具有新Rht-B1等位基因的小麦的制作方法
[0049] 本文使用的"Rht-Bl多肽"指由小麦中Rht-Bl等位基因编码的多肽。一般情况下， 该Rht-Bl多肽具有与约572个氨基酸之C端结构域相连的N端结构域，所述C端结构域的 氨基酸序列与SEQ ID NO :5的50-621位氨基酸具有至少98%的同一性。该C端结构域包 括通常被称为GRAS结构域的结构域。在一个实施方案中，该N端结构域的长度为约49至 约79个氨基酸。在一个优选实施方案中，该N端结构域的长度为约79个氨基酸，具有例如 SEQ ID NO :3的1-79位氨基酸的序列或相对于SEQ ID NO :3的1-79位氨基酸具有1至5 个氨基酸替换的变体。在一个替代实施方案中，该Rht-Bl多肽衍生自经历N端末端截短的 野生型Rht-Bl多肽，例如由Rht-Blb等位基因（也称为Rhtl基因）编码的Rht-Blb多肽 (SEQ ID NO :7)。在一个实施方案中，该Rht-Bl等位基因编码其氨基酸序列与SEQ ID NO: 3具有至少98%的同一性的Rht-Bl多肽。
[0050] 在一个实施方案中，该Rht-Bl多肽的氨基酸序列不与SEQ ID NO :5相同，并且也 不与SEQ ID NO :7相同，但是其可包含SEQ ID NO :7。在一个实施方案中，如果该多肽的氨 基酸序列与SEQ ID NO :3相同，那么该Rht-Bl等位基因则不具有SEQ ID NO :1所示的核苷 酸序列；相反地，其编码相对于SEQ ID NO :1在或邻近内含子剪接位点具有突变的SEQ ID NO :1的序列变体。在一个优选实施方案中，该多肽的氨基酸序列不与SEQ ID NO :3相同。 艮P，该多肽的序列与Rht-Bla (野生型）多肽、Rht-Blb多肽和Rht-Blc多肽中的每一种均 不相同。在一个实施方案中，该多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO :5所示Rht-Bla氨基酸序 列的不同之处在于至少（i)在SEQ ID NO :5的49和50位氨基酸之间插入了一个或更多个 氨基酸，和（ii)该多肽在对应于SEQ ID NO :5的200-621位氨基酸的区域的一个或更多个 氨基酸替换。Rht-Bla多肽的该区域对应于该多肽的GRAS结构域。
[0051] 在一个优选实施方案中，相对于Rht-Bla多肽（上述⑴）在SEQ ID NO :5的49 和50位氨基酸之间插入一个或更多个氨基酸是约30个氨基酸的插入物，其序列优选为DS ATPPDAPLVAAAGLAANETTHIKISANK(SEQIDN0 :14;对应于SEQIDN0:3的氨基酸50-79)或 其变体，其中该变体的序列与SEQ ID NO: 14的不同之处在于不超过5个氨基酸的氨基酸替 换、插入或缺失，优选1或2个氨基酸替换。序列DSATPPDAPLVAAAGLAANETTHIKISANK(SEQ ID NO :14)为Rht-Blc多肽中相对于Rht-Bla多肽插入的序列。这30个氨基酸的插入由 形成Rht-Blc等位基因的Rht-Bl基因中的插入所致。该插入在Rht-Bl多肽所谓的DELLA 基序（DELLAALGYKV;SEQ ID N0:15)中，DELLA基序被认为是与GA受体蛋白GIDl相互作用 所必需的，从而使具有该插入的多肽不再与GIDl结合。对该插入序列的变化可通过诱变获 得，并且预期1至5个氨基酸的替换、插入或缺失不会影响该多肽与GIDl相互作用的丧失。
[0052] 在一个实施方案中，该小麦植物的多肽还包含在对应于SEQ ID NO :5的1-200 位氨基酸的多肽区域中的一个或更多个氨基酸替换，优选保守氨基酸替换，该区域还被 称为野生型Rht-Bl多肽的DELLA结构域，因为其包含还称作DELLA基序的氨基酸序列 DELLAALGYKV(SEQ ID N0:15)。不过，优选地，本发明Rht-Bl多肽在突变DELLA结构域中的 氨基酸序列与SEQ ID NO :3相同，即包含SEQ ID NO :3的1-230位氨基酸。
[0053] 在另一些优选实施方案中，所述C端结构域中的一个或更多个氨基酸替换在该多 肽的对应于SEQ ID NO :5的200-621位氨基酸的区域中。在一个优选实施方案中，所述一 个或更多个氨基酸替换包括参照SEQ ID NO :3的选自G260、V264、A271、G298、A299、A305、 A310、P344、L346、G377、P394、R514、T524、S528、G563、V286、D371、A310、E579、S493、R283、 R271、G274、A280、V234、R484、V285、G230、S488和C240的氨基酸的替换。优选地，所述替换 选自 G260E、V264M、A271T、G298D、A299T、A305T、A310V、P344S、L346F、G377R、P394L、R514H、 T524I、S528F、G563D、V286M、D371N、A310T、E579K、S493F、R283H、R271H、G274D、A280T、 V234M、R484H、V285F、G230E、S488F和C240Y。在一个更优选的实施方案中，该小麦植物的 Rht-Bl等位基因包含相对于SEQ ID N0:1的序列变化，所述序列变化选自G2715A、G2726A、 G2747A、G2829A、G2831A、G2849A、C2865T、C2966T、C2972T、G3065A、C3117T、G3477A、C3507T、 C3519T、G3624A、G2792A、CC2108TA、G3047A、G2864A、G3671A、G148A、G148T、G147A、G2084A 和G2083A。这些序列变化对应于上文刚刚列举的氨基酸替换，参见表3。
[0054] 优选地，当这些植物在相同条件下生长时，本发明的小麦植物相对于Rht-Blc等 位基因纯合的小麦植物具有增加的植株高度并且相对于Rht-Bla等位基因纯合的小麦植 物具有降低的高度。因此，将本发明的小麦植物称为"半矮化"。在一个优选实施方案中， 本发明小麦植物的高度为Rht-Bla等位基因纯合（"高表型"）的对照植物高度的约70% 至约94%，更优选地，为Rht-Bla等位基因纯合的植物高度的约75%至约90%。相比之 下，Rht-Blc等位基因纯合的小麦植物（"矮化植物"）的高度为Rht-Bla等位基因纯合的 植物高度的约42%。本发明小麦植物的高度可与Rht-Blb等位基因纯合的小麦植物的高 度大约或基本相同，其为高植物高度的约80%至81 %，或者可低于Rht-Blb植物的高度或 高于Rht-Blb植物的高度。本文使用的"植株高度"指成熟植物从地面到最高茎顶部（即， 穗的底部）的高度。相对于本发明的小麦植物，Rht-Blc、Rht-Bla或Rht-Blb等位基因 纯合的并用作比较之对照的植物优选具有基本相同的遗传背景，更优选地，其为近等基因 (near-isogenic)系；因而，将其称为"Rht-Blc (或Rht-Bla或Rht-Blb)等位基因纯合的 对应小麦植物"。本领域的技术人员能够容易选择适用于进行比较的对应小麦植物。为了 进行比较，例如在重复田间试验中，使本发明的植物与对照植物在基本相同的时间和环境 条件下生长，包括相同的温度方案、光条件、养分和水供给以及土壤条件。优选地，测量田间 生长植物的植株高度，但是也可使用温室生长植物用于进行比较，并且按照本领域中已知 的田间试验进行生长。可在生长周期中的任意点测量植株高度，但是优选在植物成熟时期 测量。
[0055] 此外，优选地，所述小麦植物相对于Rht-Blc等位基因纯合的小麦植物具有增强 的能育性和/或生产增加的谷粒量；和/或相对于Rht-Blc等位基因纯合的小麦植物具有 增加的胚芽鞘长度；和/或能够生产与从Rht-Bla等位基因纯合的小麦植物获得之谷粒相 比休眠增加的谷粒。优选地，该植物产生的谷粒量与Rht-Blb等位基因纯合的对应小麦植 物基本相同或者比其更大。将本文使用的"能育性"限定为每个穗的谷粒数目，而"谷粒量" 或"从植物产生的谷粒产量"指可从该植物收获的成熟谷粒的重量。
[0056] 所述谷粒一般具有按重量计约10%至约15%的含水量。优选地，本发明的小麦植 物相对于Rht-Blc等位基因纯合的小麦植物还具有增加的胚芽鞘长度。优选地，本发明小 麦植物的胚芽鞘长度为Rht-Bla等位基因纯合的植物的胚芽鞘长度的70%至120%，优选 80%至100%。本发明小麦植物的另一优选性状是获自该植物的谷粒的休眠。优选地，该植 物相对于Rht-Bla等位基因纯合的小麦植物具有增加的谷粒休眠。优选地，该小麦植株的 休眠水平是Rht-Blc等位基因纯合的小麦植物的50%至100%，优选60%至100%。在一 个实施方案中，获自本发明小麦植物之谷粒的萌发率位于来自Rht-Bla等位基因纯合之小 麦植物的谷粒和来自Rht-Blc等位基因纯合之小麦植物的谷粒之间。可按照实施例1中所 述测定萌发率。例如，可测定谷粒群达到50%萌发所需的时间。在一个优选实施方案中，与 相对于来自Rht-Bla等位基因纯合之对应小麦植物的谷粒相比，本发明小麦植物的谷粒在 室温下需要1至8周多，优选2至5周多的储存（"后熟期"）以达到50%的萌发率。
[0057] 应当理解，当将本发明的植物或谷粒与Rht-Blc等位基因纯合或Rht-Bla等位基 因纯合的那些进行比较时，使用在基本相同的生长条件、生长时间、温度、水和养分供给等 下生长的植物以及获自这些植物的谷粒进行该比较。
[0058] 谷粒在第二方面，本发明提供了小麦谷粒，其获自或可获自本发明的小麦植物，或 者其为本发明小麦植物的一部分。本文使用的"谷粒"指一般由农民从田间生长的成熟小 麦植物收获的谷粒，包括用于食品生产或用在食品产品中的谷粒和在播种后而幼苗长出 (emergence)前萌发的谷粒。谷粒还包括经历加工用于食品生产或为食品产品中成分的谷 粒。本发明收获的小麦谷粒一般具有按重量计约10%至约15%的含水量。在一个实施方 案中，所述小麦谷粒包含编码变体（非野生型）Rht-Bl多肽的Rht-Bl等位基因，优选地，该 谷粒对该等位基因是纯合的。在一个实施方案中，所述Rht-Bl多肽包含N端结构域和C端 结构域，其中该C端结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO :5的50-621位氨基酸具有至少98% 的同一性，并且其中所述Rht-Bl多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO :5所示序列的不同之处 在于至少（i) SEQ ID NO :5的49和50位氨基酸之间插入了一个或更多个氨基酸，和（ii) 该C端结构域中相对于SEQ ID NO :5的50-621位氨基酸的一个或更多个氨基酸替换。在 一些实施方案中，所述小麦谷粒包含选自如下的Rht-Bl等位基因：Rht-Blc. URht-Blc. 2、 Rht-Blc. 3、Rht-Blc. 4、Rht-Blc. 5、Rht-Blc. 6、Rht-Blc. 7、Rht-Blc. 8、Rht-Blc. 9、 Rht-Blc. KKRht-Blc. 12、Rht_Blc. 15、Rht_Blc. 16、Rht_Blc. 17、Rht_Blc. 18、Rht_Blc. 21、 Rht-Blc. 22、Rht-Blc. 23、Rht-Blc. 24、Rht-Blc. 26、Rht-Blc. 27、Rht-Blc. 28、Rht-Blc. 29、 Rht-Blc. 30和Rht-Blc. 32,并且优选地，其该等位基因是纯合的。在一些优选实施方案中， 所述小麦谷粒包含选自 Rht-Blc. 22、Rht-Blc. 23、Rht-Blc. 24 和 Rht-Blc. 26 的 Rht-Bl 等 位基因，并且优选地，其该等位基因是纯合的。
[0059] 或者，该谷粒变体Rht-Bl多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO :5所示序列的不同之处 在于至少在SEQ ID NO :5的49和50位氨基酸之间插入了一个或更多个氨基酸，并且编码 变体Rht-Bl多肽之Rht-Bl等位基因的核苷酸序列与SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的不同 之处至少在于存在位于或邻近内含子剪接位点的突变，从而使Rht-Bl等位基因 RNA转录物 的内含子剪接受到影响。在该实施方案中，由Rht-Bl等位基因编码的多肽氨基酸序列可与 SEQ ID NO :3相同，或者其可以是不同的。Rht-Bl等位基因可同时包含内含子剪接突变，并 且编码具有前段中（i)和（ii)差异的多肽；或者，在一个优选实施方案中，该多肽具有上述 (i)和（ii)的差异并且相对于SEQ ID NO :1不具有任何内含子剪接位点突变。
[0060] 还可按照上文针对所述小麦植物的段落中所述，对该谷粒的变体Rht-Bl多肽及 编码其的Rht-Bl等位基因进行进一步限定。在一个优选实施方案中，该谷粒与从Rht-Bla 等位基因纯合的小麦植物获得之谷粒相比具有增加的休眠。在一个实施方案中，本发明谷 粒的萌发率位于来自Rht-Bla等位基因纯合之小麦植物的谷粒和来自Rht-Blc等位基因纯 合之小麦植物的谷粒的萌发率之间。可按照实施例1中所述测定萌发率。例如，可测定谷粒 群达到50%萌发所需的时间。在显示"休眠增加"的一个优选实施方案中，与来自Rht-Bla 等位基因纯合的对应小麦植物的谷粒相比，本发明的谷粒在室温下需要1至8周多，优选2 至5周多的储存（"后熟期"）以达到50%的萌发率。还优选的是，当将该谷粒播种到土壤 中时，本发明的小麦谷粒能够生长成小麦植物；当这些植物在相同条件下生长时，该植物相 对于Rht-Blc等位基因纯合的小麦植物具有增加的植株高度并且相对于Rht-Bla等位基因 纯合的小麦植物具有降低的高度。由该谷粒产生的小麦植物相对于Rht-Blc等位基因纯合 的小麦植物可具有增强的能育性和/或产生增加的谷粒量，和/或相对于Rht-Blc等位基 因纯合的小麦植物具有增加的胚芽鞘长度。
[0061] 本发明还提供了产生本发明谷粒的方法，所述方法包括（i)种植本发明的小麦植 物，和（ii)从该植物收获谷粒。在一些优选实施方案中，可对所述小麦谷粒进行加工使得 其不再能够萌发。这可通过去除种子的胚实现，例如通过研磨或通过热处理或其他谷粒加 工方法。所述谷粒可以是经粗磨、经破裂、经煮半熟（par-boiled)、经辊压、经抛光、经粉碎 或经研磨的谷粒。
[0062] 本发明还提供了产生面粉、全麦面粉（wholemeal)、淀粉、淀粉颗粒或麸的方法，所 述方法包括获得本发明的谷粒并对该谷粒进行加工以产生所述面粉、全麦面粉、淀粉、淀粉 颗粒或麸。所述加工方法在本领域中是公知的。获得谷粒的步骤包括，例如从本发明的小 麦植株收获谷粒或者购买谷粒。
[0063] 本发明还提供了由本发明的植物或谷粒生产的产品，例如食物产品，其可以是食 物成分。食物产品的实例包括面粉、淀粉、经发酵的或未经发酵的面包、意大利面（pasta)、 面条、动物饲料、早餐麦片、点心、蛋糕、麦芽、糕点或基于面粉的调味品。所述食物产品可以 是面包圈、饼干、面包、小圆面包、羊角面包、饺子、英式松饼、松饼、皮塔面包、速成面包、冷 藏/冷冻面团产品、面团、烘豆、玉米煎饼（burrito)、辣椒酱（chili)、墨西哥卷饼（taco)、 玉米面团包焰卷（tamale)、玉米粉圆饼（tortilla)、焰饼（pot pie)、即食谷类、即食餐 (ready to eat meal)、填料、微波炉餐、核仁巧克力饼（brownie)、蛋糕、奶酪蛋糕、咖啡蛋 糕、曲奇、甜点、糕点、甜面包、糖块（candy bar)、焰饼皮（pie crust)、灌饼（pie filling)、 婴儿食品、烘焙混合物、面糊（batter)、面包糊（breading)、肉汁混合物、肉混合剂、肉替 代品、调味品混合物、汤混合物、肉汁、掺油面粉糊（roux)、色拉调料（salad dressing)、 汤、酸奶油、面条、意大利面、拉面、炒面、携面、冰淇淋内容物（ice cream inclusion)、冰 淇淋棒、冰淇淋蛋卷、冰淇淋三明治、薄脆饼干（cracker)、油煎面包块（crouton)、甜甜圈、 蛋卷（egg roll)、膨化食品（extruded snack)、水果谷物棒（fruit and grain bar)、微 波炉点心产品、营养棒、煎饼、烤半熟的烘焙产品（par-baked bakery product)、椒盐卷饼 (pretzel)、布丁、基于格兰诺拉麦片的产品、点心片、点心、点心混合物、华夫饼、匹萨壳、动 物食品或宠物食品。食物产品可通过混合谷粒或来自所述谷粒的面粉、全麦面粉或麸与其 他成分制备。另一种产品为动物饲料，例如收获的谷粒、干草、稻草或青贮饲料。本发明的 植物可直接用作动物饲料，例如当在田间生长时。
[0064] 多核苷酸在第三方面，本发明提供了编码本发明Rht-Bl多肽的核酸分子。该核酸 分子可从小麦植物分离或者包含在小麦植物中或者作为植物中的外源核酸分子，所述植物 可以是任何植物，例如谷类植物或除非小麦之外的植物。在一个实施方案中，所述Rht-Bl 多肽包含N端结构域和C端结构域，其中该C端结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO :5的 50-621位氨基酸具有至少98%的同一性，并且其中所述Rht-Bl多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO :5所示序列的不同之处在于至少⑴在SEQ ID NO :5的49和50位氨基酸之间插 入了一个或更多个氨基酸，和（ii)该C端结构域中相对于SEQ ID NO :5的50-621位氨基 酸的一个或更多个氨基酸替换。还可按照上文针对所述小麦植物的段落中所述，对本发明 的Rht-Bl多肽进行进一步限定。在一些优选实施方案中，所述核酸分子包含选自以下的 Rht-Bl 等位基因：Rht-BIc. 1、Rht-Blc. 2、Rht-Blc. 3、Rht-Blc. 4、Rht-Blc. 5、Rht-Blc. 6、 Rht-Blc. 7、Rht-Blc. 8、Rht-Blc. 9、Rht-Blc. 10、Rht-Blc. 12、Rht-Blc. 15、Rht-Blc. 16、 Rht-Blc. 17、Rht_Blc. 18、Rht_Blc. 21、Rht_Blc. 22、Rht_Blc. 23、Rht_Blc. 24、Rht_Blc. 26、 Rht-Blc. 27、Rht-Blc. 28、Rht-Blc. 29、Rht-Blc. 30 和 Rht-Blc. 32。在一些更优选的实施 方案中，所述核酸分子包含选自Rht-Blc. 22、Rht-Blc. 23、Rht-Blc. 24和Rht-Blc. 26的 Rht-Bl等位基因。
[0065] 多肽在第四方面，本发明提供了 Rht-Bl多肽，其包含N端结构域和C端结构域， 其中该C端结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO :5的50-621位氨基酸具有至少98%的同一 性，并且其中所述Rht-Bl多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO :5所示序列的不同之处在于至少 ⑴在SEQ ID NO :5的49和50位氨基酸之间插入了一个或更多个氨基酸，和（ii)该C端 结构域中相对于SEQ ID NO :5的50-621位氨基酸的一个或更多个氨基酸替换。还可按照 上文针对所述小麦植物的段落中所述，对本发明的Rht-Bl多肽进行进一步限定。
[0066] 本发明还提供了一种对小麦植物基因分型的方法，所述方法包括（i)获得包含 从小麦植物提取的核酸或蛋白质的样品，和（ii)检测该样品中本发明的核酸分子或多 肽。在一些优选实施方案中，所述小麦植物包含选自以下的Rht-Bl等位基因：Rht-Blc. 1、 Rht-Blc.2、 Rht-Blc.3、 Rht-Blc.4、 Rht-Blc.5、 Rht-Blc.6、 Rht-Blc.7、 Rht-Blc.8、 Rht-Blc. 9、Rht-Blc. 10、Rht-Blc. 12、Rht-Blc. 15、Rht-Blc. 16、Rht-Blc. 17、Rht-Blc. 18、 Rht-Blc. 21、Rht_Blc. 22、Rht_Blc. 23、Rht_Blc. 24、Rht_Blc. 26、Rht_Blc. 27、Rht_Blc. 28、 Rht-Blc. 29、Rht-Blc. 30 和 Rht-Blc. 32。
[0067] 本发明还提供了一种将Rht-Bl等位基因导入缺乏所述等位基因的小麦植物中的 方法，所述方法包括：i)将第一亲本小麦植物与第二亲本小麦植物杂交，其中该第二植物 为本发明的小麦植物，和ii)将步骤i)的杂交后代植物和与所述第一亲本植物具有相同 基因型的植物回交以产生具有该第一亲本大部分基因型但包含所述Rht-Bl等位基因的植 物。
[0068] 可将本发明的核酸分子与能够指导该核酸分子在植物细胞中表达的启动子有效 连接。本发明还提供了一种包含或编码本发明核酸分子的载体和包含该载体和/或本发明 核酸分子的宿主细胞。
[0069] 本发明还提供了一种经遗传修饰的植物，其中该植物已用本发明的核酸分子转 化；并且其后代植物包含所述核酸分子。在某些实施方案中，所述经遗传修饰的植物为小麦 或大麦植物。
[0070] 本文使用的谷类指单子叶植物家族禾本科（Poaceae或Graminae)的植物或谷粒， 其被培植来用于获得其种子的可食用成分，并且包括小麦、大麦、玉米、燕麦、黑麦、水稻、高 粱、黑小麦、粟、荞麦。优选地，所述谷类植物或谷粒为小麦或大麦植物或谷粒，更优选小麦 植物或谷粒。在另一优选实施方案中，所述谷类植物不是水稻或玉米或这些中的任何一种。
[0071] 本文使用的术语"大麦"指大麦属（Genus Hordeum)的任何物种，包括其亲代以 及其通过与其他物种杂交产生的后代。优选地，所述植物为可商业化培植（例如多棱大麦 (Hordeum vulgare)品系或栽培品种或品种）或适用于商业化生产谷粒的大麦属物种。
[0072] 本发明的小麦植物不仅具有用于食品或动物饲料用途，还可具有很多用途，例如 用于研宄或育种。对于种子繁殖的农作物例如小麦，可使这些植物自交以产生对期
文档序号 :
【 8515132 】
技术研发人员：彼得·迈克尔·钱德勒,卡罗尔·安妮·哈丁
技术所有人：联邦科学和工业研究组织,谷物研究开发公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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