促进周围神经移植后神经再生的植入式可降解装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及到提供一种促进周围神经移植后神经再生的植入式装置，尤其是ー种可降解的促进周围神经移植后神经再生的装置。
背景技术：
周围神经缺损修复与功能重建，是百余年来世界临床医学研究一大难题。随着社会经济的快速发展，机械化的程度増加，交通日益发达，人口流动倍增的情况下，周围神经的损伤就急速地上升。周围神经损伤均多发于青壮年劳动力，劳动カ的伤残成为社会发展与家庭沉重的经济与伦理负担，制约和阻碍着社会经济的发展。周围神经损伤的治疗效果不理想，主要难题之ー是没有合适材料修复神经损伤后出现的缺损。临床上最常用的移植材料是自体神经，但供体直径细，可切取的数量非常有限，难以满足临床需要，且取材后会造成供区新的神经缺损，出现供区神经瘤形成和相应神经功能障碍等并发症，因此，周围神经移植材料的研制一直是神经修复领域的重点课题。近年来，不少国家的研究机构和企业投入了大量人力、物力与资金对周围神经修复材料进行研究。已知作为理想的周围神经支架材料应能为神经再生提供最佳的理化和生物学微环境，包括(1)良好的生物相容性(无毒性，低免疫原性，无致畸致癌性)和降解性，神经修复后能被机体吸收。(2)具有可塑性和一定的机械强度，可保护再生神经顺利通过神经缺损区；(3)具有与所修复神经相似的仿生三维支架结构，支持并引导再生神经的生长；(4)材料的组分与构成有良好的生物相容性；(5)保证神经再生修复所需的营养供应，支架材料内有调节神经细胞生长，分化并促进神经修复和组织再生的神经营养因子，改善神经再生的微环境，提高轴突的再生速度。目前制备的具有良好生物相容性和仿生化的神经移植物技术较为成熟，在国内外已有不少专利申请。如中国专利200910250344. 7使用PLGA、壳聚糖和胶原蛋白生物可降解材料制成的神经再生导管；200910034583. 9则提供一种由聚合物经静电纺丝方法制备的纳米纤维组成的导管状神经移植物；200910020942. 5则使用I型胶原蛋白、壳聚糖、明胶制成一种高仿真组织工程神经修复材料以及此前本申请的申请人的20041002724. 8组织工程化神经移植物等。然而单一的神经导管不含有任何生物活性物质，仅是神经再生的物理通道，不具备任何生物活性，所以其修复的效果不佳，特别是对于更需要营养物质的长段神经缺损。但是如何保证神经再生修复所需的营养供应，提供具有支持、引导促进神经修复和组织再生的营养物质，改善神经再生微环境，且能形成浓度梯度指导神经轴突导向生长仍是尚未解決的难题。虽然现可通过在神经移植物上种植具有生物学活性的种子细胞，通过其在体内外环境中分化为可分泌促神经生长物质的类许旺细胞(如中国专利 200410027223. 3,200410027224. 8,200410027221. 4,200420045860. 9、200420045859. 6,200420045858. 1,200420045857. 7,200410027222. 9 等)或在支架材料上添加各种神经营养因子，通过化学或生物等构建控释系统实现局部持续缓慢释放(如中国专利 200410012856. 3，200410009429. 3，200610081506. 5，200610150792. 6 等)。虽然使用种子细胞，通过体内或体外诱导成类雪旺细胞，也能分泌有益于神经再生的营养因子，可促进轴突再生和髓鞘形成，但是其分泌神经再生物质具有时效局限性，且干细胞的治疗涉及使用安全性，标准性和伦理学等诸多问题。迄今为止，除了造血干细胞治疗血液病，全世界尚未有任何ー个研究和医疗机构的干细胞治疗得到受理和审评。我国卫生部更是于2009年3月颁布实施的《医疗技术临床应用管理办法》中也明确将干细胞技术归入“第三类医疗技木”，称其“涉及重大伦理问题，安全性、有效性尚需经规范的临床试验研究进ー步验证”。因此这种细胞型组织工程离临床应用距离尚远。而通过化学或生物等技术方法在支架材料上添加各种神经营养因子，一方面技术要求较高，制作复杂，难以保证神经营养因子的活性，难以标准化稳定生产，另一方面多数只能添加少量的単一神经营养因子，对神经再生的促进的作用相当有限，以致应用受限；因此如何在现有的周围神经移植物材料包容有多种神经营养因子已是研究的热点。同时如能在这种材料上进行有定向的浓度梯度分布的，一方面可以保证远端足够量的神经营养物质，防止靶器官和肌肉的过快退化和萎縮，另一方面则可以创造ー个各向异性的细胞生长环境，使细胞行为发生取向而实现导向。这对于提高周围神经移植修复效果将有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促进周围神经移植后神经再生的植入式可降解装置，该装置具有简便、安全、高效的优点，可用于装载多种促神经再生物质，并将促神经再生物质按照神经远、近端形成浓度梯度，环绕于周围神经移植物的周围，形成有利于周围神经轴突再生的微环境。本发明所述的ー种促进周围神经移植后神经再生的植入式可降解装置，是由两个対称的半柱形组件合拢形成的中空的柱形装置；在所述柱形装置内分隔成多个独立的小间室，用于装载不同浓度的促神经再生物质；所述柱形装置的两端是开放的，供周围神经移植修复材料从一端穿入并从另一端穿出；两个半柱形组件的间隙通过医用生物蛋白胶封闭成为封闭的管状结构；所述半柱形组件是由可降解的生物相容性材料制备的。在本发明所述的装置内，促神经再生物质围绕所置入的周围神经移植修复材料，使得周围神经移植修复材料周围富集有多种促神经再生物质，形成有利于周围神经轴突再生的微环境；通过医用生物蛋白胶封闭成为管状结构，可植入体内需要周围神经修复的地方，作为周围神经移植物的装置。而且，由于采用内部分隔状凹槽的结构，能够装载各种胶状的促神经再生物质，加快轴突再生速度；并可将促神经再生物质按照神经远、近端形成浓度梯度，对神经生长起到一定的导向作用。根据本发明所述的装置的进ー步特征，所述的半柱形组件具有至少40N/mm2的断裂強度。因此，由这些半柱形组件制成的管状装置能够提供一定机械支持，能維持形状不容易塌陷，从而保护装置内周围神经移植物，防止纤维瘢痕组织长入。根据本发明所述的装置的进ー步特征，所述的半柱形组件具有50% 80%之间的孔隙率，以及具有5Mm 50Mm之间的微孔直径。因此，半柱形组件具有一定的孔隙结构，有利于营养物质的通透，可使毛细血管和纤维组织长入，不妨碍装置内的周围移植物获得血管化，也避免其内所装载促神经再生物质大量外滲。根据本发明所述的装置的进ー步特征，所述的半柱形组件是由以下可降解的生物 相容性材料制成壳聚糖、藻酸盐、丝素蛋白、纤维素、胶原蛋白、甲壳素、几丁糖、聚乳酸、聚羟基こ酸、聚羟基丁酸脂、聚已内脂、聚こ醇酸、脂肪族聚酯、聚磷酸酷、聚碳酸酷、聚氨酯及它们的共聚物。根据本发明所述的装置的进ー步特征，所述的周围神经移植修复材料是选自用于周围神经缺损修复的人工合成材料、天然生物材料或者组织工程神经。根据本发明所述的装置的进ー步特征，所述人工合成材料是选自以下可降解的生物相容性材料聚乳酸、聚羟基こ酸、聚羟基丁酸脂、聚已内脂、聚こ醇酸、脂肪族聚酯、聚磷酸酷、聚碳酸酷、聚氨酯及它们的共聚物。 根据本发明所述的装置的进ー步特征，所述天然生物材料是选自来源于有活性的自体、去细胞同种异体或去细胞异种生物体的神经、骨骼肌、血管、肌膜管、黏膜、羊膜以及无活性的壳聚糖、藻酸盐、丝素蛋白、纤维素、胶原蛋白、甲壳素、几丁糖。根据本发明所述的装置的进ー步特征，所述组织工程神经是种植有活性种子细胞的组织工程支架。根据本发明所述的装置的进ー步特征，所述的种子细胞是选自许旺细胞、骨髓间充质细胞、脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞、神经干细胞或诱导多能干细胞。根据本发明所述的装置的进ー步特征，所述促神经再生物质是选自神经营养因子，如神经生长因子、脑源性神经生长因子、神经营养素家族；神经分裂素，如睫状神经营养因子、和白细胞介素-6;非神经营养因子，如成纤维细胞生长因子、白细胞抑制因子、类胰岛素生长因子、表皮生长因子、胶质源性神经营养因子、血小板源性生长因子、转化生长因子@ ;或者它们的两种或两种以上的组合。这些促神经再生物质可參与周围神经再生、调节和创伤修复的物质，有保护周围神经损伤后的神经元及轴突，可促进轴突再生，加快神经修复作用。本发明所述的促进周围神经移植后神经再生的植入式可降解装置具有以下特点和优点
(I)提供ー种可装载促神经再生物质的装置，作为用于植入的周围神经移植物的装置，使得周围神经移植物周围富集有多种的神经再生物质，形成有利于周围神经轴突再生的微环境。(2)所装载的促神经再生物质种类不受限制，可根据实际使用需要选择且可有较多容量，突破目前使用各种复杂技术只能在周围神经移植物添加少量的単一促神经再生物质的限制，同时也減少既往复杂的化学或生物加工过程中对促神经再生物质活性的影响。(3)该装置内的分隔状结构可实现促神经再生物质形成浓度梯度，有可能对周围神经再生的轴突伸展和定向生长有明显的促进作用。(4)整个制作エ艺简便、安全、经济又高效，实现的手段较为简便，有利于规模化生产和临床的推广使用。
具体实施例方式实施例一本发明所述的促进周围神经移植后神经再生的植入式可降解装置的制备
制备材料使用以聚(乳酸-羟基こ酸)共聚物(PLGA)。半柱形组件的制备以聚(乳酸-羟基こ酸)共聚物(PLGA)(摩尔比GA LA=20 80)为原材料，将其溶于ニ氯甲烷中，加入粒径200 300微米的NaCl做致孔剂(PLGA与NaCl质量比1:9)，同时按5%的比例添加赖氨酸作为碱性调节剂，并混合均匀，将混合物在专用模具中成膜。模具中的混合物在室温下，通风橱中自然挥发。96小时后，脱模，取出半柱状支架，将其移到真空干燥箱，37°C真空干燥48小吋。将半柱状材料浸入装有去离子水的800ml大烧杯中，每4小时更换一次去离子水。去离子水洗涤96小时后，将半柱状材料取出，在干燥箱中37°C干燥48小吋。然后在真空干燥箱中，37°C真空干燥48小吋，即可得到PLGA组件。组件的装配和使用在所制备的半柱形组件内装载促神经再生物质，如胶冻状的神经生长因子(NGF)，并于神经近端处从高到底的浓度转入不同的小间隔室内，置入一根同种异体去细胞神经修复材料后，将两个半柱形组件合闭，并使用医用生物蛋白胶粘合封闭，形成ー种管状结构，使得同种异体去细胞神经修复材料周围富集有神经生长因子(NGF)。
实施例ニ 本发明所述的促进周围神经移植后神经再生的植入式可降解装置的制备
制备材料为壳聚糖。半柱形组件的制备取350 mg的壳聚糖溶于3 mg/ml醋酸溶液10ml，抽真空静置12 h，将壳聚糖溶液注入专用模具中。将注模的样品顺轴向缓慢浸入深低温冷淋剂(液氮)中，进行梯度冷淋。将10 cm长的胶原蛋白-壳聚糖悬浊液的硅胶管冰冻体裁剪成2. Ocm短节段放置于预冷的铝盘中，放入Alphal-2型冷冻干燥机，在-60°C、100 m torr条件下冻干24 h。在冷冻干燥机的真空环境中，冷冻支架中的溶剂冰晶发生升华，得到具有微孔结构的组件。真空状态下升温至0°C保持6 h，再继续升温至22°C保持30 60 min，解除真空，升至常温，即可制得干燥成形的壳聚糖组件。组件的装配和使用在所制备的半柱形组件内装载促神经再生物质，如胶冻状的睫状神经营养因子(CNTF)，并于神经近端处按从高到底的浓度转入不同的小间隔室内，置入一根聚已内脂制备的神经导管后，将两个半柱形组件合闭，并使用医用生物蛋白胶粘合封闭，形成ー种管状结构，使得周围神经修复材料周围富集有睫状神经营养因子(CNTF)。实施例三本发明所述的促进周围神经移植后神经再生的植入式可降解装置的制备
制备材料为股原蛋白。半柱形组件的制备称取胶原蛋白150mg溶于0. 05mmol/L冰醋酸溶液，4で条件下搅拌90min (18000r/min),负压抽真空后于4 °C冰箱中过夜，充分混合成凝胶状悬池液后将其注入专用模具中成型，并以2X10_5m/S的速度进入冷凝剂中后，将其放入预冷的铝盘中，于_40°C、IOOmtorr条件中冻干48h，制得干燥成型的胶原蛋白组件。组件的装配和使用组件的装配和使用在所制备的半柱形组件内装载促神经再生物质，如胶冻状的胶质源性神经营养因子(GDNF)，并于神经近端处按从高到底的浓度转入不同的小间隔室内，置入ー根以许旺细胞为种子细胞、去细胞神经为支架的组织工程神经后，将两个半柱形组件合闭，并使用医用生物蛋白胶粘合封闭，形成ー种管状结构，使得该组织工程神经修复材料周围富集有胶质源性神经营养因子(GDNF)。上述实施例一至三中所采用的专用模具为半柱状结构(如不锈钢棒或玻璃管)，半柱状凹面有n片分隔形成n+1层结构(n=l, 2, 3......),半径为I 5mm,长度可任意控制，直径和长度主要是根据所要修复的神经长度和直径决定，壁厚0. 2 1mm。具体使用时，可不同浓度的胶冻状促神经再生物质按照顺序注入两个半柱状的不同凹槽内，然后将周围神经移植物(如去细胞同种异体神经修复材料等)置于促神经再生物质表面，然后将两个半柱状组件合闭，两组间的空隙使用医用生物蛋白胶涂擦，干燥后可完全闭合。使得现有周围神经移植物周围富集有多种的神经再生物质，用于周围神经缺损移植修复用材料，以提高修复效果。根据与上述实施例类似的实验，本领域技术人员可以采用其他生物可降解的相容性材料来制备半柱形组件，例如藻酸盐、丝素蛋白、纤维素、甲壳素、几丁糖、聚羟基丁酸脂、聚已内脂、聚こ醇酸、脂肪族聚酯、聚磷酸酷、聚碳酸酷、聚氨酯及它们的共聚物。经测定，这些半柱形组件具有至少40N/mm2的断裂強度，因此，能够提供一定机械支持，保护装置内周围神经移植物，能維持形状不容易塌陷，防止纤维瘢痕组织长入。同吋，这些半柱形组件具有50% 80%的孔隙率，以及需5Mm 50Mm之间的微孔直径，因此具有一定的孔隙结构，有利于营养物质的通透，可使毛细血管和纤维组织长入，不妨碍装置内的周围移植物获得血管化，也避免其内所装载促神经再生物质大量外滲。 在周围神经缺损修复实验中，置入本发明所述的装置内的周围神经移植修复材料可选自用于周围神经缺损修复的人工合成材料、天然生物材料或者组织工程神经。所述人工合成材料是选自以下可降解的生物相容性材料聚乳酸、聚羟基こ酸、聚羟基丁酸脂、聚已内脂、聚こ醇酸、脂肪族聚酯、聚磷酸酷、聚碳酸酷、聚氨酯及它们的共聚物。所述天然生物材料是选自来源于有活性的自体、去细胞同种异体或去细胞异种生物体的神经、骨骼肌、血管、肌膜管、黏膜、羊膜以及无活性的壳聚糖、藻酸盐、丝素蛋白、纤维素、胶原蛋白、甲壳素、几丁糖。所述组织工程神经是种植有活性种子细胞的组织工程支架。所述的种子细胞是选自许旺细胞、骨髓间充质细胞、脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞、神经干细胞和诱导多能干细胞等可能对周围神经再生有益的活性并用于构建组织工程神经的种子细胞。置入本发明所述的装置内的促神经再生物质可选自神经营养因子，如神经生长因子、脑源性神经生长因子、神经营养素家族；神经分裂素，如睫状神经营养因子、和白细胞介素_6 ;非神经营养因子，如成纤维细胞生长因子、白细胞抑制因子、类胰岛素生长因子、表皮生长因子、胶质源性神经营养因子、血小板源性生长因子、转化生长因子3 ;或者它们的两种或两种以上的组合。这些促神经再生物质可參与周围神经再生、调节和创伤修复的物质，有保护周围神经损伤后的神经元及轴突，可促进轴突再生，加快神经修复作用。实施例四本发明所述的促进周围神经移植后神经再生的植入式可降解装置用于猕猴桡神经长段缺损的修复实验。在猕猴上臂桡神经深支起点以上Icm切取4cm长桡神经造成5cm长神经缺损，对神经端端进行标记，试验组使用实施例一所制备的植入式可降解装置进行修复，自体神经移植组使用相应长度的自体神经修复，去细胞神经移植组使用相应长度的单纯同种异体去细胞神经修复。术后克式针(直径I. 5_)固定肘关节屈135°。动态观察8月，并进行组织形态学、电生理学和行为学的评价。术后各组动物存活良好，实验组伤ロ愈合良好，未发现局部红肿、积液、破溃，实验动物未出现不良反应。术后8个月各组动物均恢复了伸腕功能，试验组伸腕动作幅度与自体神经移植组相当，优于去细胞神经移植组；神经电生理检测均可发现神经动作电位存在，并发现试验组的神经刺激阈值与自体神经组相当，低于去细胞神经组，最大振幅和神经传导速度与自体神经组无显著性差异，但优于去细胞神经组；组织学检测显示在试验组和自体神经移植组中，可见大量阳性染色的许旺细胞和神经纤維， 神经纤维排列整齐、规则，而去细胞神经组神经移植体远段S-IOO蛋白和神经微丝蛋白免疫组化染色见有少量的阳性染色许旺细胞和神经纤维且排列杂乱。上述结果显示了根据本发明所述的植入式可降解装置进行修复猕猴桡神经长段缺损是可行有效，且优于传统的单纯同种异体去细胞神经。
权利要求
1.一种促进周围神经移植后神经再生的植入式可降解装置，其特征在于所述装置是由两个对称的半柱形组件合拢形成的中空的柱形装置；在所述柱形装置内分隔成多个独立的小间室，用于装载不同浓度的促神经再生物质；所述柱形装置的两端是开放的，供周围神经移植修复材料从一端穿入并从另一端穿出；两个半柱形组件的间隙通过医用生物蛋白胶封闭成为封闭的管状结构；所述半柱形组件是由可降解的生物相容性材料制备的。
2.根据权利要求I所述的装置，其特征在于所述的半柱形组件具有至少40N/mm2的断裂強度。
3.根据权利要求I所述的装置，其特征在于所述的半柱形组件具有50% 80%之间的孔隙率，以及需在5Mm 50Mm之间的微孔直径。
4.根据权利要求I所述的装置，其特征在于所述的半柱形组件是由以下可降解的生物相容性材料制成的壳聚糖、藻酸盐、丝素蛋白、纤维素、胶原蛋白、甲壳素、几丁糖、聚乳酸、聚羟基こ酸、聚羟基丁酸脂、聚已内脂、聚こ醇酸、脂肪族聚酯、聚磷酸酷、聚碳酸酷、聚氨酯及它们的共聚物。
5.根据权利要求I所述的装置，其特征在于所述的周围神经移植修复材料是选自用于周围神经缺损修复的人工合成材料、天然生物材料或者组织工程神经。
6.根据权利要求5所述的装置，其特征在于所述人工合成材料是选自以下可降解的生物相容性材料聚乳酸、聚羟基こ酸、聚羟基丁酸脂、聚已内脂、聚こ醇酸、脂肪族聚酯、聚磷酸酯、聚碳酸酷、聚氨酯及它们的共聚物。
7.根据权利要求5所述的装置，其特征在于所述天然生物材料是选自来源于同种或异种天然生物组织，包括有活性的自体、去细胞同种异体或去细胞异种生物体的神经、骨骼肌、血管、肌膜管、黏膜、羊膜以及无活性的壳聚糖、藻酸盐、丝素蛋白、纤维素、胶原蛋白、甲壳素、几丁糖。
8.根据权利要求5所述的装置，其特征在于所述组织工程神经是种植有活性种子细胞的组织工程支架。
9.根据权利要求8所述的装置，其特征在干所述的种子细胞是选自许旺细胞、骨髄间充质细胞，脂肪间充质干细胞，脐带间充质干细胞，神经干细胞或诱导多能干细胞。
10.根据权利I所述的装置，其特征在干所述促神经再生物质是选自神经营养因子，如神经生长因子、脑源性神经生长因子、神经营养素家族；神经分裂素，如睫状神经营养因子、和白细胞介素_6 ;非神经营养因子，如成纤维细胞生长因子、白细胞抑制因子、类胰岛素生长因子、表皮生长因子、胶质源性神经营养因子、血小板源性生长因子、转化生长因子^ ;或者它们的两种或两种以上的组合。
全文摘要
本发明涉及一种促进周围神经移植后神经再生的植入式可降解装置。本发明所述的植入式可降解装置，是由两个对称的半柱形组件合拢形成的中空的柱形装置；在所述柱形装置内分隔成多个独立的小间室，用于装载不同浓度的促神经再生物质；所述柱形装置的两端是开放的，供周围神经移植修复材料从一端穿入并从另一端穿出；两个半柱形组件的间隙通过医用生物蛋白胶封闭成为封闭的管状结构；所述半柱形组件是由可降解的生物相容性材料制备的。本发明所述的植入式可降解装置具有简便、安全、高效的优点，可用于装载多种促神经再生物质，并将促神经再生物质按照神经远、近端形成浓度梯度，环绕于周围神经移植物的周围，形成有利于周围神经轴突再生的微环境。
文档编号A61F2/02GK102836016SQ201110164968
公开日2012年12月26日 申请日期2011年6月20日 优先权日2011年6月20日
发明者刘小林, 朱庆棠, 郑灿镔 申请人:中山大学附属第一医院
文档序号 :
【 1012058 】
技术研发人员：刘小林,朱庆棠,郑灿镔
技术所有人：中山大学附属第一医院
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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技术研发人员：刘小林,朱庆棠,郑灿镔
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