黄连解毒汤治疗帕金森病及帕金森综合征新制药用途的制作方法

2025-10-20 13:40:02 380次浏览

专利名称：：黄连解毒汤治疗帕金森病及帕金森综合征新制药用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及黄连解毒汤治疗帕金森病新制药用途，属于中药领域。
背景技术：
：帕金森病，又称震颤麻痹(ShakingPalsy，PD)，是一种中枢神经系统变性疾病，主要是因位于中脑部位"黑质"中的细胞发生病理性改变后，多巴胺的合成减少，抑制乙酰胆碱的功能降低，则乙酰胆碱的兴奋作用相对增强。两者失衡的结果便出现了"震颤麻痹"。临床以静止性震颤、肌张力增高、运动迟缓和姿势障碍等为主要表现。是中老年人的多发病症。帕金森综合征(Parkinsonism)作为一种更为广义的概念，集中了各种原因(感染、中毒、外伤、药物以及遗传等)造成的以黑质纹状体多巴胺神经元的退行性变以及纹状体多巴胺含量明显下降(或纹状体多巴胺受体的退行性变)为基础的一组临床症候群静止性震颤、肌僵直、行动迟缓、以及驼背、姿势反射消失和步僵。帕金森氏综合征的诊断，至少需要包括静止性震颤或行动迟缓在内的上述两个症状。目前对于帕金森病和帕金森综合征的治疗没有合适的中药制剂。黄连解毒汤(Huanglianjiedudecoction，HJD)源于唐代的《外台秘要》，由黄连、黄柏、黄芩、栀子4味中药组成，是中医清热解毒的经典方剂。经离体、整体及临床实验证实，可以治疗帕金森病及帕金森综合征。
发明内容本发明首先证实了黄连解毒汤对l-甲基-4-苯基-l,2，3,6-四氢吡啶离子(MPP+)所致大鼠嗜铬神经瘤细胞(PC12)损伤的保护作用。首先，离休实验研究。一、黄连解毒汤对MPP+诱导的PC12细胞损伤的保护作用1材料与仪器1.1动物wistar$大鼠，体重(350±20)g(购自吉林大学基础医学院实验动物中心，动物合格证号(吉)2003-0001)。给药前后，动物均饲养于32cmX45cmX20cm的不锈钢金属笼内，每笼3只，室温调节在24±2°C，自由摄食与饮水。1.2细胞、药品与试剂大鼠肾上腺嗜铬神经瘤细胞(PC12)由吉林大学第一医院神经内科胡林森教授惠赠。l-甲基-4-苯基-l，2,3，6-四氢吡啶离子(MPP+)，四甲基偶氮唑盐(MTT)，二甲基亚砜(DMSO)，吖啶橙，溴化乙锭均购自美国Sigma公司。DMEM高糖培养基，马血清(美国GIBCO)，新生牛血清(杭州四季青)。1.3仪器C02培养箱(德国HERAD-63450)，酶标仪(奥地利TECAN)，低速离心机(LD2-A北京医用离心机厂)，荧光倒置显微镜(日本OLYMPUSCK2)，流式细胞仪(美国BD)，96孔培养板(Costar美国)。2统计学处理结果均以x士s表示，数据用SPSSforwindows10.0版本软件进行t检验，多组间比较用单因素方差分析。3方法3.1HJD含药血清制备黄连、黄芩、黄柏，栀子均购于长春市药材公司，符合《中国药典》2005年版一部有关各项规定，经鉴定为毛茛科植物黄连CoptischinensisFranch干燥根茎，唇形禾斗植物黄苳ScutellariabaicalensisGeorgi干燥根，芸香科植物黄檗PhellodendronamurenseRupr除去栓皮的干燥树皮，茜草科植物栀子GardeniajasminoidesEllis干燥成熟果实。HJD(l号煎剂)黄连、黄柏、黄芩、栀子(9:6:6:9)分别用10倍、8倍、6倍水分别煎煮60、40、20min，合并煎液后浓縮至1.67g(生药量)'ml-l。2号(黄连、黄柏(3:2))和3号(黄苳、栀子(2:3))煎剂的煎煮方法同1号煎剂，浓縮至0.83g'ml-l。4号(黄连)和7号(栀子)煎剂的煎煮方法同前，最终浓縮至0.50g*ml-l。5号(黄柏)和6号(黄岑)煎剂的煎煮方法同前，浓縮至0.33g'ml-l。大白鼠24只，分为8组，每组3只。17组大鼠每天分别ig17号煎剂15mhkg-l，第8组大鼠ig等量自来水，每天两次，连续三天。于第三天下午最后一次给药后2h，以10%水合氯醛3mlkg-l麻醉，腹主动脉取血，全血在室温下静置2h，3500r*min-l离心20min，得1~7号含药血清和空白对照血清。于56。C灭活30min，0.22um滤膜过滤除菌后，置于-2(TC冰箱保存待用。3.2细胞培养及样品加入3.2.1PC12细胞培养PC12细胞置于含5%新生牛血清，10%马血清的DMEM高糖培养液中，并在含5%C02的37t培养箱中培养，细胞每23天更换一次培养液，当细胞长到80%即可传代培养。3.2.2在PC12细胞中加入M^P十将生长状态良好的细胞以2X105，ml-l接种于96孔培养板，每孔100ii1。24h细胞贴壁后去掉培养液，加入含不同浓度MPP+的培养液100ul，设阴性对照组(加入不含MPP+的培养液100lU)和空白对照组(在无细胞孔中加入不含MPP+的培养液100ul)。培养48h后，每孔加入5mg'ml-lMTT20u1，在培养箱中培养4h后去掉培养液，每孔加入150lU的二甲基亚砜(DMSO)，振荡5min后，用酶标仪在570nm处检测每孔的吸光度(OD)值。细胞存活率=(阴性组OD值-空白OD值)/(加药组OD值-空白组OD值)X100%3.2.3在PC12细胞中加入含药血清细胞接种同上。待细胞贴壁后去掉培养液，加入含200umol*L-lMPP+和不同浓度的1~7号含药血清的培养液100u1，血清浓度分别为10%和20%，设模型对照组(加入含200umol'L-lMPP+和相应浓度空白对照血清的培养液100yl)和阴性对照组(加入只含相应浓度的对照血清的培养液100u1)。细胞培养和检测同上。3.3荧光染色法观察细胞形态将细胞消化并调节密度为2X105*ml-l，接种于96孔板，每孔100ul，24h细胞贴壁后去掉培养液，加入含200iimol'L-l的MPP+和10%1号含药血清的培养液100"1，设模型对照组(加入含200umol'L-l的MPP+和10%对照血清的培养液100lU)和阴性对照组(加入只含10。/o对照血清的培养液100ul)。培养48h后去培养液，加入浓度为lumol'L-l的吖锭橙(AO)溶液和溴化乙锭(EB)溶液各10ul，室温下染色20min，于荧光显微镜下观察细胞所发出的荧光与细胞形态并用数码相机拍照。3.4流式细胞仪检测细胞周期及线粒体膜电位调整细胞浓度至1X106*ml-l接种于培养瓶中，培养24h后去掉培养液，加入含200umol'L-l的MPP+和10%1号含药血清的培养液5ml，设模型对照组(加入含200"mol'L-l的MPP+和10%对照血清的培养液5ml)和阴性对照组(加入含10。/。对照血清的培养液5ml)。培养48h后收集培养瓶中所有细胞，用PBS液洗两次，离心去上清后加入PI染液(含P150mg'ml國l，RNaselg'L-l，0.1%Tritonx-100)0.5ml，4。C避光染色30min，上流式检测细胞周期，采用软件ModFitLTTM3.0(美国BD公司)处理，得出细胞各周期百分比。用同样的方法收集细胞，并用PBS液洗细胞两次，离心去上清，然后加入含40nmohL-l的DioC6(3)荧光探针和0.5%新生牛血清的PBS液0.5ml,避光37t:反应15min，上流式细胞仪分析线粒体膜电位变化情况。4结果4.1MPP+对PC12细胞活力的影响结果，在25，50，100，200，400，800umol'L-lMPP+作用下，PC12细胞的活力逐渐降低，其IC50为207umol'L-l(见附图1)。取其整数值，本实验选择200umol'L-l的MPP+构建PC12细胞损伤模4.2含药血清对MPP+损伤PC12细胞活力的影响结果表明，1~7号含药血清对200umol'L-lMPP+损伤的PC12细胞活力的保护作用各不相同，其中10%和20%的1号血清(HJD含药血清)能明显提高受损伤PC12细胞的活力。与模型组比较，细胞活力分别由55.2%提高到98.6%(10%血清)和由71.7%提高到103.5%(20%血清)，差异显著(PO.Ol)。10%和20%的7号血清(栀子含药血清)也具有一定的保护作用，能将细胞活力分别提高到87.5%和91.7%(P<0.05)。3号血清和5号血清虽然也有一定的保护作用，但不显著。其它的单味药和药对的含药血清均无明显作用，见表l。表l17号含药血清对MPP+损伤PC12细胞活力的影响。n=3，xis<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>4.3MPP+损伤下的PC12细胞形态及HJD含药血清的保护作用AO与EB是DNA和RNA染料，与DNA呈插入方式结合，与RNA通过静电吸附作用结合。AO能进入胞膜完整的细胞，与DNA结合发出均匀的绿色荧光，而EB只能渗入膜受损的细胞，与DNA结合发出橘红色的荧光。当细胞凋亡时，细胞膜呈固縮状，因此细胞AO染色呈现为增强的、明亮的绿色荧光，甚至出现黄色。PC12细胞在正常状态下被AO染成均匀的绿色，见附图2A，在200umol'L-1的MPP十损伤下，有的细胞出现如上所述的凋亡状态，胞核呈亮绿色和黄色，有的呈现橘红色，说明细胞已坏死(附图2B)。而HJD含药血清能明显改善PC12细胞的损伤状态，(附图2C)。4.4HJD含药血清对MPP+诱导PC12细胞周期及线粒体膜电位的影响MPP+诱导下，PC12细胞的G2期和S期细胞由正常组的33.97%和16.01%分别减少到21.56%和10.99%，Gl期细胞从50.02%增加到67.46%(附图3A，B)。而HJD含药血清能将G2，S，Gl期的细胞比例回调至24.01%,12.83%和60.17%(附图3C)。从附图4A，B可见，MPP+可使PC12细胞线粒体膜电位比正常组有所下降，细胞的荧光强度降低。HJD含药血清，能减少线粒体膜电位的下降，使荧光强度有所回升(图4C)5讨论我们给大鼠分别灌服黄连解毒汤，黄连解毒汤的四种单味药及两组药对的水煎剂，然后取大鼠血清，观察含药血清对离体帕金森细胞模型(MPP+损伤的PC12细胞)的影响。结果黄连解毒汤能明显保护MPP+损伤的PC12细胞，其作用明显强于单味药及药对的作用，这说明黄连解毒汤的保护作用是由每一味中药协同作用的结果。同时我们也看到，7号(栀子)血清对受损伤的细胞也有较强的保护作用，其作用明显强于其它三味中药。这一结果提示，黄连解毒汤治疗帕金森病的主要活性成分可能来源于栀子，而来源于其它三味中药的成分对于帕金森病的治疗可能起到协同和辅助作用。我们的研究表明，MPP+导致的PC12细胞模型能使G2期的细胞减少和Gl期的细胞增加，这与FRANKS的研究中得到的MPP+能阻断PC12细胞从G0/G1期向S期的转变一致。MPP+还能使细胞的线粒体膜电位下降。而黄连解毒汤含药血清能在一定程度上减缓这些改变，说明黄连解毒汤是通过调节细胞周期和线粒体膜电位来保护PC12细胞的。其次，小鼠离体帕金森病模型实验。二、黄连解毒汤对帕金森整体模型的保护作用的研究1.实验动物C57/BL小鼠(由吉林大学基础医学院动物部购买)$，体重范围25士2g。2.帕金森整体模型制备MPTP:(1-甲基一4-苯基一2,3,5,6四氢吡啶)，每日按25mg/kg腹腔注射，连续8天。3.分组及给药方式将C57小鼠分3组，每组5只。给药组每天17.55g/kg剂量，灌胃黄连解毒汤，连续10天后，造模8天，造模的同时给药(相当于人剂量折算的4.5倍)。3.1模型组于实验开始第ll天开始造模，连续8天。3.2正常对照组选模同时，腹腔注射等量生理盐水。4指标检测方法4.1行为学检测4丄1爬杆实验将直径为25mm的橡胶圆球固定于一根长60cm，直径1.2cm的金属棒顶，棒上用胶布缠绕，定期训练小鼠，以熟悉该运动。计小鼠由杆顶爬至杆底的时间及动作。表2小鼠爬杆实验<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由上可得出给药能明显减少C57/BL小鼠造模前后爬杆时间差(PO.05)4丄2悬挂实验每天让小鼠用两前爪悬挂在一水平金属线上(直径lmm，距地面30cm)，记录小鼠时间(30S为上限)及动作。两后爪都抓3分，一后爪抓2分，都不抓1分，跌落0分。依动作迟缓酌情加减0.5分。表3小鼠悬挂实验<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注所有动物在造模前均得3分。由上可看出给药组能明显提高小鼠的四肢协调能力，尤其是后肢(P<0.05)，该模型组表现为后肢有拖线行为，并爬行缓慢。4丄3游泳实验用一20cmX30cmX20cm的水箱(大鼠笼)，水深20cm，35。C左右，每日训练，并记录小鼠在lmin游泳期间动作。连续游3.0分，大部分时间游，偶尔漂2.5分，漂>50%，2.0%偶尔游，大部分漂1.5分，漂在一边1.0分。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>由上可看出MPTP能导致小鼠脑内氧化应激反应，使S0D活性上升，而黄连解毒汤显著回调这种改变，说明给药组的脑内R0S(活性氧簇)水平下降，从而减弱脑内的氧化应激反应(P<0.05)。表6脑组织丙二醛(MDA)水平检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>由上可以看出MPTP能导致小鼠脑内细胞的明显的损伤(p〈0.01)，而黄连解毒汤能在程度上减小这种损伤，降低脑内升高的MDA水平。表7脑组织谷光甘肽过氧化物酶(GSH-PX)检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>GSH-PX水平也代表脑内氧化应激反应程度，说明黄连解毒汤能明显减弱脑内的氧化应激反应(P<0.05)4.3纹状体多巴胺(DA),3，4-二羟苯酰乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA)将纹状体加入0.05mol/L的过氯酸0.5ml制备匀浆，置-7(TC保存。然后离心10000r/min，30分钟，取上清液20lU用于高效液相色谱电化学检测。色谱条件色谱柱15X0.5cmID，填料LichrosorbeRP(10iim)。流动相6%甲醇-0.15mol/L氯乙酸缓冲液，内含0.1mmol/L的二乙胺四乙酸二钠(Na2EDTA)，125mg/L辛垸磺酸钠。流量为1ml/min。检测条件工作电压0.7V，灵敏度20nA，最小灵敏度10pg。表8对小鼠纹状体DA、DOPAC、HVA含量的影响(yg/g湿组织，±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>、)主与对照组比较，P〈0.01;*:gMPTP组比较，P〈0.01由上可见MPTP使小鼠纹状体DA、DOPAC、HVA分别减少92.6。/0、82.5。/0、72.7y。。黄连解毒汤可以减轻MPTP引起的DA、DOPAC、HVA的降低(PO.01)下面给出临床试验的典型实施例某男60岁，患帕金森病10余年，曾做过"苍白球毁损术"，术后症状反复。服用黄连解毒汤一个月后症状不同程度好转。某女，55岁，患帕金森病8年，四肢活动障碍。服用黄连解毒汤一个月后四肢活动明显改善，二个月后症状基本消失。某男70岁，患帕金森病10余年，曾服用多巴胺制剂多年，效果一直不理想，服用黄连解毒汤三个月后症状不同程度好转。说明书图1MPP+作用48h后的PC12细胞活力.n=3图2AO/EB荧光染色PC12细胞的形态改变(xl00)八.对照纟fl;B.MPP+200)imol'L-l;C.MPP+20(Vmol*L-land10%serumconcentmtingHJD.图3HJD含药血清对MPP+损伤的PC12细胞的周期影响A.对照组；B.MPP+200|imol'L-l:C.MPP+2OO4mo卜L-land10%serumconcentratingHJD.图4HJD含药血清对MPP+损伤的PC12细胞线粒体膜电位的影响A.对照组；B.MPP+200(imol'L-l;C.MPP+200(imo卜L-land10%serumconcentratingHJD权利要求1、黄连解毒汤治疗帕金森病及帕金森综合征新制药用途。其特征在于黄连解毒汤原料药重量配比为黄连6-12g、黄柏4-8g、黄芩4-8g、栀子6-12g。2、如权利要求1所述黄连解毒汤原料药重量配比最佳比例为黄连9g、黄柏6g、黄芩6g、栀子9g。3、如权利要求1或2所述黄连解毒汤原料药中栀子对大鼠嗜铬神经瘤细胞的损伤具有保护作用。全文摘要以离体、整体及临床试验证明了黄连解毒汤治疗帕金森病及帕金森综合征用途。其中离体实验证明黄连解毒汤对PC12细胞损伤具有保护作用；整体证明对小鼠帕金森病模型的有治疗作用；临床试验亦证明对帕金森病有很好的治疗作用。文档编号A61P25/00GK101336989SQ20071005584公开日2009年1月7日申请日期2007年7月5日优先权日2007年7月5日发明者周秋丽,健孙,李宏睿,段冷昕,瑾金,金润泉申请人:周秋丽

文档序号 : 【 1129950 】

技术研发人员：周秋丽,金瑾,段冷昕,金润泉,孙健,李宏睿
技术所有人：周秋丽

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