一种大量分离天然甜味剂三叶苷的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于单体分离技术领域，尤其涉及一种大量分离天然甜味剂三叶苷的方 法。
【背景技术】
[0002] 甜味剂是指赋予食品或饲料以甜味，提高食品品质，满足人们对食品需求的食物 添加剂。甜味剂一般具有安全性高、引起味觉良好、稳定性高、水溶性好等优点。为改善食 品、药品的口感，很多物品都要加入适量的甜味剂。而蔗糖是最常用的甜味剂，但蔗糖是含 有最高热值的碳水化合物，过量摄入会引起肥胖、动脉硬化、高血压、糖尿病以及龋齿等疾 病。因此积极寻找和开发新的甜味剂资源成为科学家们的重要研宄方向。
[0003] 随着研宄的不断深入，以甜菊糖苷、甘草甜素为代表的天然甜味剂得到了长足的 发展。近年来，另外一种天然甜味剂成分一一三叶苷也相继被研宄和开发，它主要来源于壳 斗科植物多穗柯甜茶Lithocarpus pachyphyllus(Kurz)Rehd.，结构式如下：
[0004]
[0005] 《一种含三叶苷的活性分离物及其用途》（申请号CN101874824A)报道了一种高含 量三叶苷活性分离物具有治疗糖尿病、糖尿病肾病和肝水肿等疾病。《包含苦味阻断剂的含 苦味生物碱的消费品》（申请号CN102065707A)报道了三叶苷能降低和阻断由咖啡碱、茶碱 和可可碱等苦味生物碱引起的苦味。随着科技的发展，三叶苷的用途会不断拓展，但对于这 样一个优良的天然甜味剂，应该如何大量制备分离，目前国内外未见报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种大量分离天然甜味剂三叶苷的方法，旨在解决现有天 然甜味剂分离效率较低、未能实现大量制备分离的问题。
[0007] 本发明是这样实现的，本发明提供一种大量分离天然甜味剂三叶苷的方法，包括 如下步骤：
[0008] (1)将粉碎后的三叶苷原料以固液质量比1 :10~50加入体积分数为30~90% 的乙醇，加热回流分离，分离液过滤，分离出滤渣和滤液；
[0009] (2)将滤渣按步骤（1)所述分离方法重复分离2次，合并滤液，减压浓缩至无醇味， 得分离物；
[0010] (3)将1质量份步骤⑵中的分离物加入100质量份水溶解，并用乙酸乙酯萃取， 萃取液减压浓缩得乙酸乙酯浸膏；
[0011] (4)将所述步骤（3)中的乙酸乙酯浸膏采用高速逆流色谱法分离得到天然甜味 剂；其中，高速逆流色谱法中的溶剂系统由正己烷、乙酸乙酯、乙醇和水按体积比1 :6 :2~ 3 :6组成，该溶剂系统的上相为固定相，下相为流动相。
[0012] 优选地，所述三叶苷原料包括多穗柯甜茶。
[0013] 优选地，所述的高速逆流色谱分离过程中，主机转速750~850rpm/min，流动相流 速为 1. 5 ~2. 5mT ,/mi η 〇
[0014] 相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：
[0015] (1)本发明分离方法简便、快捷，分离周期短。传统的柱色谱方法操作繁琐，需要反 复的进行柱层析分离，分离周期长，一般需要几个月的时间。采用本方法，只需3~4天即 可，大大缩短了分离时间。
[0016] (2)本发明单体制备量大。根据所需三叶苷的质量，可以调节被分离样品的进样 量，制备型高速逆流色谱仪一次性可以分离出几百毫克甚至克级的三叶苷。
[0017] (3)本发明分离出的三叶苷单体化合物具有多种药理活性，在保健食品和药品领 域具有广阔的应用前景，本方法提供了实现天然甜味剂三叶苷产业化制备的物质基础。
【附图说明】
[0018] 图1为本发明实施例1中高速逆流色谱分离三叶苷的色谱图；
[0019] 图2为本发明实施例1中分离到的三叶苷的高效液相检测图。
【具体实施方式】
[0020] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。
[0021] 本发明提供一种大量分离天然甜味剂三叶苷的方法，包括如下步骤：
[0022] (1)制备多穗柯甜茶提取物：
[0023] 取经干燥的多穗柯甜茶叶，样品经粉碎机粉碎。称取多穗柯甜茶粉末，加入10~ 50倍重量的体积分数为30~90%的乙醇溶液中，回流提取2~4h，过滤；将滤渣重复上述 步骤，再提取2次，合并滤液，减压浓缩至浸膏状，得多穗柯甜茶提取物。
[0024] (2)提取物的进一步纯化：
[0025] 将上述步骤制得的多穗柯甜茶提取物加适量水混悬后，放入分液漏斗中，同时加 入乙酸乙酯进行萃取，萃取3次，收集乙酸乙酯萃取液，减压浓缩干燥，即得乙酸乙酯粗分 离物。
[0026] (3)高速逆流色谱分离乙酸乙酯萃取物中的三叶苷：
[0027] A、溶剂系统和样品溶液的配制
[0028] 在分液漏斗中配制正己烷：乙酸乙酯：乙醇：水两相溶剂体系，其体积比为1 :6 : 2~3 :6,充分振摇后在室温下静置过夜。使用前分别取分液漏斗中的上相作为HSCCC的固 定相，下相作为HSCCC的流动相，超声脱气30min。取步骤（2)中的乙酸乙酯萃取物，用相同 体积的上相和下相溶解样品，备用。
[0029] B、高速逆流色谱分离制备过程
[0030] 首先将溶剂系统的上相注入高速逆流色谱仪分离管中，待上相充满整个管路后调 整主机转速750~850rpm/min，再以1. 5~2. 5mL/min流速泵入下相，待流动相从柱出口 流出，两相在分离管中达到动态平衡后，由进样阀注入a中的样品溶液。在280nm波长下检 测，记录色谱图，根据色谱图收集三叶苷流分。
[0031] C、三叶苷的分析和鉴定
[0032] 使用高效液相色谱对b中分离得到的三叶苷流分进行纯度检测：应用Hypersil C18色谱柱，甲醇-水（20 :80，v/v)为流动相等度洗脱，检测波长280nm，测得三叶苷流分为 单一峰，纯度高于98 % ;使用IH NMR和13C NMR对三叶苷流分进行结构鉴定，核磁数据见 表1。
[0033] 表 1 三叶苷的 IH NMR 和 13C NMR 数据（DMS0-d6)
[0034]
[0035]
[0036] 更具体如下实施例所述。
[0037] 实施例1
[0038] (1)制备多穗柯甜茶提取物：
[0039] 取经干燥的多穗柯甜茶叶，样品经粉碎机粉碎。称取多穗柯甜茶粉末500g，加入 20倍重量的体积分数为50%的乙醇溶液中，回流提取3h，过滤；将滤渣重复上述步骤，再提 取2次，合并滤液，减压浓缩至浸膏状，得多穗柯甜茶提取物45. 6g。
[0040] (2)多穗柯甜茶提取物的进一步纯化：
[0041] 取步骤（1)制得的多穗柯甜茶提取物20g加适量水混悬后，放入分液漏斗中，同时 加入乙酸乙酯进行萃取500mL，萃取3次，收集乙酸乙酯萃取液，旋转蒸发减压浓缩干燥，即 得乙酸乙酯萃取物8. 3g。
[0042] (3)高速逆流色谱分离乙酸乙酯粗分离物中的三叶苷：
[0043] a.溶剂系统和样品溶液的配制
[0044] 在分液漏斗中配制正己烷：乙酸乙酯：乙醇：水两相溶剂体系，其体积比为1 :6 : 2 :6,振摇30s后在室温下静置过夜。使用前分别放出上相和下相，使用超声波提取器脱气 30min。取步骤（2)中的乙酸乙醋萃取物130mg，用相同5mL的上相和5mL的下相溶解样品， 备用。
[0045] b.高速逆流色谱分离制备过程
[0046] 首先将溶剂系统的上相快速（9. 99mL/min)注入高速逆流色谱仪分离管中，待上 相充满整个管路后调整主机转速850rpm/min，再以I. 5mL/min流速泵入下相，待流动相从 柱出口流出，两相在分离管中达到动态平衡后，由进样阀注入a中的样品溶液。在280nm波 长下检测，记录色谱图，根据色谱图收集三叶苷流分。高速逆流色谱图见图1。
[0047] c.三叶苷的分析和鉴定
[0048] 使用高效液相色谱对b中分离得到的三叶苷流分进行纯度检测：应用Hypersil C18色谱柱，甲醇-水（20 :80，v/v)为流动相等度洗脱，检测波长280nm，测得三叶苷流分为 单一峰，纯度高于98. 4%，高效液相色谱检测图见图2。
[0049] 实施例2
[0050] (1)制备多穗柯甜茶提取物：
[0051] 取经粉碎机粉碎的多穗柯甜茶粉末200g，加入50倍重量的体积分数为70%的乙 醇溶液中，回流提取2. 5h，过滤；将滤渣重复上述步骤，再提取2次，合并滤液，减压浓缩至 浸膏状，得多穗柯甜茶提取物21. 4g。
[0052] (2)多穗柯甜茶提取物的进一步纯化：
[0053] 取步骤（1)制得的多穗柯甜茶提取物IOg加适量水混悬后，放入分液漏斗中，同时 加入乙酸乙酯进行萃取400mL，萃取3次，收集乙酸乙酯萃取液，旋转蒸发减压浓缩干燥，即 得乙酸乙酯萃取物4. 2g。
[0054] (3)高速逆流色谱分离乙酸乙酯萃取物中的三叶苷：
[0055] 高速逆流色谱分离乙酸乙酯萃取物中的三叶苷，具体操作方法详见实例1。使用体 积比为1 :6 :3 :6的正己烷：乙酸乙酯：乙醇：水溶剂系统，在主机转速为800rpm/min，流速 为I. 8mL/min，检测波长为280nm条件下，从95mg乙酸乙醋粗分离物中经高速逆流色谱分离 得到纯度为98. 7 %的三叶苷31. 4mg。
[0056] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种大量分离天然甜味剂三叶苷的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 将粉碎后的三叶苷原料以固液质量比1 :1〇~50加入体积分数为30~90%的乙 醇，加热回流分离，分离液过滤，分离出滤渣和滤液； (2) 将滤渣按步骤（1)所述分离方法重复分离2次，合并滤液，减压浓缩至无醇味，得分 离物； (3) 将1质量份步骤（2)中的分离物加入100质量份水溶解，并用乙酸乙酯萃取，萃取 液减压浓缩得乙酸乙酯浸膏； (4) 将所述步骤（3)中的乙酸乙酯浸膏采用高速逆流色谱法分离得到天然甜味剂；其 中，高速逆流色谱法中的溶剂系统由正己烷、乙酸乙酯、乙醇和水按体积比1 :6 :2~3 :6组 成，该溶剂系统的上相为固定相，下相为流动相。2. 如权利要求1所述的大量分离天然甜味剂三叶苷的方法，其特征在于，所述三叶苷 原料包括多穗柯甜茶。3. 如权利要求2所述的大量分离天然甜味剂三叶苷的方法，其特征在于，所述的高速 逆流色谱分离过程中，主机转速750~850rpm/min，流动相流速为1. 5~2. 5mL/min。
【专利摘要】本发明提供了一种大量分离天然甜味剂三叶苷的方法，通过将粉碎后的三叶苷原料以固液质量比1：10～50加入体积分数为30～90％的乙醇，加热回流分离，分离液过滤，分离出滤渣和滤液，将滤液减压浓缩至无醇味，得分离物；将分离物加水溶解，并用乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩得乙酸乙酯浸膏；将乙酸乙酯浸膏采用高速逆流色谱法分离，得到天然甜味剂。本发明分离方法简便、快捷，分离周期短，单体制备量大，且单体具有多种药理活性。
【IPC分类】C07H15/203, C07H1/08
【公开号】CN104974201
【申请号】CN201510358050
【发明人】孙印石, 张玉伟
【申请人】中国农业科学院特产研究所
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年6月25日
文档序号 :
【 9257321 】
技术研发人员：孙印石,张玉伟
技术所有人：中国农业科学院特产研究所
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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技术研发人员：孙印石,张玉伟
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