一种基于flc基因的萝卜抽薹特性鉴定方法
技术领域：
本发明涉及一种根据不同抽薹特性萝卜品种中凡c基因序列差异对植株抽薹特性 进行快速准确鉴定的方法。属于生物技术领域。
背景技术：
萝卜(i a; /zam^s油V^ L.)是起源于我国的一种重要世界性蔬菜，染色体2n=2x=18， 基因组大小约为526Mbp (汪隆植与何启伟，2005)。我国萝卜栽培历史悠久，其面积在 所有蔬菜作物中居第2位,在我国蔬菜生产与供应中占有重要的地位(中国农业统计资 料，中国农业出版社，2007)。萝卜不仅是人们重要的蔬菜作物，还具有很好的食疗保 健作用，近年来国内外研究发现，萝卜具抗癌防癌、防病毒、杀菌等功效。日本、朝鲜、 韩国、俄罗斯、乌克兰、印度、美国、德国、荷兰等国也都有大面积的栽培， 一直深受 世界人们喜爱。
长期以来，人们为选育适合不同栽培季节、不同用途的萝卜优良品种开展了广泛 研究。萝卜是十字花科萝卜属一、二年生草本植物，经过冬季低温处理后容易在春季抽 薹，导致萝卜肉质根品质与产量严重下降，造成了春季萝卜供应上的"春淡"现象。研 究实践表明，培育春季耐抽薹萝卜优良品种是解决春季萝卜供应严重不足的关键措施。 准确快速鉴定种质材料抽薹特性是培育晚抽薹萝卜优良品种的重要技术基础。但是传统 的萝卜抽薹特性鉴定方法是通过观察春化后植株的抽薹开花时期进行的，该方法费工费 时，使得抽薹特性准确鉴定成为限制萝卜春季耐抽薹优良品种选育进程的重要因素。
在模式植物拟南芥中研究发现，凡6tP/owen'"gZoc附C)基因编码MADS盒转录因 子，是一种依赖剂量效应的开花抑制剂(Sheldon等1999， 2000; He与Amasino 2005)。 Michaels与Amasino (1999)、 Sheldon等(1999, 2000)通过遗传分析发现，拟南芥
中凡C等位基因变化产生了早花和晚花生态型；显性FZC等位基因表现为晚花，隐性凡C 等位基因表现为早花。春化作用通过抑制春化途径开花植物中^!C基因的表达，使得植
物开花提前(Lee与Amasino， 1995)。
发明内容
技术问题
本发明的目的在于针对目前萝卜种质材料抽薹特性鉴定周期长、结果不稳定，从而 严重限制了春季耐抽薹优良品种选育进程的问题，研究提供一种新型快速准确的萝卜抽 薹特性鉴定方法。该方法显著提高了萝卜种质材料抽薹特性鉴定效率，縮短了春季耐抽 薹优良品种选育的时间，鉴定过程科学、迅速，鉴定结果准确、可靠。
技术方案
本发明利用本室克隆的不同抽薹特性萝卜品系中抽薹开花关键基因凡C的基因序列 差异与抽薹特性密切相关的特性，根据序列差异区域设计特异引物，以待检验的材料基 因组DNA为模板，在本发明的扩增条件下，经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离条带，出 现早抽薹特异性条带或晚抽薹特异性条带，据此迅速、准确可靠地鉴定待检植株的抽薹 特性。
本发明的技术方案中，各个步骤的技术关键包括
1、 萝卜幼苗的培育；
2、 萝卜基因组DNA提取；
(1 )取0.2g萝卜幼嫩叶片于研钵中，用液氮充分研磨成粉末，0.4mL/次分两次加入CTAB 裂解缓冲液，转移至2.0mL中，轻轻摇匀，于65'C水浴30分钟；
(2) 取出离心管，待管中溶液降至室温后，11200rpm离心8分钟，将上清液转入新 离心管中；
(3) 加入800pL氯仿异戊醇(体积比24: 1)，将离心管缓慢翻转几次，静置2分钟； 16°C， 11200rpm离心8min;
(4) 将上清液吸入新离心管中，加入70nL3.0M醋酸钠(pH5.2)与900pL预冷异丙 醇并缓慢翻转lmin，放于-2(TC冰箱4h;
(5) 8°C， 11200卬m，离心6分钟，倒掉上清液，加入200|aL预冷的70%乙醇清洗 DNA小团；
(6) 倒掉上清液，真空干燥，加100pL灭菌的TE缓冲液溶解DNA，质量体积比0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测质量；DNA用紫外分光光度计测定浓度后，再灭菌的lxTE缓冲液 或ddH20稀释至10ng L用于PCR扩增分析。3、化C基因特异引物设计与合成；
本发明用于鉴定萝卜植株抽薹性状的"C基因特异引物有两对，序列如下:
引物编号引物序列
NauFLC扁FlGCCAACCCATAGCTTCAACTT
NauFLC墨RlGAAGGGATATAAGAGGGGTAGAAG
NauFlX-F2TAGGCTTAAGAAAACTCAG
NauFLC國R2CGGAAACACAACTGGAATCTATGA
4、使用特异引物进行PCR扩增
PCR反应体系20pL，基因组DNA 20 ng， Mg2+ 1.5mmol.L"， dNTPs 0. 2 mmol.!/1, 正反引物各0.375nmoH/1， Taq酶1U; PCR扩增反应在热循环仪上进行，扩增程序为 94。C预变性3min; 94°C变性40S， 52。C退火50S， 72。C延伸70S， 35个循环；72。C延 伸8min。
5、 双垂直板非变性浓度为8%的聚丙烯酰胺凝胶对扩增产物进行电泳。扩增产物在 双垂直板浓度为质量体积比8%的非变性丙烯酰胺凝胶电泳，120V稳压电泳2. 5h，电泳 结束后进行体积比10%乙醇、质量体积比0. 5%冰乙酸固定15min;质量体积比0. 2%AgN03 溶液银染15min;银染后用质量体积比1.5%Na0H、质量体积比0. 4%甲醛、质量体积比 0.002。/。NaS203显色，待条带清晰可见后，可见灯箱下观察拍照。用引物对NauFLC-F1/ NauFLC-Rl扩增出的带型中，晚抽薹材料特异条带分子量为330bp，早抽薹材料特异条 带分子量为380bp;用引物对NauFLC-F2/NauFLC-R2扩增出的带型中，晚抽薹材料特 异条带分子量为250bp，早抽薹材料特异条带分子量为310bp。
6、 根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果对植株抽薹特性进行鉴定分析。将仅具有早抽薹 特异条带的植株鉴定为早抽薹单株，FZC基因位点纯合；仅具有晚抽薹特异条带的植株 鉴定为晚抽薹单株，F丄C基因位点纯合；同时具有早、晚抽薹特异条带的植株鉴定为晚 抽薹单株，ilC基因位点杂合。
有益效果
本发明课题组从不同抽薹特性萝卜品系中分离克隆出Z^7基因组DNA序列，进一 步分析发现来源于不同抽薹特性萝卜品系的凡C基因碱基序列存在显著差异，且该差异 性与抽薹特性密切相关。通过特异引物可以区分不同抽薹特性萝卜品系化C基因序列差 异，从而使得根据甩C基因序列特征可以准确快速判定不同材料的抽薹特性，大大提高了抽薹性状的鉴定效率，加速了萝卜晚抽薹优良品种的选育进程。
本发明利用早、晚抽薹特性萝卜品系中Fi:c基因组序列的差异性，设计特异引物， 通过PCR反应，分析萝卜植株FZC基因特异条带，据此快速准确地判断待检验的萝卜材
料的抽薹特性，结果稳定可靠，不受材料生长环境条件与发育时期影响，可以大大缩短 种质材料抽薹特性鉴定时间，在萝卜春季耐抽薹优良品种选育中具有良好的应用前景。
图1是实施例1的引物对NauFLC-Fl/NauFLC-Rl与NauFLC-F2/NauFLC-R2的非变性聚丙 烯酰胺凝胶电泳检测图
具体实施例方式
1. 萝卜幼苗的培育
待检验的萝卜材料种子用25'C水浸泡10min，使种子物理吸水饱满。取干净的培养 皿，底部铺一层湿润的滤纸，将种子均匀铺开，盖好皿盖，放入25'C的恒温箱中催芽， 24h后取出播种于穴盘中，置温室或塑料大棚中(昼/夜温度为25/15'C，自然光照)生 长。
2. 萝卜基因组DNA的提取
(1) 取(X2g左右萝卜幼嫩叶片于研钵中。用液氮充分研磨成粉末，分两次加入(0.4mL/ 次)CTAB裂解缓冲液，转移至2.0mL中，轻轻摇匀，于65'C水浴30分钟。
(2) 取出离心管，待管中溶液降至室温后，11200rpm离心8分钟，将上清液转入新 离心管中。
(3) 加入800nL氯仿异戊醇(体积比24: 1)，将离心管缓慢翻转几次，静置2分钟； 16°C， 11200rpm离心8min。
(4) 将上清液吸入新离心管中，加入7(HiL3.0M醋酸钠(pH5.2)与900pL预冷异丙 醇并缓慢翻转lmin，放于-2(TC冰箱4h。
(5) 8°C， 11200rpm，离心6分钟，倒掉上清液，加入200nL预冷的70%乙醇清洗 DNA小团。
(6) 倒掉上清液，真空干燥。力B lOO^L灭菌的TE缓冲液溶解DNA， 0.8%琼脂糖凝 胶电泳检测质量；DNA用紫外分光光度计测定浓度后，再灭菌的lxTE缓冲液或ddH2稀释至10ng/pL用于PCR扩增分析。
3. PCR特异引物设计和合成
本发明的用于鉴定萝卜植株抽薹特性的兄C基因特异引物有两对，序列如下
引物编号 引物序列
NauFLC-Fl GCCAACCCATAGCTTCAACTT
NauFLC-Rl GAAGGGATATAAGAGGGGTAGAAG
NauFLC-F2 TAGGCTTAAGAAAACTCAG
NauFLC-R2 CGGAAACACAACTGGAATCTATGA
4. PCR扩增及产物电泳
PCR反应体系20|nL，基因组DNA 20 ng， Mg2+ 1.5mmoH/1， dNTPs 0. 2 mmol.L-1， 正反引物各0. 375^unoK/1， Taq酶1U; PCR扩增反应在PTC-100热循环仪上进行，扩 增程序为94。C预变性3min; 94。C变性40S， 52。C退火50S， 72。C延伸70S， 35个循 环；72"延伸8min。
扩增产物在双垂直板浓度为8%的非变性丙烯酰胺凝胶电泳，120V稳压电泳2. 5h， 电泳结束后进行10%乙醇、0.5%冰乙酸固定15min; 0. 2。/。AgN03溶液银染15min;银染 后用1.5。/。Na0H、 0.4%甲醛、0.002%^5203显色，待条带清晰可见后，可见灯箱下观察拍 昭。
5. 萝卜植株抽薹特性分析
应用两对凡C基因特异引物进行扩增，经过8%非变性丙烯酰胺凝胶电泳后，能够出 现早、晚抽薹/^C基因特异条带。引物对NauFLC-Fl/NauFLC-Rl扩增出的带型中，晚 抽薹材料特异条带分子量为330bp，早抽薹材料特异条带分子量为380bp;引物对 NauFLC-F2/NauFLC-R2扩增出的带型中，晚抽薹材料特异条带分子量为250bp，早抽 薹材料特异条带分子量为310bp。将仅具有早抽薹特异条带的植株鉴定为早抽薹单株 (F丄C基因位点纯合)；仅具有晚抽薹特异条带的植株鉴定为晚抽薹单株(FZC基因位 点纯合)；同时具有早、晚抽薹特异条带的植株鉴定为晚抽薹单株(FZC基因位点杂合)。
8〈110〉 南京农业大学
<120〉 一种基于FLC基因的萝卜抽薹特性鉴定方法
〈130〉 说明书
<140> 00
<141〉 2009-06-02
〈160〉 4
<170〉 Patentln version 3. 1
〈210〉 1
〈211〉 21
<212> 腿
〈213〉 人工
〈220〉
<221> NauFLC-Fl
〈222〉 (1)..(21) 〈223>
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gccaacccat agcttcaact t 21
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<211〉 24
<212〉 DNA
〈213〉 人工 〈220〉
〈221〉 NauFLC-Rl
〈222〉 (1)..(24)<223〉
〈400〉 2
gaagggatat Ei卿ggggta gaag 24
<210> 3
〈211> 19
<212〉 腿
〈213〉 人工 <220>
<221〉 NauFLC-F2
<222> (1)..(19) 〈223〉
<400> 3
taggcttaag aaaactcag 19
<210〉 4
〈211〉 24
〈212〉 DNA
〈213〉 人工 <220〉
<221〉 NauFLC-R2
〈222〉 (1).. (24) 〈223〉
〈400〉 4
cggaaiacaca actggaatct atga 2权利要求
1、一种基于FLC基因的萝卜抽薹特性鉴定方法，其特征是用引物对NauFLC-F1/NauFLC-R1NauFLC，NauFLC-F1，GCCAACCCATAGCTTCAACTT；NauFLC-R1，GAAGGGATATAAGAGGGGTAGAAG；通过PCR扩增萝卜植株DNA检测萝卜植株FLC基因的抽薹类型，扩增出的晚抽薹特异DNA条带分子量为330bp，早抽薹特异DNA条带分子量为380bp；或者用引物对NauFLC-F2/NauFLC-R2，NauFLC-F2，TAGGCTTAAGAAAACTCAG；NauFLC-R2，CGGAAACACAACTGGAATCTATGA通过PCR扩增萝卜植株DNA检测萝卜植株FLC基因的抽薹类型，扩增出早抽薹特异DNA条带分子量为310bp，晚抽薹特异DNA条带分子量为250bp。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征为，根据权利要求1所述的PCR扩增结果，将仅具有早抽薹特异DNA条带的种质材 料判定为F￡C基因位点纯合的早抽薹单株，仅具有晚抽薹特异DNA条带的种质材料判 定为F丄C基因位点纯合的晚抽薹单株，同时具有早、晚两种抽薹特异DNA条带的种质 材料判定为FZC基因位点杂合的晚抽薹单株。
3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征为， 1)萝卜基因组DNA的提取(1 )取0.2g萝卜幼嫩叶片于研钵中，用液氮充分研磨成粉末，0.4mL/次分两次加入CTAB 裂解缓冲液，转移至2.0mL中，轻轻摇匀，于65"C水浴30分钟；(2) 取出离心管，待管中溶液降至室温后，11200rpm离心8分钟，将上清液转入新 离心管中；(3) 加入80(HiL体积比24: 1的氯仿异戊醇，将离心管缓慢翻转几次，静置2分钟； 16°C， 11200rpm离心8min;(4) 将上清液吸入新离心管中，加入70pL pH 5.2的3.0M醋酸钠与900[iL预冷异丙 醇并缓慢翻转lmin，放于-20。C冰箱4h;(5) 8°C， 11200rpm，离心6分钟，倒掉上清液，加入200pL预冷的70%乙醇清洗 DNA小团；(6)倒掉上清液，真空干燥，加lOOpL灭菌的TE缓冲液溶解DNA，质量体积比0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测质量；DNA用紫外分光光度计测定浓度后，再灭菌的lxTE缓冲液 或ddH20稀释至10ng/pL用于PCR扩增分析； 2) PCR扩增及产物电泳PCR反应体系20|aL，基因组DNA 20 ng, Mg2+ LSmmol.!/1, dNTPs 0.2mmol'L-1, 正反引物各0.375nmo1.1/1， Taq酶1U; PCR扩增反应在PTC-100热循环仪上进行，扩 增程序为94。C预变性3min; 94°C变性40S， 52。C退火50S， 72。C延伸70S， 35个循 环；72。C延伸8min;扩增产物在双垂直板浓度为质量体积比8%的非变性丙烯酰胺凝胶电泳，120V稳压 电泳2.5h，电泳结束后进行体积比10%乙醇、质量体积比0.5°/。冰乙酸固定15min;质 量体积比0. 2。/。AgN03溶液银染15min;银染后用质量体积比1. 5%NaOH、质量体积比0. 4% 甲醛、质量体积比0.002。/。NaS203显色，待条带清晰可见后，可见灯箱下观察拍照。
全文摘要
本发明涉及一种基于FLC基因的萝卜植株抽薹特性检测方法，属于生物技术领域。以早、晚抽薹特性萝卜品种中抽薹开花密切相关基因FLC序列的DNA差异为基础，设计两对特异引物NauFLC-F1/NauFLC-R1和NauFLC-F2/NauFLC-R2，利用PCR技术，对材料基因组DNA进行FLC基因特异扩增，根据电泳结果迅速准确判定检验材料属于早抽薹类型还是晚抽薹类型。本发明能够有效用于萝卜种质材料抽薹特性的鉴定，快速、准确、高效，可以显著加快春萝卜耐抽薹优良品种的选育进程。
文档编号C12Q1/68GK101597644SQ20091003289
公开日2009年12月9日 申请日期2009年6月5日 优先权日2009年6月5日
发明者姜立娜, 柳李旺, 翟璐璐, 黄丹琼, 龚义勤 申请人:南京农业大学
文档序号 :
【 572076 】
技术研发人员：柳李旺,黄丹琼,龚义勤,姜立娜,翟璐璐
技术所有人：南京农业大学
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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技术研发人员：柳李旺,黄丹琼,龚义勤,姜立娜,翟璐璐
技术所有人：南京农业大学
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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