热稳定天冬酰胺酶变体以及对其进行编码的多核苷酸的制作方法
[0052](b)从该植物提取物生产糖蜜；
[0053](c)稀释该糖蜜；并且
[0054] ⑷用发酵生物发酵该稀释的糖蜜，以生产乙醇。
[0055] 本发明还涉及一种生产发酵产品的方法，包括
[0056] (a)用本发明的天冬酰胺酶处理一种含一种或多种氨基酸以及一种或多种可溶性 糖的植物提取物；并且
[0057] (b)用发酵生物发酵该处理的植物提取物，以生产该发酵产品。
[0058] 本发明还涉及一种生产糖的方法，包括
[0059](a)用本发明的天冬酰胺酶处理一种含一种或多种氨基酸以及一种或多种可溶性 糖的植物提取物；并且
[0060](b)从该处理的植物提取物中回收该糖。
[0061] 本发明还涉及一种生产蔗糖的方法，包括
[0062](a)用本发明的天冬酰胺酶处理一种含一种或多种氨基酸以及一种或多种可溶性 糖的植物提取物；
[0063] (b)澄清该植物提取物；
[0064] (c)浓缩发现于该澄清的植物提取物中的糖（例如，通过蒸发），以形成含蔗糖的 浆液；
[0065] (d)从该浆液中结晶蔗糖；并且
[0066] (e)回收蔗糖。
[0067] 定义
[0068]a-淀粉酶（a1，4-葡聚糖4葡聚糖水解酶，EC3. 2. 1. 1)是催化淀粉以及其他直 链和支链1，4葡糖苷寡糖和多糖的水解的一组酶。
[0069]天冬酰胺酶：术语"天冬酰胺酶"意指具有天冬酰胺酶活性的酶，即催化天冬酰胺 水解为天冬氨酸的酶（EC3.5. 1.1)。可以根据描述于实例中的天冬酰胺酶活性测定之一 (例如，通过ASNU测定）确定天冬酰胺酶活性。在一个方面中，本发明的变体具有SEQID NO:2的成熟多肽的至少20%，例如至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、 至少90%、至少95%或至少100%的天冬酰胺酶活性。
[0070] 等位基因变体：术语"等位基因变体"意指占用同一染色体位点的一种基因的两个 或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多 态性。基因突变可以是静默的（在所编码的多肽中没有改变）或可编码具有改变的氨基酸 序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
[0071]CDNA:术语"CDNA"是指可以通过得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子 的反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先 的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤 进行加工，包括剪接。
[0072]编码序列：术语"编码序列"意指一种多核苷酸，该多核苷酸直接规定了一种变体 的氨基酸序列。编码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起 始密码子（如ATG、GTG或TTG)开始并且以一个终止密码子（如TAA、TAG或TGA)结束。编 码序列可以是一种基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
[0073]控制序列：术语"控制序列"意指为编码本发明的一种变体的一种多核苷酸的表达 所需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是原生（native)的 (即，来自相同基因）或外源的（即，来自不同基因），或相对于彼此是原生的或外源的。此 类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转 录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些 控制序列与编码一种变体的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控 制序列可以提供有多个接头。
[0074]表达：术语"表达"包括涉及一种变体的产生的任何步骤，包括（但不限于）转录、 转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。
[0075]表达载体：术语"表达载体"意指一种直链或环状DNA分子，该分子包括编码一种 变体的一种多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
[0076] 片段：术语"片段"意指在一种成熟多肽的氨基和/或羧基末端不存在一个或多个 (例如若干个）氨基酸的一种多肽；其中该片段具有天冬酰胺酶活性。在一个方面中，一个 片段包含至少300个氨基酸残基、至少325个氨基酸残基或至少350个氨基酸残基。
[0077]葡糖淀粉酶（葡聚糖1，4-a-葡糖苷酶，EC3. 2. 1. 3)是催化末端（1 - 4)-连接 的a-D-葡萄糖残基依次从链的非还原端水解并释放3-D-葡萄糖的一组酶。
[0078] 高严谨度条件：术语"高严谨度条件"是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而 言，遵循标准DNA印迹（Southernblotting)程序，在 42°C下在 5XSSPE、0.3%SDS、200 微 克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料 最终使用2XSSC、0. 2%SDS，在65°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0079] 宿主细胞：术语"宿主细胞"意指易于用包括本发明的一种多核苷酸的一种核酸构 建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语"宿主细胞"涵盖由于复制 期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
[0080] 改进的特性：术语"改进的特性"意指与一种变体相关的相对于亲本有所改进的特 征。此类改进的特性包括但不限于，催化效率、比活性、底物结合、储存稳定性、化学稳定性、 氧化稳定性、最适温度、最适pH、pH稳定性、较低的产物抑制、离子（例如，NaCl)存在下的 活性、糖或糖醇（例如，木糖醇）存在下的活性、四聚体稳定性以及热稳定性。
[0081] 分离的：术语"分离的"意指在自然界中不存在的一种形式或环境中的一种物质。 分离的物质的非限制性实例包括（1)任何非天然存在的物质；(2)至少部分地从与其在自 然界中相关联的一种或多种或全部天然存在的组分中除去的任何物质，包括但不局限于任 何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于自然界中发现的那种物质通过人工手动 修饰的任何物质；或者（4)通过相对于与其天然相关联的其他组分增加该物质的量而修饰 的任何物质（例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的 启动子更强的启动子的使用）。一种分离的物质可以存在于发酵液样品中。
[0082] 低严谨度条件：术语"低严谨度条件"意指对于长度为至少100个核苷酸的探针 来说，遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5XSSPE、0. 3%SDS、200微克/毫升剪切并变性 的鲑鱼精子DNA和25%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、 0. 2%SDS，在50°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0083] 成熟多肽：术语"成熟多肽"意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末 端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一个方面中，基于预测 SEQIDN0:2的氨基酸1至19是信号肽的SignaIP(尼尔森（Nielsen)等人，1997,蛋白质 工程（ProteinEngineering) 10:1-6)，成熟多肽是SEQIDN0:2 的氨基酸 20 至 378。在一 个优选方面中，基于N-末端测序，成熟多肽是SEQIDN0:2的氨基酸27至378。在另一个 方面中，基于N-末端测序，成熟多肽是SEQIDN0:2的氨基酸27-378、30-378、75-378或 80-378。在另一个方面中，成熟多肽是SEQIDN0:2的氨基酸80-378。本领域中已知的是， 一个宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽（即，具有不同 C-末端和/或N-末端氨基酸）的混合物。
[0084] 成熟多肽编码序列：术语"成熟多肽编码序列"意指编码具有天冬酰胺酶活性的成 熟多肽的一种多核苷酸。在一个方面中，基于预测SEQIDNO: 1的核苷酸1至57编码信号 肽的SignalP(尼尔森（Nielsen)等人，1997,同上），成熟多肽编码序列是SEQIDNO: 1的 核苷酸58至1134。在一个优选方面中，基于编码的天冬酰胺酶的N-末端测序，成熟多肽编 码序列是SEQIDNO: 1的核苷酸79至1134。在另一个方面中，基于编码的天冬酰胺酶
文档序号 :
【 8209040 】
技术研发人员：松井知子,富木亚纪,A·斯文森,H·V·亨德里克森,M·A·斯特林格,绫部圭一
技术所有人：诺维信公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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