一种向动物细胞中转移外源基因的方法
技术领域：
本发明涉及一种向动物细胞中转移外源基因的方法。
目前在转基因哺乳动物的制备上主要有两种方法受精卵原核显微注射和以精子为载体的导入方法。前者要求受精卵原核具有一定的能见度(这在相当多的动物中是很困难的)和操作者具有相当高的操作技术(不易掌握)，而且易造成核损伤，导致出生率很低，转基因失败；后者则不稳定，重复性差。而体外培养的细胞转染方法，一直困于转染率很低，只能进行细胞学的观察实验，无法进行其它研究。因此人们一直在尝试另一途径通过细胞质注射基因获得转基因动物。这一途径在80年代和90年代曾尝试过，结果是失败的[Mario R.et al.Cell 22479～488；Mirzayans R，et al.Mutat Res，281(2)115～22]。近年来随着核定位序列(nuclear localization signals，NLS)和功能的研究，一些实验室尝试用NLS携带靶基因构件进入细胞核，这一尝试取得了初步成功[Collas P，etal.Transgenic Res 1998，7(4)303～9；Dean DA，et al.Exp Cell Res，1999，253(2)713～22；Wilson GL，et al.J Biol Chem，1999，274(31)22025～32；Collas P，et al.Transgenic Res 1996 5(6)451～8；Page RL，et al.TransgenicRes 1995 4(6)353～60]。Collas P等在斑马鱼卵母细胞的细胞质转基因实验中证明用一种经典的NLS-SV40 T抗原与DNA形成复合物，可以提高转基因的整合率和进入细胞核的DNA量，增加染色质上整合位点[Collas P，et al.Transgenic Res 1998，7(4)303～9；Collas P，et al.TransgenicRes 1996 5(6)451～8]；传代跟踪检测，用这种方法转基因，外源基因进入种质系的比例从14％提高到43％(P＜0.01)。Page RL[Page RL，et al.Transgenic Res 1995 4(6)353～60]等用人工合成的多聚赖氨酸与DNA构件形成复合体，进行细胞质注射获得了转基因小鼠，其整合率为12.8％；而在细胞质只注射靶基因构件的对照组的小鼠整合率为零。通过原核注射获得的转基因小鼠整合率为21.7％(只注射了靶基因构件)。这些结果说明，核定位序列是能够以复合体形式将外源基因构件从细胞质带入细胞核的。
本发明的向动物细胞中转移外源基因的方法，包括使用靶基因构建靶基因表达载体；使用核定位蛋白基因构建核定位蛋白基因表达载体；以及将得到的靶基因表达载体和核定位蛋白基因表达载体共转染或共注射或电穿孔到培养细胞的细胞质中或动物受精卵细胞质中的步骤。
在本发明的方法中，所述的细胞可以是培养中的动物细胞，也可以是动物的受精卵。动物细胞的体外培养，可按常规方法进行[司徒镇强等.细胞培养.北京世界图书出版西安公司，(第一版)，1996年.58～84]。受精卵的获得按常规方法进行[Hogan B，et al.Manipulating the mouseembryo，A laboratory manual.Cold Spring Harbor，New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1986.89～175]。
所述的核定位蛋白基因表达载体是可以在真核细胞表达核定位蛋白的基因构件(DNA形式)。其编码序列可以是生物细胞天然序列，也可为人工合成的基因序列。其调控区在真核细胞具有调控编码序列表达的功能，可以是病毒基因序列，如CMV启动子、SV40启动子，也可为核定位蛋白基因本身的启动区序列，如H2A.z的promoter。所述的靶基因表达载体是具有特定调控区的目的或目标基因的表达单位或构件。可为重组载体或天然表达单位。这种载体可以是现有技术中已知的任何一种可以引导外源基因在动物细胞中表达的载体。
本发明的靶基因构件与动物核定位蛋白基因表达载体共转运的细胞质导入法，靶基因适用范围广泛，可用于a.真核类所有动物种类，如昆虫类、两栖类、鸟类、脊椎动物等；b.不同组织的体外培养细胞、肿瘤细胞；以及c.生殖细胞如受精卵、精子等。基因导入方式可以是试剂转染、电穿孔、显微注射等，只要被导入的基因溶液中含有核定位(信号)蛋白基因表达载体且被导入细胞质中，本方法均可促进外源基因在宿主染色体上的整合。在本发明的方法中，核定位蛋白是指一类具有趋核性迁移并在细胞核区定位的多肽或蛋白，存在于各种真核生物、病毒或为人工合成产物，如作用于核的激素、SV40大T抗原、人工合成的多聚赖氨酸，组蛋白等。组蛋白主要有H1、H2A、H2B、H3、H4、H2A.z等六种，推荐优先使用H2A.z作为核定位(信号)蛋白。组蛋白基因序列可以从GenBank中直接查阅。现给出实施例中所用的小鼠组蛋白基因H2A.z的GenBank的登录号码MMU 70494，NM 016750。
将靶基因表达载体(DNA)与核定位蛋白基因表达载体(DNA)共注射或共转染或电穿孔到受体细胞质中。先将靶基因表达载体与核定位蛋白基因表达载体分别用DNA纯化试剂盒纯化，再用琼脂糖凝胶电泳估算DNA浓度。靶基因表达载体与核定位蛋白基因表达载体的DNA分子按照10∶1～1∶5的分子数比例混合(推荐使用1∶1的分子数比例)，导入细胞质(共注射、共转染或电穿孔方式导入)。
在本发明的方法中，假孕鼠的制备和胚胎移植均按常规方法[HoganB，et al.Manipulating the mouse embryo，A laboratory manual.Cold SpringHarbor，New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1986.89～175]。
本发明的方法中，培养细胞被转染后可进行转染细胞的体外筛选，再进行相应研究，如细胞水平的研究和核移植、胚胎移植，直至首代转基因动物出生。对首代转基因动物可进行外源基因整合检测，按PCR-Southern杂交进行(张靖溥等.遗传学报，1999，26135～141)。
(ii)实验动物.昆明白小鼠。
(iii)基因构件与引物.核定位蛋白基因为小鼠H2AZ基因表达构件，其上游及下游调控区以及H2AZ基因的编码区均来自小鼠基因组文库的筛选，其cDNA序列的GenBank编号为MMU 70494和NM 016750。牛α-s1-casein-hG-CSF构件由牛α-s1-casein 5’调控元件2.2kb和3’调控序列2kb与人G-CSF基因组序列1.5kb拼接而成[Zhang J P，et al.Biotechnology Letters，2001(in press)]。用于bovine-α-s1-casein-hG-CSF构件的整合检测的引物序列为5’TCCTCTGACAAACCCTAC3’(GF1)和5’CATGCTGTTCCCTACCAC3’(GF2)。引物设计策略是上游引物位于牛α-s1-casein 5’promoter区域，下游引物位于目的基因区域，所得PCR产物跨越5’上游序列与目的基因的拼接位点。
(iv)转基因小鼠的制备.将靶基因表达构件牛α-s1-casein-hG-CSF(5.7kb)从质粒载体上用限制性内切酶KpnI和SacII切下(见
图1)，用DNA纯化试剂盒纯化DNA片段，并用琼脂糖凝胶电泳估算DNA浓度。H2AZ基因表达构件进行同样处理。这两种DNA片段按照1∶1的分子数比例混合，并按每一种DNA分子40拷贝/2pL每卵进行小鼠受精卵细胞质注射，再将经基因注射的胚胎移入假孕母体内，共移卵313枚，做为细胞质共注射实验组；对照组，只含同等浓度的靶基因构件牛α-s1-casein-hG-CSF，而不含H2AZ基因表达构件。移卵62枚；二者共移卵375枚。受精卵细胞核对照注射组也只注射同等浓度的转基因构件牛α-s1-casein-hG-CSF，注射方法同文献[Hogan B，et al.Manipulating the mouse embryo，Alaboratory manual.Cold Spring Harbor，New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1986.89～175]，移植220个注射卵到假母体内。
(v)基因组DNA的提取取小鼠尾尖1.5厘米长，按常规方法提取基因组DNA[Hogan B，et al.Manipulating the mouse embryo，A laboratorymanual.Cold Spring Harbor，New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1986.89～175]。用0.7％琼脂糖凝胶电泳检测总DNA的质量和浓度。进行PCR-Southern分析。
(vi)PCR-Southern杂交.转基因构件在小鼠染色体上的整合采用PCR-Southern杂交方法检测。以上述不同基因组合和不同注射途径的首代小鼠基因组DNA为PCR模板，每一组均含未进行基因注射的正常小鼠为阴性对照，转基因构件DNA片段为阳性对照模板。PCR反应系统按照试剂盒说明进行，每一反应含上游引物和下游引物各30pmol、DNA模板0.1ug。35个循环98℃ 500sec，58℃ 60sec，72℃ 60sec，94℃ 60sec。PCR产物为480bp。取15ul PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳、电转移至Nylon膜，进行常规Southern杂交(65℃)[Sambrook J，et al.1989.Molecular Cloning.A Laboratory Manual.(2nded).New York.Cold SpringHarbor Laboratory Press]。杂交探针为阳性模板的PCR片段，用α-P32-dATP随机引物法标记。
(vii)Western blot法检测靶基因在乳腺细胞的特异表达。收集分娩7天的首代小鼠的乳汁，每一乳样取50ul，用一倍体积的TBS缓冲液(137mM NaCl，20mM Tris，pH7.6)稀释，混匀，4℃离心12,000rpm 20分钟。取上清(乳清)储存于-20℃待用[张靖溥等.遗传学报，1999，26135～141；Simons J P，et al.Nature，1987，328530～532]。Westernblotting取5ul乳清与蛋白变性液[Sambrook J，et al.1989.MolecularCloning.A Laboratory Manual.(2nded).New York.Cold Spring HarborLaboratory Press]按1∶1混匀，煮沸5分钟，取4ul进行SDS-PAGE(12％)电泳，同时，以重组的人G-CSF蛋白(大肠杆菌产物)为阳性对照、未转基因的正常鼠乳为阴性对照，进行同样处理。电泳后，将SDS-PAGE凝胶上样品电转移至硝酸纤维素膜，用脱脂奶粉-TBS在4℃封闭过夜。用第一抗体兔抗人G-CSF多克隆抗体(1∶3000稀释于TBS-T溶液)与转移膜在室温下温育一小时。用TBS-T充分洗涤后，将膜与第二抗体羊抗兔IgG(H+L)-AP(1∶3000稀释)在室温下温育一小时。再次充分洗涤后，用BCIP/NBT染色液显色。结果与讨论1)卵细胞质注射与原核注射的出生率比较以原核注射为对照组，卵细胞质注射分为两个实验组(与mH2AZ共注射组和只注射靶基因表达构件组)，进行显微注射转基因，分别计算仔鼠的出生率。计算公式出生率(％)＝(出生仔数÷移植卵数)×100。卵细胞质注射组，共移卵375枚，出生仔数为133只。出生率为35.47％。其中，靶基因表达构件与mH2AZ表达载体共注射组移卵313枚，出生仔鼠数111只，出生率为35.46％；只有靶基因表达构件组移卵62枚，出生仔鼠22枚，出生率为35.48％。原核注射组共移卵220枚，出生仔数为25只。出生率为11.5％(图2)。
上述结果表明，卵细胞质注射组的出生率是原核注射的小鼠出生率的三倍以上，说明细胞质注射可以大大减少受精卵的损伤，增加转基因首代小鼠的出生率，即在一定程度上，可以提高获得转基因动物的机率，降低成本。在细胞质注射组中，共注射组与只注射靶基因构件组的出生率没有明显差异(分别为35.46％和35.48％)，说明mH2AZ表达载体对小鼠出生率没有影响。2)核定位蛋白基因与转基因的整合率为了验证核定位蛋白的促进外源基因整合功能，在细胞质注射实验中设制了不加mH2AZ表达载体的细胞质注射组做为对照。用PCR-Southern杂交方法检测牛α-s1-casein-hG-CSF基因构件在小鼠基因组的整合情况，所用PCR引物分别位于牛α-s1-casein 5’调控区和人G-CSF基因区。结果表明，含有mH2AZ表达载体的细胞质注射组，整合率为58％(29/50只)(图3a)；而不含mH2AZ表达载体的对照组，整合率为零(0/22只)(图3b)，但有一只小鼠在两次重复检测中有一次为阳性，判为可疑。原核注射对照组的整合率为17.4％。
上述结果说明核定位蛋白基因表达载体与靶基因构件的共注射具有促进外源基因在宿主染色体上整合的作用。完全可以替代原核注射方法来制备转基因动物。Page等[Page RL，et al.Transgenic Res 19954(6)353～60]用多聚赖氨酸与靶基因构件DNA片段形成复合体，进行细胞质注射获得了转基因小鼠，整合率为12.8％，而无NLS对照组的整合率为0％，原核注射对照为21.7％。其结果中除其细胞质注射的整合率低于本文结果外，其它两项与我们的结果相同或类似。不同点是本文所用核定位信号是哺乳类的mH2AZ，且以DNA形式进入细胞，推测mH2AZ表达载体先进行暂态表达，然后其蛋白产物携带靶基因载体进入核区，其转基因整合率是人工合成的NLS四倍以上。这可能是由于天然核定位信号更容易识别和携带DNA所致。其机理有待进一步研究。3)靶基因在小鼠乳汁中的的表达采用Western-blotting方法对小鼠乳汁中是否含有人G-CSF蛋白进行了检测。共检测了12只通过细胞质注射获得的整合阳性的雌鼠乳汁，其中9只可以表达人G-CSF蛋白。表达率达75％，初步估算表达水平在60-550mg/l乳清(图4)。
说明大多数转基因小鼠携带的转基因构件可以在乳腺细胞表达。另外，从上述结果可知，重组的人G-CSF蛋白分子量(约14kD)比小鼠乳汁中的人G-CSF蛋白分子量(约20kD)要小，这是由于前者为大肠杆菌的产物，是未经糖基化的分子形式；而后者可能是由于在真核细胞表达的经过了糖基化的后修饰所致(吴梧桐等，基因工程药物一基础与临床.北京人民卫生出版社，1996.169～171)。这也说明经乳腺细胞表达的蛋白与天然形式的蛋白结构很接近，因此其产品的活性和生理功能也更接近。此外，在正常乳汁中，还可以检到痕迹量的G-CSF蛋白，这在国际刊物上也有报道(Calhoun D A，et al.Pediatrics，2000，105e7；Goldman A S，etal.J Mammary Gland Biol Neoplasia，1996，1251～8；Juul S E，et al.PediatrRes，1999，46263～268；Kling P J，et al.Pediatr Res，1998，43216～221)，说明某些细胞因子在哺乳类的乳汁中确实存在。
综上所述，利用哺乳类核定位基因进行细胞质共注射制备转基因动物是一种简便、实用的技术。这种技术不仅易于掌握和普及，而且转基因的整合率和表达率也很可观。完全可以代替传统的受精卵原核注射方法，可以大大促进转基因动物相关领域的发展。
权利要求
1.一种向动物细胞中转移外源基因的方法，包括使用靶基因构建靶基因表达载体；使用核定位蛋白基因构建核定位蛋白基因表达载体；以及将得到的靶基因表达载体和核定位蛋白基因表达载体共转染或共注射或电穿孔到培养细胞的细胞质中或动物受精卵细胞质中的步骤。
2.按照权利要求1所述的方法，其中，所述的核定位蛋白是作用于核的激素、SV40大T抗原、人工合成的多聚赖氨酸，或者组蛋白等。
3.按照权利要求2所述的方法，其中，所述的组蛋白是H1、H2A、H2B、H3、H4、或者H2A.z。
4.按照权利要求3所述的方法，其中，所述的组蛋白是H2A.z。
5.按照权利要求1所述的方法，其中，靶基因表达载体与核定位蛋白基因表达载体的DNA分子比例为10∶1～1∶5。
6.按照权利要求1所述的方法，其中，靶基因表达载体与核定位蛋白基因表达载体的DNA分子比例为1∶1。
全文摘要
本发明提供了一种向动物细胞中转移外源基因的方法，包括使用靶基因构建靶基因表达载体；使用核定位蛋白基因构建核定位蛋白基因表达载体；以及将得到的靶基因表达载体和核定位蛋白基因表达载体共转染或共注射或电穿孔到培养细胞的细胞质中或动物受精卵细胞质中的步骤。
文档编号C12N15/64GK1400310SQ0112068
公开日2003年3月5日 申请日期2001年7月27日 优先权日2001年7月27日
发明者张靖溥, 李光三, 杜淼 申请人:中国科学院发育生物学研究所
文档序号 :
【 574455 】
技术研发人员：张靖溥,李光三,杜淼
技术所有人：中国科学院发育生物学研究所
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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