具有新Rht-B1等位基因的小麦的制作方法
[0164] Rht-Blc等位基因中的矮化突变归因于Maringa的Rht-Bl基因中的2026bp插入 物（Wu等，2011)。PCR测试揭示400株经筛选突变体植物中约一半对该基因中插入物的存 在呈阳性；这些植物均已保留了 Rht-Bl基因。剩余的经筛选植物对PCR测定呈阴性并且似 乎全部缺乏Rht-Bl基因，但是根据阳性PCR扩增产物，仍然存在由D基因组（Rht-Dl)编码 的同源基因。在该后一组中，有很多具有不同的形态学改变和差的穗（spike)能育性。他 们可能表示Rht-Bl基因以及不同量的侧翼染色体DNA缺失。对这些缺失品系不进行进一 步研宄。
[0165] 通过用PCR扩增基因区域来对139个各非缺失突变体中的Rht-Bl基因进行测序。 鉴定出35个新的衍生Rht-Blc等位基因，每一个均为Maringa中Rht-Blc等位基因的变 体。将这些命名为Rht-Blc. 1、Rht-Blc. 2、Rht-Blc. 3等。将它们列于表3中。35个等位 基因中的很多由包含相同特异性突变的多个品系表示。在一些情况下，这些多个品系可以 是同胞，而在另一些情况下，他们必须表示独立的突变事件。总共有62个独立事件，产生了 35个等位基因。
[0166] 这些突变体呈现出导致过度生长表型的三种不同类别的突变。在第一类别中，10 个等位基因包含Rht-Bl基因中的提前翻译终止密码子。在大多数情况下，突变体密码子为 从TGG密码子（编码Trp)变成TGA密码子（终止密码子）。在大麦中，DELLA中的提前终 止密码子导致伸长的细长表型和雄性不育。相比之下，除一个例外，这10个突变体小麦品 系的植物均生长至与高（野生型）等位基因系（isoline)相同或接近其的高度，并且示出 与野生型类似的能育性。可推测，那些突变体中A和/或D基因组Rht-I蛋白的表达为B 基因组无效突变基因提供了遗传补偿，并将表型表达限制在"高"而非"细长"。那个例外， 唯一的Rht-Blc. 22代表的植物（品系TR544)为半矮化的而非"高"。该表型可能归因于对 这些植物中突变的Rht-Blc. 22基因的剪接发生了改变，从而产生具有不同框内插入物的 Rht-Bl蛋白（下文所讨论的）。
[0167] 第二类别包括对B基因组编码的Rht-Bl蛋白的氨基酸替换。20个实例列于表3 中。关注将这20个替换与大麦中分离的DELLA替换突变体进行比较（实施例5)，参见图 3。在这两个物种中，存在31个单氨基酸替换，包括其中发生相同氨基酸改变的四个位点。 还注意到，尽管是独立的，但是在大麦和小麦内均出现了相同的突变，其中发现该相同突变 位于衍生自仏谷粒不同亚群的品系中的对应位置。
[0168] 图3示意性地示出了突变体中相对于大麦和小麦蛋白质C端区域中保守基序位置 的氨基酸替换位点。观察结果，过度生长突变分布在整个C端区域的部分，表明具有相当大 的可能性改变了 DELLA蛋白与相互作用蛋白质伴侣的结合。
[0169] 第三类的突变体包括5个等位基因，各个等位基因均包含对Rht-Bl区的突变，预 测该突变涉及切除大部分Rht-Bl基因中产生Rht-Blc等位基因的插入物（表3)。这些等 位基因都影响直接邻近于剪接供体和受体位点的四个核苷酸之一。在包括Rht-Blc. 22等 位基因的一些情况下，并基于使用的剪接预测软件，这些序列改变潜在地改变剪接的优选 位点，从而产生具有稍微更大或更小框内插入物的Rht-Bl蛋白。推测这些剪接等位基因产 生较少的含有30氨基酸插入物的Rht-Bl蛋白，和/或产生框内插入物发生了改变的经修 饰Rht-Bl蛋白。通过用RT-PCR方法检测RNA来获得剪接效率发生改变的实验证据。
[0170] 实施例3.包含新Rht-Bl等位基因的小麦突变体的表型测试
[0171] 对包含新Rht-Bl等位基因的小麦过度生长突变体的与田间实际应用相关的多个 性状进行测试以用于商业化生产小麦。测量成熟茎的长度、胚芽鞘的长度和获自突变植物 的谷粒的相对谷粒休眠并与对照植物进行比较。数据包含在表4中。评估成熟植物在不同 灌溉田条件（即灌溉良好）下和不同季节中的茎长。在大多数情况下，获得四个独立的数 据点并将利用其计算表4中所示的平均值，平均值表示为相对于Rht-Bla植物的百分数。 不同的等位基因导致不同的茎长，其中一些实例（例如Rht-Blc. 6、c. 8、c. 21)为相当矮化 的，而另一些（Rht-Blc. 11、c. 25、c. 31)与Rht-Bla等位基因系一样高。在大多数情况下， 携带相同等位基因的品系之间的不同很小。基于针对Rht-Blb等位基因系植物观察到的约 为野生型（高）植物高度之81%的半矮化植物，存在15个新的等位基因，这些基因导致类 似程度的矮化，例如为高的高度的75 %至91 %。
[0172] 还测量突变植物的胚芽鞘长度，并计算为Rht-Bla植物平均胚芽鞘长度的百分 数。来自2至4个独立测量的平均值示于表4中。与针对茎长所发现的相比，一个品系内胚 芽鞘长存在更多不同。部分地，这可能与来自田间和温室来源的谷粒之间的差异相关。在 下一种植季节中，田间种植谷粒可用于绝大多数品系，并且还进行胚芽鞘测量。预期这些将 表现出较少的不同。总而言之，茎长和胚芽鞘长度之间一般呈正相关。在相关性似乎失效 的一些情况下，需要进行进一步工作以评估差异的统计学显著性。
[0173] 用收获自两个田间季节的谷粒来评估大多数突变品系谷粒的休眠。在两个季节 中，高和Rht-Blb Maringa等位基因系均表现出低的休眠，而Rht-Blc等位基因系则具有相 对高的休眠。不同的过度生长品系之间存在相当大的相对谷粒休眠得分差异。一些品系与 对照相比较的数据示于图9中。特别关注的是提供合适半矮化植株高度并保留相当大的谷 粒休眠的等位基因，例如Rht-Blc. 9、c. 17、c. 22、c. 23、c. 24、c. 26、c. 27。这些包括目前被 回交成优良品种的四个半矮化品系。
[0174] 在田间于第三个季节测试多个品系。植株高度和休眠得分的数据示于表8中。该 结果在趋势上与之前两个季节一致，表明在标准萌发测试中（实施例1)，一些突变品系的 谷粒需要显著更长的储存（"后熟"）以使50%的谷粒萌发。尽管所述品系和对照之间的 休眠趋势在季节之间相同，但是任一品系的绝对数目在季节间有所不同。
[0175] 实施例4.分离大麦的过度生长突变体
[0176] 选择"Himalaya"大麦的三个矮化突变体作为初始材料以分离大麦的过度生长突 变体。每个突变体在涉及以下的基因中包含限定的单个核苷酸替换：（i)GA生物合成，即编 码GA3-氧化酶的Grd2 ; (ii)GA受体"GID1"，由Gsel基因编码；和（iii)GA响应，即编码大 麦中DELLA蛋白的Slnl基因。用叠氮化钠处理各个矮化品系的谷粒、将其播种在田间并允 许自体受精从而产生Ml种子。播种这些种子以产生Ml植物，从其收获M 2谷粒。在第二叶 期筛选所得的生长于土壤中的M2幼苗以获得表现出比其矮化同胞生长更快的那些。从播 种的总共约IO 6个谷粒（表示约50, 000个M i穗）中收获三种不同类别的突变体。
[0177] 与该申请最相关的第一类别包括22株与其矮化同胞相比生长更快的植物。这些 是完全能育的，而且其后代植物是一样的并表现出快速生长。在各种情况下，通过对合适的 PCR片段测序来确定原始矮化突变的存在。由于存在的矮化突变，其叶伸长速率比预期更 高。他们示出一定程度范围内的生长增强，一些的叶伸长速率略微但显著快于其矮化亲本， 而另一些则与相应高野生型植物伸长的一样快或甚至略比其快（参见下文）。不同过度生 长突变体在成熟时的高度范围在矮化亲本和野生型之间至与野生型一样高。
[0178] 仅在Slnld矮化背景中收获到的第二类别包括三株植物，这三株植物均比其矮化 同胞生长的更快，但仍保留一定程度的矮化性。在下一代中，这些植物的后代由矮化植物和 典型的伸长细长植物以约3 : 1的比例组成。进一步的分析（下文）表明他们包含新的 slnl等位基因，其中第二突变起基因内抑制Slnld突变的作用。
[0179] 在GA生物合成和GA受体矮化背景下观察到的第三类别由典型的伸长细长突变体 组成。这些容易地通过其独特的高度伸长的表型和浅绿色，以及其移植后的高度伸长的茎 和能育性而被识别。该类突变体是预期到的，因为伸长的slnl无效等位基因对GA生物合 成或GA受体功能中的缺陷是上位的（Chandler和Robertson，1999)。
[0180] 实施例5.鉴定大麦突变和遗传连锁研宄
[0181] 由Slnld矮化背景（上文的第二类别）中的三种分离品系的细长植物制备DNA，并 对Slnl基因进行测序。各种品系植物的Slnl基因中均包含不同的新突变，从而产生开放 阅读框（ORF)内的提前翻译终止密码子。新的突变等位基因为Slnld的衍生物，并因而将 其命名为Slnld. 1、Slnld. 2、Slnld. 3 (表1)。它们表示新的等位基因内突变，其中第二突 变将Slnld矮化基因座改变成典型的功能丧失的伸长slnl等位基因。不对这些植物进行 进一步研宄。
[0182] 对各个过度生长突变体（上文的第一类别）中的完整Slnl基因进行测序以证实 Slnld等位基因仍然存在，并确定该基因中是否发生其他突变，因为其是可导致过度生长表 型之新突变的数个候选基因之一。在22株植物的20株中均发现Slnl ORF的新突变。这 些突变限定了 Slnl基因的11个新等位基因。一些植物携带相同的突变，并且可能是同胞 植物。7个新Slnl过度生长等位基因发生在Slnld矮化背景中，因而是包含基因内抑制突 变的等位基因。将其命名为Slnld. 4至Slnld. 10。三种突变发生在grd2b背景中（slnlm、 slnlo、slnls)，一种发生在gseln背景中（slnln)。各个新等位基因与其亲本等位基因的 不同之处均在于导致SLNl蛋白序列中发生单氨基酸替换的单核苷酸替换。所获得的氨基 酸替换列于表1中（TR品系）。它们均发生在对应于GRAS结构域的SLNl蛋白的C端60% 中，并且它们所有均对应于上文所述小麦突变体中的类似突变。观察到两个相同的突变事 件，其均导致G829A氨基酸替换，一个发生在Slnld. 7突变群中，而另一个发生在slnls群 中。这些均是独立的突变事件，因为前者为Slnld等位基因的衍生物，而后者发生在grd2b 矮化背景中的野生型Slnl基因中。
[0183] 剩余的两个过度生长品系（TR26、TR103)缺乏Slnl ORF中的任何新突变，并且潜 在地表示另一些基因中的突变。它们均发生在Slnld矮化背景中。将这些品系和作为阳 性对照的携带Slnld. 5的Himalaya杂交以评估Slnld矮化等位基因和新过度生长等位基 因之间的遗传连锁。来自对照WTXSlnld. 5杂交的F2群的最大叶伸长速率表现出预期的 3 : l(Slnld. 5 : WT)分配。不存在具有Slnld亲本之缓慢生长速率的F2个体，表明在该 相对小的群体中原始矮化突变和第二过度生长突变之间完全连锁。因而，该第二突变为基 因内抑制突变。在TR103XWT &群中观察到类似的结果，表明TR103中的过度生长突变与 Slnld完全连锁。相比之下，TR26XWT F2群中包括大部分与Slnld具有相同的生长速率的 幼苗，约25%与WT具有相同的生长速率，而一些幼苗具有中间生长速率。这些结果与TR26 中的过度生长突变一致，其位于不与Slnl连锁的基因中。
[0184] 对TR26中的一些其他候选GA信号传导基因进行测序。GA受体（Gsel)和两个 F-盒候选基因的序列与野生型中的相同，但是Spindlyl的序列显示导致SPYl的第六TPR 基序中发生氨基酸替换的单核苷酸替换（spyla，表1)。在拟南芥中，该区域对SPY活性是 重要的，因为其包含几个突变等位基因（Silverstone等，2007)。SPYl编码GA信号传导的 负调节蛋白，其最初在拟南芥中被鉴定出，但随后显示，大麦（Robertson等，1998)和水稻 (Shimada等，2006)中存在功能相关的基因。
[0185] 总之，这22个大麦过度生长突变体表示13个独立的突变事件。这些中的11个为 导致SLNl中单氨基酸替换的新Slnl等位基因。第12个为与Slnl紧密连锁，但位于未鉴 定区域中，可能是启动子突变，而第13个为非连锁基因 Spyl中的新等位基因。
[0186] 实施例6.包含新Slnl等位基因的大麦的叶伸长速率
[0187] 标准条件下由第一叶获得的最大日伸长速率（LERmax)为GA响应的可靠度量 (Chandler和Robertson，1999)，因而针对所有大麦过度生长品系及其亲本进行测定（表 5)。虽然与其各自的矮化亲本相比，这13种原始过度生长品系全部均具有显著更高的 LERmax值，但是生长提高的程度以等位基因依赖性方式变化。在其原始的矮化遗传背景中以 及与高WT背景回交后的两种情况下，对三个过度生长等位基因（slnlm、slnln和slnls)进 行比较。矮化背景中的生长速率始终较低，表明过度生长等位基因仍然具有因为GA生物合 成或GA受体功能受损导致的降低的GA信号传导。在野生型背景中，过度生长等位基因趋 向于提尚生长速率。
[0188] 实施例7.通过胚乳半粒产生α -淀粉酶
[0189] 通过野生型大麦胚乳半粒产生α -淀粉酶依赖于活性GA的存在。因此，监测不存 在活性GA时的α-淀粉酶活性提供了对突变体中"基础"GA信号传导的方便测量。与基础 水平相比，与GA 3孵育72小时后，具有正常GA敏感性的两个对照品系（WT，grd2b)的α -淀 粉酶活性增加了接近15倍（表5)。当检测过度生长突变体及其矮化亲本时，成熟胚乳半 粒中的初始α-淀粉酶活性量非常低，但与其矮化亲本相比，一些过度生长品系（Slnld. 4、 Slnld. 7、Slnld. 8、Slnld. 9 ;Slnld、spyla ;grd2b、slnlm ;grd2b、slnlo ;grd2b、slnls)在解 育后表现出增加的a -淀粉酶产生，而另一些（Slnld. 5、Slnld. 6、Slnld. 10 ;gseln、slnln) 则没有。在Slnld的过度生长衍生物中，Slnld. 9衍生物是例外的，其在孵育42小时和72 小时时均积累很高水平的a -淀粉酶，但是该品系仅表现出对生长速率的适度恢复（表5)。
[0190] 实施例8.与过度生长等位基因相关的其他性状
[0191] 在生长期间和成熟时，除总体高度不同之外，过度生长品系植物的外观均接近正 常。Slnld的9个过度生长衍生株的高度有所不同，但在成熟时没有一个与野生型一样高。 过度生长品系的胚芽鞘长度总体上根据LER max值和最终植株高度而变化。
[0192] 过度生长突变大麦植物的一个一般特征是其产生比其矮化亲本大的谷粒。在不 同生长季节的不同收获物中，谷粒大小一般介于矮化亲本（谷粒质量约40mg)和高野生型 (谷粒质量约55mg)之间。然而，在成熟时与野生型一样高的过度生长品系中有几个具有可 观地更大的穗和谷粒。在不同的温室代中，grd2b和slnlm的谷粒平均比grd2b矮化亲本 的谷粒大40%。当与Himalaya背景回交时，观察到谷粒重量平均增加20%，当与商业化品 种Sloop远交时，观察到BC 2材料中增加了 15%。当获得Sloop的BC3姐妹品系时，进行全 面分析。
[0193] 实施例9.对一些最佳标记的描述
[0194] 可将小麦或大麦中的新Rht-Blc等位基因引入到育种过程中，并随后使用该过度 生长等位基因的普通最佳标记进行标记辅助的筛选。例如，对于小麦，这包括两个引物之间 的PCR扩增，其中一个在Rht-Blc基因的2062bp插入物中，而另一个在该插入物的外部，例 如在Rht-Bl编码区中。合适产物的扩增仅在模板DNA来自包含至少一个拷贝的过度生长 基因的植物材料时发生。这些中的两个实例提供在表2中。利用这些扩增产物可容易地将 来源于Rht-Blc的新等位基因与其他半矮化等位基因 Rht-Blb和Rht-Dlb半矮化基因区别 开来。可容易地通过利用Rht-Blc中位于插入位点侧翼的引物对来产生针对除Rht-Blc等 位基因或其衍生等位基因之外的Rht-Bl基因的标记。
[0195] 实施例10.将所选的等位基因与其他小麦品种回交
[0196] 上述大麦中杂交研宄表明突变Rht-Bl等位基因与过度生长表型之间具有100% 共遗传性（coinheritance)。在小麦中进行两个杂交实验。在第一个中，6个过度生长品系 的植物与Rht-Blb等位基因（半矮化）纯合的Maringa杂交，并且另外4个品系的植物与 对野生型Rht-Bla等位基因（高）纯合的Maringa杂交。使Fl后代自交以产生F2植物。 在任何情况下，在F2代中均未检测到任何矮化（纯合Rht-Blc)植物的存在，表明对于10 个品系中的每一个，在新Rht-Bl等位基因和过度生长表型之间观察到100%遗传连锁，并 且新的突变抑制矮化性在基因 Rht-Bl中而非在该基因组中的其他地方。在与Rht-Blb的 杂交中，F2后代中的过度生长等位基因和Rht-Blb显示出预期的遗传模式，即I : 2 : 1纯 合：杂合：纯合比例。在一个杂交中，观察到过度生长亲本（品系TR550，Rht-Blc. 8)明显 矮小于Rht-Blb，并且F2群的高度（纯合过度生长=65cm，杂合=80至85cm，纯合Rht-Blb =95至100cm)之分离比例不与I : 2 : 1显著不同，表明该表型由单基因差异决定。重 要的是，该适度矮化的过度生长等位基因与品系TR550的高休眠相关。此外，来自田间种植 F2植物的F3谷粒群显示Rht-Blc. 8纯合的F2植物具有高休眠，Rht-Blc. 8/Rht-Blb杂合 的F2植物具有中等休眠，而Rht-Blb纯合的F2植物具有低休眠。该结果表明该过度生长 等位基因决定杂交后的尚度和休眠表型两者。
[0197] 与Maringa Rht-Bla杂交的4个品系为命名为544、612、705和791 (表4)的品系， 其分别包含 Rht-Bl 等位基因 Rht-Blc. 22、RhtBIc. 23、Rht-BIc. 24 和 Rht-Blc. 26。在各种 情况下，在F2代中均观察到预期的基因型分离比例。过度生长等位基因纯合的F2植物表 现出预期的高度降低和增强的休眠，表明可将突变Rht-Bl等位基因杂交成其他遗传背景 并保留表型效应。这还表明由突变Rht-Bl等位基因导致的两个表型（即半矮化植物高度 和增强的休眠）的遗传连锁。
[0198] 在第二个实验中，通过回交将所选的过度生长等位基因引入到优良的育种品系 中，意图用新的过度生长等位基因替换其现有的半矮化基因（Rht-Blb或Rht-Dlb)。这样做 是为了将成熟时的半矮化高度表型与其他有益性状例如经改良的发芽和更高的谷粒休眠 水平结合。使用作为花粉供体的品系544、612、705和791之植物进行与10个不同优良小麦 品种植物的杂交，所述优良小麦品种为Crusader、EGA Gregory、Espada、Lincoln、Magenta、 Yitpi、Young、KWS Chasmin、KWS Scirocco、McNeal 和 Outlook。F1 谷粒从所有的杂交获 得，并将三个供体等位基因播种以用于进一步与轮回亲本回交。PCR标记用于证实Fl植物 是杂种。4个供体中有一个略高于具有Rht-Blb的植物，而四个供体中有3个的高度彼此 之间以及与具有Rht-Blb的植物（半矮化）均非常类似。比Rht-Blb略微更矮化并且具 有优异谷粒休眠的一个或两个另外的等位基因包含在杂交试验中，例如Rht-Blc. 3和/或 Rht-Blc. 17〇
[0199] 讨论
[0200] 在诱变包含严重矮化等位基因的矮化品种后分离大麦和小麦的过度生长突变体。 目的突变体保留了导致亲本品种严重矮化的突变，但由于在同一 Rht-Bl或Slnl基因中新 诱导的突变却比亲本植物生长得更快。他们以增强的GA信号传导为特征，但是增强的程度 对所考虑的等位基因和GA响应两者都是特异的。该结果表明Delia基因（大麦中的Slnl， 小麦中的Rht-Bl)为最经常发生过度生长突变的位点。仅在一种情况下涉及到一个不同的 基因，即在大麦中，过度生长突变体归因于Spyl中的新突变。
[0201] 5个独立品系的证据支持以下结论：本文鉴定的Delia基因中的新突变导致过度 生长表型，而不是非连锁突变或不同基因中的突变，或者简单地为用诱变剂处理的一般结 果。第一，对于13个大麦突变体中的每一个，对约与Slnl具有相同长度的"对照"基因 (Gsel)进行测序，并且在任何情况下，均未检测到碱基改变。第二，观察到的突变几乎都是 (31个突变体中有30个）G至A的替换，假定C至T表示相反DNA链上的G至A，则与之前 在另一些基因座处对叠氮化物诱导的突变体的观察结果类似，所述基因座包括Gsel (GA受 体）、Slnl、GA生物合成和淀粉生物合成的基因。遗传密码的冗余性预测到对于随机的G至 A改变，33%将不具有相应的氨基酸替换。不过，在超过90个新诱导的突变体中，未观察到 一个沉默核苷酸替换的情
文档序号 :
【 8515132 】
技术研发人员：彼得·迈克尔·钱德勒,卡罗尔·安妮·哈丁
技术所有人：联邦科学和工业研究组织,谷物研究开发公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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