热稳定天冬酰胺酶变体以及对其进行编码的多核苷酸的制作方法
[0106]对于已知结构的蛋白，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如， 蛋白的SC0P超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问的并且可下载的。 可以使用多种算法如距离比对矩阵（奥尔姆（Holm)和桑德（Sander)，1998,蛋白质 (Proteins) 33:88-96)或者组合延伸（Shindyalov和伯恩（Bourne) ,1998,《蛋白质工程》 11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具 有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物（例如，奥尔姆和帕克（Park)， 2000,《生物信息学》16:566-567)。
[0107] 在描述本发明的变体中，以下所述的命名法适于方便参考。使用公认的IUPAC单 字母或三字母氨基酸缩写。
[0108]取代。对于氨基酸取代，使用以下命名法:原始氨基酸、位置、取代的氨基酸。因此， 在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为"Thr226Ala"或者"T226A"。多个突变由加号 (" + "）分开，例如"Gly205Arg+Ser411Phe"或"G205R+S411F"代表分别在位置205和位置 411处甘氨酸（G)被精氨酸（R)取代，并且丝氨酸（S)被苯丙氨酸（F)取代。可替代地，可 以使用氨基酸取代的如下命名法：位置，取代的氨基酸。因此，在位置226处的苏氨酸被丙 氨酸取代表示为"226Ala"或"226A"。
[0109]缺失。对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、*。因此，在位置195 处的甘氨酸缺失表示为"Glyl95*"或者"G195*"。多个缺失可以由加号（" + "）分开，例如， "Glyl95*+Ser411*，，或 "G195*+S411*，，。
[0110] 插入。对于氨基酸插入，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入 的氨基酸。因此，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸被表示为"Glyl95GlyLys"或者 "G195GK"。多个氨基酸的插入被表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、 插入的氨基酸#2 ;等]。例如，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸被表示为 "Glyl95GlyLysAla" 或 "G195GKA"。
[0111] 在这类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的 氨基酸残基的位置编号中来对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中， 该序列因此将是：
[0112]
【主权项】
1. 一种天冬醜胺酶变体，该变体包括（i) W下取代中的一个或多个，其中每个位置都 对应于沈Q ID 側：2中的位置^71(：、1744、174(：、1(1224、1(1221?、￥1396、1'1400、1(19化、01976、 I228M、S238C、N239C、K240R、P241E、K253R、I258V、I258Y、R259C、R259V、S297V、S299A、 T314A、P33：3L、S334P、S334W、E337S、S338G、S338W、G35抓、K363R 或 E373H，或（ii)缺失，该 缺失位于对应于SEQ ID NO:2的位置27、28或29的一个或多个位置处；其中该变体与SEQ ID N0:2或4的任一个的成熟多肤具有至少80%序列一致性，并且其中该变体具有天冬醜 胺酶活性。
2. 如权利要求1所述的变体，该变体与SEQ ID NO: 2或4的任一个的成熟多肤具有至 少85%，例如至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%、但小于 100%的序列一致性。
3. 如权利要求1-2中任一项所述的变体，该变体相对于由SEQ ID NO:2编码的天冬醜 胺酶具有一种改进的热稳定性。
4. 如权利要求1-3中任一项所述的变体，该变体相对于由SEQ ID N0:6编码的天冬醜 胺酶具有一种改进的热稳定性。
5. 如权利要求1-4中任一项所述的变体，该变体是一种选自下组的亲本天冬醜胺酶变 体，该组由W下各项组成： a. -种与SEQ ID N0:2的成熟多肤具有至少60%序列一致性的多肤； b. -种由多核巧酸编码的多肤，该多核巧酸在低严谨度条件下与（i)SEQ ID N0:1的成 熟多肤编码序列，或（ii) (i)的全长互补体杂交； C. 一种由多核巧酸编码的多肤，该多核巧酸与SEQ ID N0:1的成熟多肤编码序列具有 至少60 %的一致性；W及 d.SEQ ID N0:2的成熟多肤的一个片段，该片段具有天冬醜胺酶活性。
6. 如权利要求1-5中任一项所述的变体，该变体在对应于SEQ ID NO: 2的位置70、290、 307、323、327、349、351或353的一个或多个位置处进一步包括取代。
7. 如权利要求6所述的变体，该变体包括W下取代中的一个或多个；N70K、K290V、 S307A、A323R、T327V、A349Q、S351A 或 V353I。
8. 如权利要求1-7中任一项所述的变体，其中该成熟多肤是氨基酸27至378。
9. 一种用于从食物材料生产食物产品的方法，该方法包括： a. 向该食物材料中添加如权利要求1-8中任一项所述的变体；并且 b. 加热该经酶处理的食物材料。
10. -种编码如权利要求1-8中任一项所述的变体的分离的多核巧酸。
11. 一种包括如权利要求10所述的多核巧酸的核酸构建体。
12. -种包括如权利要求10所述的多核巧酸的表达载体。
13. -种包括如权利要求10所述的多核巧酸的宿主细胞。
14. 一种生产天冬醜胺酶变体的方法，该方法包括： a. 在适合于表达该变体的条件下培养如权利要求13所述的宿主细胞；并且 b. 回收该变体。
15. -种用于获得天冬醜胺酶变体的方法，该方法包括在亲本天冬醜胺酶中引入W下 取代中的一个或多个，该亲本天冬醜胺酶与SEQ ID N0:2或4的任一个的成熟多肤具有 至少80%序列一致性，其中每个位置都对应于SEQ ID N0:2中的位置；T71C、T74A、T74C、 K122A、K122R、V139G、T140D、K194L、D197E、I228M、S238C、N239C、K240R、P241E、K253R、 I258V、I258Y、R259C、R259V、S297V、S299A、T314A、P333L、S3：MP、S334W、E337S、S338G、 S338W、G35抓、K363R或E373H，其中该变体具有天冬醜胺酶活性；并且回收该变体。
【专利摘要】本发明涉及天冬酰胺酶变体。本发明还涉及编码这些变体的多核苷酸；包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞；以及使用这些变体的方法。本发明进一步涉及一种生产发酵产品的方法，该方法包括：在本发明的天冬酰胺酶的存在下，用α-淀粉酶将含淀粉材料液化为糊精；用葡糖淀粉酶将该糊精糖化为糖，并且使用发酵生物发酵该糖。
【IPC分类】C12N9-82, A23L1-015, A23L1-217
【公开号】CN104540394
【申请号】CN201380042430
【发明人】松井知子, 富木亚纪, A·斯文森, H·V·亨德里克森, M·A·斯特林格, 绫部圭一
【申请人】诺维信公司
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2013年8月15日
【公告号】EP2884852A1, US20150210995, WO2014027062A1
文档序号 :
【 8209040 】
技术研发人员：松井知子,富木亚纪,A·斯文森,H·V·亨德里克森,M·A·斯特林格,绫部圭一
技术所有人：诺维信公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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