皿上的一个分离的菌落对破囊壶菌目家族的微藻进行第一次预培养，持续24至36小时，
[0127]-在锥形烧瓶中，在28°C的温度下，用1%(v/v)的从第一次预培养得到的接种物进行第二次预培养，持续24至36小时，
[0128]-在30°C的温度下,在一个设定了条件以便观察到最高45mmol/l/hr氧传递的一个发酵罐内，用0.5%至2% (v/v)的从第二次预培养得到的接种物培养60至150小时。
[0129]在这个链条中，如以下将示例的，取决于操作条件，维生素类的添加可以在一个单一的预培养步骤中、在两个预培养步骤中或贯穿整个培养链进行。
[0130]如以下将证明的，在一个单一预培养步骤中添加维生素类已经使得有可能获得显著的结果，最佳模式则需要在所执行的所有步骤中进行添加。
[0131]微藻生长所需的碳源优选地是葡萄糖。
[0132]本 申请人:公司因此建议控制葡萄糖的添加，从而提供按重量计从15%至22.5%的
葡萄糖总量。
[0133]尽管如此，如以下将用所选择的裂殖壶菌菌株举例说明的，优选在非零残留葡萄糖含量下、最高等于按重量计8%含量下工作。
[0134]关于氮源的性质，本 申请人:公司已经发现有可能从由以下项组成的组中选择:酵母提取物、尿素、谷氨酸钠和硫酸铵，单独使用一个或它们的组合。
[0135]有可能优选酵母提取物，通常用于现有技术的方法中，补充了维生素混合物的尿素，例如Sigma公司销售的BME混合物，使用量为5ml/l。
[0136]类似地，有可能完全或部分用谷氨酸钠替代尿素，或者使用谷氨酸钠与硫酸铵的混合物。
[0137]本 申请人:公司尤其建议不使用硝酸形式的氮源。
[0138]关于培养基的pH,如以下将不例的,将维持在5.5与6.5之间,优选固定在6的值。
[0139]该pH值可以通过本领域的普通技术人员已知的任何方式进行调整，例如通过添加2N硫酸，然后加入8N氢氧化钠。
[0140]最后，可以将溶解氧含量调整至20%与0%之间的一个值，优选在溶解氧成为0%之前的最初的24或48小时期间、优选36小时期间维持在5%，。
[0141]关于氧传递，可以用已知的任何方式而且是对于本领域的普通技术人员已知的任何方式调整，以便不超过45mmol/l/hr。
[0142]如以下将示例的，在发酵结束时，按照这些操作条件获得的生物质高于50g/l、优选在50g/l与100g/l之间，大约为80g/l。
[0143]角鲨烯的含量，就其部分而言，对于100g干生物质而言为高于lg，优选地对于100g干生物质而言为2g与15g之间，甚至更优选地对于100g干生物质而言为5g与IOg之间。
[0144]从发酵培养基提取和纯化角鲨烯
[0145]通过本领域普通技术人员本身已知的任何方法从发酵培养基恢复生物质,例如可以将生物质从发酵罐中移除并且通过微孔过滤或离心法简单地浓缩，或者用一种水性溶液通过连续浓缩-稀释来洗涤。
[0146]为了提取脂质含量进行的细胞破裂可以通过各种途径进行，其中有机械的、化学的或酶的途径。
[0147]在几步连续提取中用己烷/乙醇从细胞裂解物提取油。
[0148]分离己烷部分，并且然后将己烷蒸发掉以便分离原油。
[0149]本发明最后涉及用本发明的任何一种方法生产的角鲨烯在制备预期用于医学领域、化妆品领域和食品部门的组合物中的用途。因此，它涉及一种用于制备预期用于医学领域、化妆品领域和食品部门的组合物的方法，该方法包括使用本发明的任何一种方法生产角鲨烯，并且进而制备预期用于医学领域、化妆品领域和食品部门的组合物。
[0150]借助下述实例将更清晰地理解本发明，这些实例旨在说明性的而非限制性的。
[0151]实例1:添加维生素B1、B6和B12的研究以及温度对角鲨烯生产的影响的研究
[0152]预培养和培养基
[0153]在此，微藻的发酵在实际培养/生产阶段之前通过两个先前的连续的预培养阶段进行。
[0154]对于此实验，在第一次预培养的培养基内添加了维生素类，但是在第二次预培养的培养基中以及在生产中维生素类的添加是可任选的。
[0155]因此预培养的培养基具有下表1和II给出的组分:
[0156]表1
[0157]
【权利要求】
1.一种由属于破囊壶菌目物种家族的微藻生产角鲨烯的方法，其特征在于它包含由以下项组成的步骤: -在25 °C与35 °C之间、优选在28 °C与32 °C之间、更优选大约30 °C的温度下培养属于破囊壶菌目物种家族的微藻，并且 -向预培养基或培养基以每升培养基添加I μ g至1000 μ g的维生素B12。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于加入了以下物质: ο每升培养基0.1mg至200mg的维生素BI,和/或 ο每升培养基0.1mg至200mg的维生素B6。
3.如权利要求1和2中任一项所述的方法，其特征在于这种破囊壶菌目家族的的微藻选自下组，该组由以下各项组成:裂殖壶菌属物种(Schizochytrium sp.)、Aurantiochytrium 物种以及破囊壶菌属物种(Thraustochytrium sp.)。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于这种破囊壶菌目家族的微藻选自下组，该组由以下各项组成:裂殖壶菌属物种ATCC20888, Aurantiochytrium物种ATCCPRA276,以及保藏在巴斯德研究所(Institut Pasteur)的法国国家微生物保藏中心、编号为N0.CNCM 1-4469的裂殖壶菌属物种菌株。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于所获得的角鲨烯含量对于100g的干生物质而言为大于 或等于2g，优选地对于100g的干生物质而言为在2g与12g之间。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于这种属于破囊壶菌目物种家族的微藻的该培养通过以下连续步骤进行: -在锥形烧瓶内，在28°C温度下，从在一个琼脂培养皿上的一个分离的菌落进行第一次预培养，持续24至36小时， -在锥形烧瓶内，在28°C温度下，用1% (v/v)的从该第一次预培养得到的接种物进行第二次预培养，持续24至36小时， -在30°C,在一个设定了条件以便观察到最高45mmol/l/hr的氧传递的发酵罐内，用0.5%至2% (v/v)的从该第二次预培养得到的接种物培养60至150小时。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于在这两次预培养步骤中进行维生素B12的添加，从而使得维生素的总含量在I μ g/i与ιομ g/i培养基之间。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于还在这两次预培养步骤中添加维生素BI和B6，从而使得维生素的总含量在100 μ g/1与200 μ g/1培养基之间。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于维生素B12的添加是如下进行: -在这两次预培养步骤中，使得维生素的总含量在I μ g/Ι与10 μ g/1培养基之间， -在生产步骤中，使得维生素的总含量为大约1000 μ g/Ι培养基。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于还如下添加了维生素BI和B6: -在这两次预培养步骤中，使得维生素的总含量在100 μ g/1与200 μ g/1培养基之间， -在生产步骤中，使得维生素的总含量在150mg/l与200mg/l培养基之间。
11.通过如权利要求1至10中的任一个方法生产的角鲨烯的用途，用于制备预期用于医学领域、化妆品领域和食品部门的组合物。
【文档编号】C12P5/02GK103620041SQ201280024524
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2012年5月18日 优先权日:2011年5月20日
【发明者】伯纳德·波拉, 钱云, 伯纳德·考利尔, 塞吉·科米尼, 菲利皮·卢腾, 劳伦特·塞盖拉 申请人:罗盖特兄弟公司
文档序号 :
【 510546 】
技术研发人员：伯纳德·波拉,钱云,伯纳德·考利尔,塞吉·科米尼,菲利皮·卢腾,劳伦特·塞盖拉
技术所有人：罗盖特兄弟公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
技术研发人员：伯纳德·波拉,钱云,伯纳德·考利尔,塞吉·科米尼,菲利皮·卢腾,劳伦特·塞盖拉
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