具有新Rht-B1等位基因的小麦的制作方法

2025-10-27 16:40:02 331次浏览

%，更优选至少99. 3 %，更优选至少99. 4 %，更优选至少99. 5 %，更优选至少99. 6 %，更优选至少99. 7 %，更优选至少99. 8 %，并且甚至更优选至少99. 9%的同一性。
[0107] 在一些实施方案中，本发明涉及用于限定两个多核苷酸互补程度的杂交条件严格性。本文使用的"严格性"指杂交期间的温度和离子强度条件以及是否存在某些有机溶剂。严格性越高，靶核苷酸序列与经标记的多核苷酸序列之间的互补程度越高。"严格条件"指在此条件下仅具有高频率互补碱基的核苷酸序列将杂交的温度和离子条件。本文使用的术语"在低严格性、中严格性、高严格性或非常高的严格性条件下杂交"描述了用于杂交和洗绦的条件。用于进行杂交反应的指导可见于Current Protocols in Molecular Biology， John Wiley和Sons，N.Y. (1989)，6. 3. 1-6. 3. 6中，其通过引用并入文本。本文提及的具体杂交条件如下：1)低严格性杂交条件：在约45°C的6X氯化钠/柠檬酸钠（SSC)中，然后在 50°C至55°C下用0. 2X SSC、0. 1%SDS洗涤两次；2)中严格性杂交条件：在约45°C的6X SSC 中，然后于60°C下用0. 2X SSC、0. 1% SDS洗涤一次或更多次；3)高严格性杂交条件：在约 45°C的6X SSC中，然后于65°C下用0. 2X SSC、0. 1%SDS洗涤一次或更多次；4)非常高严格性杂交条件：65°C的0. 5M磷酸钠，7% SDS，然后于65°C下用0. 2X SSC、1% SDS洗涤一次或更多次。
[0108] 本文使用的"嵌合基因"或"遗传构建体"指不是在其天然位置中的天然基因的任何基因，即已对其进行人工改造，包括被整合到小麦基因组中的嵌合基因或遗传构建体。一般地，嵌合基因或遗传构建体包含在自然界中不一起存在的调控序列和转录序列或蛋白质编码序列。因此，嵌合基因或遗传构建体可包含来自不同来源的调控序列和编码序列，或来自相同来源但以与自然界中存在的方式不同的方式排列的调控序列和编码序列。术语"内源性"在本文中用于指与所研宄植物（优选小麦植物）处于相同发育阶段的未经改良植物中正常产生的物质。"内源基因"指在生物体基因组内（优选在小麦植物内）其天然位置中的天然基因。本文使用的"重组核酸分子"指已通过重组DNA技术构建或修饰的核酸分子。术语"外来多核苷酸"或"外源多核苷酸"或"异源多核苷酸"等指通过实验操作被引入细胞基因组（优选小麦基因组）中但不天然存在于该细胞中的任何核酸。这些包括该细胞中存在的基因序列的修饰形式，只要被引入的基因包含相对于天然存在基因的一些修饰，例如引入突变或存在可选择标记基因即可。外来或外源基因可以是插入非天然生物体中的自然界中存在的基因、被引入天然宿主内新位置中的天然基因或嵌合基因或遗传构建体。"转基因"为通过转化方法引入基因组内的基因。术语"遗传修饰"包括将向细胞中导入基因、突变细胞中的基因以及改变或调节已经历这些作用的细胞或生物体或者其后代中的基因调控。
[0109] 将启动子或增强子元件"有效连接"至可转录多核苷酸意指将可转录多核苷酸 (例如，蛋白质编码多核苷酸或其他转录物）置于启动子的调节控制之下，随后所述启动子控制该多核苷酸的转录。在构建异源启动子/结构基因组合时，一般优选将启动子或其变体置于距离可转录多核苷酸转录起始位点的一定距离处，该距离大约与该启动子与在其天然情况下受其控制的基因（即，该启动子来源的基因）之间的距离相同。如本领域中所众所周知的，对该距离进行一些改变是可容忍的且不丧失功能。
[0110] 对于谷类植物，本文使用的术语"萌发"指吸涨后胚根鞘从种皮长出。
[0111] 种子的"萌发率"指在吸涨开始后的一段时间内，例如多至21天，或者在1至10天的时间内群体中已萌发种子的百分数。可在数天内每日对种子群进行测定以确定随时间变化的萌发百分数。本发明的某些方面涉及改变或调节种子的萌发率。这种改变/调节在种子的寿命内可以是瞬时的。例如，当与收获时的相应非转基因植物的种子相比较时，刚收获后的本发明转基因植物的种子可具有改变的萌发率；然而，在筒仓中储存六个月后，与在筒仓中储存六个月后的相应非转基因植物的种子相比时，本发明之相同转基因植物的种子可具有相同的萌发率，或反之亦然。换而言之，在种子寿命中的一些点，当与已暴露于相同条件的合适对照（非转基因或野生型等）相比较时，其将具有改变的萌发率。
[0112] 本文使用的术语"休眠"指有活力的完整植物种子在特定的有利条件下（特别是在温度方面和在水分存在下）不能萌发。休眠是一个定量性状。对于大麦和小麦，如果在 20°C下，低于90%的有活力完整种子在吸涨开始后7天后萌发，则认为植物的种子是休眠的。本领域公知的，有活力的种子是在打破休眠例如在室温或热处理下储存一段时间（数周或数月）后能够萌发的那些。
[0113] 本文使用的术语"非休眠"指植物种子在特定有利条件下萌发的能力。对于大麦和小麦，如果在20°C下，至少90%的有活力完整种子在吸涨开始后7天后萌发，则认为植物的种子是非休眠的。
[0114] 本文使用的术语"核酸扩增"指用于利用DNA聚合酶增加核酸分子拷贝数的任何体外方法。核酸扩增导致核苷酸被并入到DNA分子或引物中，由此形成与DNA模板互补的新DNA分子。新形成的DNA分子可用作模板来合成另外的DNA分子。
[0115] 本发明包括多种转基因植物的产生。这些包括，但不局限于具有由本发明小麦植物表现的一种或更多种理想性状的植物。
[0116] 用于产生上述转基因植物的核酸构建体可容易地利用标准技术产生。核酸构建体一般包含一个或更多个调控元件，例如启动子、增强子以及转录终止或多腺苷酸化序列以确保编码目的mRNA的基因的适当表达。这些元件在本领域中是众所周知的。包含调控元件的转录起始区可提供植物中的调控型表达或组成型表达。调控元件可选自，例如，种子特异性启动子或对种子细胞不具有特异性的启动子（例如泛素启动子或CaMV35S或增强的35S 启动子）。用于本发明的种子特异性启动子的实例包括，但不局限于小麦低分子量麦谷蛋白启动子（Colot等，1987)、小麦种子中表达α-淀粉酶的启动子（Stefanov等，1991)和大麦醇溶蛋白启动子（Brandt等，1985)。启动子可受到诸如温度、光或胁迫的因素的调控。一般而言，可在待表达遗传序列的5'提供调控元件。构建体还可包含增强转录的其他元件，例如nos 3'或ocs 3'多聚腺苷酸化区或转录终止子。
[0117] 一般地，核酸构建体包含可选择的标记。可选择标记有助于鉴定和筛选已转化有外源核酸分子的植物或细胞。可选择标记基因可为小麦细胞提供抗生素或除草剂抗性，或允许利用底物，例如甘露糖。可选择标记优选赋予小麦细胞潮霉素抗性。
[0118] 优选地，所述核酸构建体被稳定地并入植物的基因组中。因此，所述核酸包含允许分子被引入基因组中的合适元件，或所述构建体位于可被并入到植物细胞染色体中的合适载体中。
[0119] 本发明的一个实施方案包括重组载体，其包含至少一个被插入到能够递送核酸分子至宿主细胞中的任何载体中的本发明多核苷酸分子。这种载体包含异源核酸序列，即在天然情况下非邻近本发明核酸分子存在的核酸序列，并且优选来源于除所述核酸分子所来源的物种之外的物种。所述载体可以是RNA或DNA，真核的或原核的，并且一般为病毒或质粒。
[0120] 本发明的另一个实施方案包括重组细胞，其包括用本发明的一个或更多个重组分子转化的宿主细胞。可通过能够将核酸分子插入到细胞中的任何方法来实现将核酸分子转化到细胞中。转化技术包括，但不限于转染、电穿孔、显微注射、脂转染（Iipofection)、吸附和原生质体融合。重组细胞可保持单细胞的，或者可生长成组织、器官或多细胞生物体。本发明的转化核酸分子可保持在染色体外，或者可整合到转化（即，重组）细胞之染色体中的一个或更多个位点上，以这样的方式使得其被表达能力得以保留。优选的宿主细胞为植物细胞，更优选谷类植物细胞，更优选大麦或小麦细胞，甚至更优选小麦细胞。
[0121] 优选地，转基因植物为谷类植物。谷类植物的实例包括，但不限于小麦、大麦、高粱、燕麦和黑麦。更优选地，谷类植物为小麦或大麦。在另一优选实施方案中，谷类植物不是水稻。
[0122] 如本发明的上下文中所限定，转基因植物包括已用重组技术进行了遗传修饰的植物及其后代。一般地，这将调节本文中限定的至少一种多肽在期望植物或植物器官中的产生。转基因植物部分包括所述植物的全部部分和细胞，例如培养组织、愈伤组织和原生质体。转化的植物包含有在转化前其不包含的遗传物质。优选地，所述遗传物质被稳定地并入到植物的基因组中。该被引入的遗传物质可包含天然存在于相同物种中但以重排的顺序或以不同的元件排列的序列，例如反义序列。这些植物均包含在本文的"转基因植物"中。 "非转基因植物"是未通过重组DNA技术引入遗传物质而进行遗传修饰的植物。在一个优选实施方案中，所述转基因植物对已引入的每个基因（转基因）均是纯合的，从而使其后代对于期望表型不分离。
[0123] 存在数种用于将外来遗传物质引入到植物细胞中的技术。所述技术包括加速包被到微粒上的遗传物质直接进入细胞中（参见，例如US 4, 945, 050和US 5, 141，131)。可利用农杆菌技术对植物进行转化（参见，例如US 5, 177, 010、US 5, 104, 310、US 5, 004, 863、 US 5, 159, 135)。还利用电穿孔技术来转化植物（参见，例如WO 87/06614、US 5, 472, 869、 US 5, 384, 253、W0 92/09696和WO 93/21335)。不仅用于转化植物的多种技术可以不同，与外来基因接触的组织类型也可不同。所述组织将包括，但将不局限于胚胎发生组织、I型和 II型愈伤组织、下胚轴、分生组织等。可利用本文所述的合适技术在发育和/或分化期间对几乎所有的植物组织进行转化。
[0124] 适用于稳定转染植物细胞或适用于构建转基因植物的多种载体已在例如Pouwels 等，Cloning Vectors :A Laboratory Manual，1985，supp. 1987 ;Weissbach 和 Weissbach， Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press,1989 ；和 Gelvin 等，Plant Molecular Biology Manual，Kluwer Academic Publishers，1990 中进行了描述。一般地，植物表达载体包含，例如，受5'和3'调控序列转录控制的一个或更多个克隆的植物基因和显性可选择标记。这些植物表达载体还可包含启动子调控区（例如控制诱导型或组成型表达、环境或发育调控型表达，或者细胞或组织特异性表达的调控区）、转录起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或多腺苷酸化信号。
[0125] 可采用数种方法中的任何来确定转化植物的存在。例如，可利用聚合酶链式反应 (PCR)来扩增转化植物所特有的序列，并通过凝胶电泳或其他方法检测扩增产物。可利用常规方法从植物中提取DNA并使用将区别转化和未转化植物的引物进行PCR反应。例如，可设计将从读入构建体中的转化载体中扩增DNA区的引物，并根据目的基因设计反向引物。如果植物已得到成功转化，那么这些引物则将仅扩增片段。用于确定阳性转化株的一种替代方法是通过本领域中公知的Southern印迹杂交。还可对被转化的植物进行鉴定，即与未转化植物或野生型植物的区别在于其表型，例如由存在的可选择标记基因赋予的表型，或所期望种子休眠赋予的表型。
[0126] 用于转化谷类植物（例如小麦和大麦）从而通过引入外源核酸来将遗传变化引入植物中的方法和用于由原生质体或未成熟植物胚再生植物的方法在本领域中是公知的，参见例如Wan和Lemaux (1994) ;Tingay等，（1997);加拿大专利申请No. 2, 092, 588 ;澳大利亚专利申请No 61781/94 ;澳大利亚专利No 667939 ;美国专利No. 6, 100, 447 ;国际专利申请 PCT/US97/10621 ;美国专利No. 5, 589, 617 ;美国专利No. 6, 541，257,并且其他方法在专利说明书W099/14314中进行了阐述。优选地，通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefacien) 介导的转化方法产生转基因小麦或大麦植物。可将携带期望核酸构建体的载体引入到组织培养植物或外植体的可再生小麦细胞，或合适的植物系统（例如原生质体）中。
[0127] 优选地，所述可再生小麦细胞来自未成熟胚、成熟胚的小盾片、来源于这些的愈伤组织或分生组织。
[0128] 在经典的育种过程中，标记辅助筛选是用于在与轮回亲本回交时筛选所需杂合植物的公认方法。每个回交代中的植物群将对目的基因是杂合的，在回交群中通常以1 : 1比例存在，并且分子标记可用于区分该基因的两个等位基因。通过从例如嫩芽中提取DNA并用特异性标记测试渗入的理想性状来对用于进一步回交的植物进行早期筛选，同时将精力和资源集中于较少数植物上。为了进一步加快回交过程，可将未成熟种子（开花后25天）的胚切除，并使其于无菌条件下在营养培养基上生长，而不是允许饱满种子成熟。
[0129] 本领域中已知的能够检测Rht-Bl等位基因的任何分子生物技术均可用在本发明的方法中。这样的方法包括，但不局限于利用核酸扩增、核酸测序、核酸与经适当标记的探针杂交、单链构象分析（SSCA)、变性梯度凝胶电泳（DGGE)、异源双链分析（HET)、化学切割分析（CCM)、催化核酸切割或其组合（参见，例如Lemieux，2000 ;Langridge等，2001)。本发明还包括利用分子标记技术来检测与Rht-Bl等位基因相连锁的多态性。这样的方法包括检测或分析限制性片段长度多态性（RFLP)、RAPD、扩增片段长度多态性（AFLP)和微卫星 (简单序列重复，SSR)多态性。这些紧密连锁的标记可容易地通过本领域中公知的方法获得，例如由 Langridge 等综述的 Bulked Segregant Analysis (2001) 〇
[0130] 贯穿本说明书通篇，词语"包含"或变化形式例如"包括"或"含有"将被理解为指包含所述要素、整体或步骤，或者要素、整体或步骤的组，但不排除任何其他要素、整体或步骤，或者要素、整体或步骤的组。
[0131] 本说明书中提及的所有公开文本均通过引用并入本文。本说明书中包含的对文献、作用、材料、装置、条款等的讨论仅出于提供本发明之背景的目的。在本申请的各项权利要求的优先权日之前，不应认为是承认这些事物的任一或全部形成了现有技术基础的一部分，或者为澳大利亚或其他地方存在的本发明相关领域中的公知常识。
[0132] 除非上下文另外明确指出，否则本说明书中使用的没有数量词修饰的和"所述/ 该"修饰的名词包括复数方面。因此，例如提及的没有数量词修饰的名词包括单个以及两个或更多个；提及的没有数量词修饰的名词包括单个以及两个或更多个；提及的"所述/该" 修饰的名词包括单个以及两个或更多个等。
[0133] 尽管已总体上对本发明进行了描述，但是通过参考下述实施例将更容易理解本发明，通过举例的方式提供这些实施例，并且不旨在做出限制。
[0134] 实施例
[0135] 实施例L材料和方法
[0136] 植物材料
[0137] 高小麦品种Maringdi (Rht-Bla)和Maringa遗传背景中的近等基因矮化品系（Rht-Blc)的谷粒获自澳大利亚冬季谷类保藏中心（Australian Winter Cereals Collection，Tamworth，NSW，Australia)。Maringdi是一种巴西面包小麦品种。近等基因矮化品系通过与Maringdi中轮回筛选的矮化等位基因进行七次回交（BC7)产生（Hoogendoorn 等 1988)。
[0138] Himalaya大麦和三种先前表征的矮化突变体衍生株描述于表1中。植物种植在温室中的包含有基于堆肥的混合物的20cm盆中，提供有自然光并且冬季月份期间昼长延长至14小时，或者种植在黑山（Black Mountain)或金宁德拉试验站（Ginninderra Experimental Station)的田间，两者均位于澳大利亚的堪培拉。
[0139] 诱变
[0140] 用于诱变大麦和小麦谷粒的方法为简化的先前使用的方法（Zwar和Chandler， 1995)。在4°C下过夜，使每种品系的1至2kg谷粒吸收两倍其质量的水。将其转移至填充有水的2升量筒，并用加压空气充气8小时，其中在4小时后更换一次新鲜水。然后，将谷粒用新鲜制备的溶解于〇. IM磷酸钾缓冲液pH 3.0中的ImM叠氮化钠孵育2小时，随后用流水充分洗涤2小时、置于通风橱中干燥过夜并在处理的几天内播种到田间。
[0141] 构建携带过度生长等位基因的衍生品系
[0142] 对大麦过度生长等位基因进行回交、互交和远交以产生一组适用于细化生理表征的品系。在grd2b或gseln矮化背景中出现四个新的Slnl过度生长等位基因，并且与WT 回交两代以允许过度生长表型在高和矮化背景中比较。通过PCR确定丢失的原始矮化等位基因。剩余的7个新Slnl过度生长等位基因出现在Slnld矮化背景中，并且这些中的4个 (Slnld. 7、Slnld 8、Slnld 9和TR103)始终遍及与WT回交的两代。
[0143] 通过胚乳半粒（half-grain)产生α -淀粉酶
[0144] 制备胚乳半粒并在有或无 GA3 (1 μ Μ)的情况下于22°C下温育0、42或72小时。向每个样品添加 I. 5mL的IOmm CaCl2溶液、均化半粒并通过离心（20, 000g，5分钟）使ImL的等份样品澄清。利用Megazymea-淀粉酶（Ceralpha)方法分析上清液的α-淀粉酶活性。
[0145] 评估谷粒休眠
[0146] 以单行的方式将植物种植在田间，并每周检查穗两次以监测干燥程度。当所有绿色均已从穗消失时，认为其是生理上成熟的，将其切下并带到实验室。将穗放置于通风橱中 48小时以促进最终干燥，特别是易于保持潮湿的基部谷粒，然后手工脱粒。将谷粒放置于马尼拉纸信封（manila envelope)中，并留在实验室环境中，持续不同的后熟时间。通过在低强度荧光照明的条件下，在20°C环境下于湿滤纸上孵育每个品系的100个谷粒来评价萌发。在孵育7天后，评估每个谷粒样品中的萌发百分数。在这种情况下，萌发定义为胚根从种皮长出。在第一季节的实验中，很多谷粒样品，尤其是来自高小麦植物的谷粒样品表现出低休眠，并且在后熟仅13至19天后，存在大量萌发（至少50%的谷粒萌发）。一般对这些品系不再进行测试。另一些谷粒样品在后熟13至19天后具有较低的萌发，并且将这些谷粒在32至33天后再次测试，如果萌发仍然较低，在后熟48至49天后，再次测试。在1 (最低休眠）至4(最高休眠）的量表内给出相对休眠得分。
[0147] 在第二季节的实验中，休眠评估集中在半矮化和对照品系上，并从收获开始每周确定萌发，直至休眠结束或直至后熟12周。谷粒休眠测试结果的一个实例提供在图9中。将谷粒休眠的一个量度确定为在室温下使谷粒群中的至少50%谷粒萌发的谷粒储存周数 (也称为后熟），如通过前段中所述的方法评估的。
[0148] 大麦和小麦过度生长品系的胚芽鞘长度
[0149] 在完全充分供应水的情况下，在12°C下12小时和在8°C下12小时的每日温度方案中，于黑暗中生长21天后，确定小麦和大麦幼苗的胚芽鞘长度。
[0150] 在干燥条件下的深播发芽（emergence)
[0151] 将谷粒样品播种在温室中的土壤的IOcm深处（标准盆栽土）。初始土壤含水量为 12%至14% (w/w)。在不添加任何额外水以模拟田间的干燥播种条件的情况下进行萌发、早期生长和幼苗建立直至第三叶长出。评价产生发芽幼苗的谷粒的百分数和发芽时间。
[0152] 叶伸长速率和GA剂量-响应曲线
[0153] 方法在之前已进行了描述（Chandler和Robertson，1999)。利用4-参数Hill方程将曲线拟合至数据点。
[0154] 测量根长
[0155] 在控制条件下和在田间生长的植物中评估根生长。在前者情况下，通过扫描评估根长，而在田间时，则取出2m钻芯（core)并沿该钻芯以IOcm的间隔评估根数目。
[0156] DNA的PCR扩增和测序
[0157] 通过Ellis等，2005的方法从大麦或小麦叶制备DNA。利用其中一个引物对Rht-Bl 基因特异性的引物对（表2)扩增小麦序列。利用3'UT区中的保守正向引物和对B基因序列特异性的反向引物扩增该基因的3'半。利用对SlnUSpyl和Gsel基因特异性的引物 PCR扩增大麦序列。用Exosap-IT(Affymetrix)处理扩增的片段以除去引物，然后利用Big Dye Terminator (Applied Biosystems)进行测序。
[0158] DNA 序列
[0159] 小麦Rht-Ala、Rht-Bla和Rht-Dlb基因的序列及其编码的蛋白质分别在登录号 JF930277、JF930278和JF930281中。通过ClustalW对氨基酸序列进行比对，并显示不同的氨基酸（图7)。矮化Maringa衍生株中的Rht3-Blc基因的部分核苷酸序列示于SEQ ID NO. 1 中。
[0160] 由Rht-Blc等位基因编码的Rht-Blc蛋白的序列示于SEQ ID NO. 3中。
[0161] 大麦Slnl和Spyl基因的序列登录号分别为AK372064和AF035820。
[0162] 实施例2.分离包含新Rht-Bl等位基因的小麦突变体
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文档序号 : 【 8515132 】

技术研发人员：彼得·迈克尔·钱德勒,卡罗尔·安妮·哈丁
技术所有人：联邦科学和工业研究组织,谷物研究开发公司

备注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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彼得·迈克尔·钱德勒丨卡罗尔·安妮·哈丁丨联邦科学和工业研究组织丨谷物研究开发公司

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