热稳定天冬酰胺酶变体以及对其进行编码的多核苷酸的制作方法
[0085] 中严谨度条件：术语"中严谨度条件"意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而 言，遵循标准DNA印迹程序，在42°C在5XSSPE、0. 3%SDS、200微克/ml剪切和变性的鲑精 DNA和35%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0. 2%SDS， 在55 °C下洗涤三次，每次15分钟。
[0086] 中-高严谨度条件：术语"中-高严谨度条件"意指对于长度为至少100个核苷酸 的探针来说，遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5XSSPE、0. 3%SDS、200微克/毫升剪切 并变性的鲑鱼精子DNA以及或者35%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终 使用2XSSC、0. 2%SDS，在60°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0087] 突变体：术语"突变体"意指编码一种变体的多核苷酸。
[0088] 核酸构建体：术语"核酸构建体"意指单链-或双链核酸分子，其分离自天然存在 的基因，或其被修饰成以本来在自然界中不存在的方式含有核酸的区段，或其为合成的，其 包含一个或多个控制序列。
[0089]可操作地连接：术语"可操作地连接"意指一种配置，其中一个控制序列相对于一 种多核苷酸的编码序列放置在一个适当位置处，以使得控制序列指引编码序列的表达。
[0090] 亲本或亲本天冬酰胺酶：术语"亲本"或"亲本天冬酰胺酶"意指一种天冬酰胺酶， 对该天冬酰胺酶进行一种改变以产生本发明的酶变体。亲本可以是天然存在的（野生型） 多肽或其变体或片段。
[0091] 序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数"序列 一致性"描述。
[0092] 出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套件 (TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite)，赖斯（Rice)等人，2000,遗 传学趋势（TrendsGenet.) 16:276-277)(优选5. 0? 0版或更新版本）的尼德尔（Needle) 程序中所实施的尼德尔曼-翁施（Needleman-Wunsch)算法（尼德尔曼（Needleman)和 翁施（Wunsch)，1970,分子生物学杂志（J.Mol.Biol.)48:443-453)来测定两个氨基酸 序列之间的序列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分〇. 5,以及 EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本）取代矩阵。标记为"最长一致性"的尼德尔的输出 (使用_非简化（nobrief)选项获得）被用作百分比一致性并且被计算如下：
[0093](一致的残基X 100V(比对长度-比对中的空位总数）
[0094] 出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套件， 赖斯等人，2000,同上）（优选5. 0. 0版或更新版本）的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁 施算法（尼德尔曼和翁施，1970,同上）来测定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致 性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分〇. 5以及EDNAFULL(NCBINUC4. 4的 EMBOSS版本）取代矩阵。标记为"最长一致性"的尼德尔的输出（使用-非简化选项获 得）被用作百分比一致性并且被计算如下：
[0095](一致的脱氧核糖核苷酸X 100V(比对长度-比对中的空位总数）
[0096]子序列：术语"子序列"意指使一个或多个（例如，若干个）核苷酸从成熟多肽编 码序列的5'端和/或3'端缺少的多核苷酸；其中该子序列编码具有天冬酰胺酶活性的一 个片段。在一个方面中，子序列包含至少900个核苷酸、至少975个核苷酸或至少1050个 核苷酸。
[0097] Tm:在本发明的上下文中，术语"Tm"（解链温度）意指对应于温度自记曲线的信号 的尖端的温度，如通过差示扫描量热法0SC)所测量，使用20mM乙酸钠（pH5.0)作为透析 缓冲液。优选地，如实例7地进行DSC。Tm(解链温度）也可以被称为Td(热变性温度）。
[0098] 变体：术语"变体"意指具有天冬酰胺酶活性的、在一个或多个（例如，若干个）位 置处包含改变（即，取代、插入和/或缺失）的一个多肽。取代意指占据一个位置的氨基酸 替换不同的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指在邻接并且紧随 占据一个位置的氨基酸之后添加一个氨基酸。本发明的这些变体具有SEQIDN0:2的成熟 多肽的至少20 %，例如至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至 少95%或至少100%的天冬酰胺酶活性。
[0099] 非常高严谨度条件：术语"非常高严谨度条件"是指对于长度为至少100个核苷酸 的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5XSSPE、0. 3%SDS、200微克/ml剪切并 变性的鲑鱼精子DNA和50%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0. 2%SDS，在70°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0100] 非常低严谨度条件：术语"非常低严谨度条件"是指对于长度为至少100个核苷酸 的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5XSSPE、0. 3%SDS、200微克/ml剪切并 变性的鲑鱼精子DNA和25%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0. 2%SDS，在45°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0101] 野生型天冬酰胺酶：术语"野生型"天冬酰胺酶意指由见于自然界中的一种天然存 在的微生物（如一种细菌、酵母或丝状真菌）表达的一种天冬酰胺酶。
[0102] 变体命名惯例
[0103] 出于本发明的目的，将SEQIDN0:2中披露的成熟多肽用以确定另一种天冬酰胺 酶中的对应的氨基酸残基。将另一种天冬酰胺酶的氨基酸序列与SEQIDN0:2中披露的 成熟多肽进行比对，并且基于该比对，使用如在EMBOSS包（EMBOSS:欧洲分子生物学开放软 件套件，赖斯等人，2000,遗传学趋势16:276-277)(优选5. 0. 0版或更新版本）的尼德尔程 序中所实施的尼德尔曼-翁施算法（尼德尔曼和翁施，1970,分子生物学杂志48:443-453) 来确定与SEQIDN0:2中所披露的成熟多肽中的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编 号。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分〇. 5,以及EBL0SUM62(BL0SUM62的 EMBOSS版本）取代矩阵。
[0104] 可以通过使用若干计算机程序、使用其对应默认参数比对多个多肽序列来确定在 另一种天冬酰胺酶中的相应氨基酸残基的鉴别，所述计算机程序包括但不限于MUSCLE(通 过对数预期的多种序列比较；版本3. 5或更新版本；埃德加（Edgar)，2004,核酸研究 (NucleicAcidsResearch)32:1792_1797)、MAFFT(版本 6.857 或更新版本；加藤（Katoh) 和库马（Kuma)，2002,核酸研究30:3059-3066 ;加藤等人，2005,核酸研究33:511-518 ; 加藤和都（Toh)，2007,生物信息学（Bioinformatics) 23:372-374 :加藤等人，2009,分子 牛物学方法（MethodsinMolecularBiol〇gv)537:39-64:加藤和都，2010,牛物信息学 26:1899-1900)、以及采用ClustalW(l. 83或更新版本；汤姆斯（Thompson)等人，1994,核酸 研究 22:4673-4680)的EMBOSSEMMA。
[0105] 当其他天冬酰胺酶与SEQIDN0:2的成熟多肽相分歧使得传统的基于序列的比较 方法不能检测其相互关系时（林达尔（Lindahl)和埃洛弗松（Elofsson)，2000,分子生物学 杂志295:613-615)，可以使用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中的更大灵敏度 可以使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表示（特征曲线）来搜索数 据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离 同源物（阿特休尔（Atschul)等人，1997,《核酸研究》2
文档序号 :
【 8209040 】
技术研发人员：松井知子,富木亚纪,A·斯文森,H·V·亨德里克森,M·A·斯特林格,绫部圭一
技术所有人：诺维信公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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