尿激酶型纤溶酶原激活剂a链与蜂毒素的融合蛋白及其制备的制作方法

2025-10-20 11:40:09 105次浏览

专利名称：：尿激酶型纤溶酶原激活剂a链与蜂毒素的融合蛋白及其制备的制作方法尿激酶型纤溶酶原激活剂a链与蜂毒素的融合蛋白及其制备发明领域本发明涉及融合蛋白质及其制备，特别是涉及人尿激酶型纤溶酶原激活剂a链(uPAa)与蜂毒素的结合形成的融合蛋白，及其制备方法和在肿瘤治疗中的应用。
背景技术：
：一百多年前，PaulEhrlish提出的"魔弹"("magicbullet")概念为肿瘤的靶向治疗提供了最初的构想。他的理论为以后研究人员构建单克隆抗体一毒素结合物，即免疫毒素以及其他嵌合毒素奠定了理论基础。肿瘤的重组免疫毒素治疗，是近年来随着肿瘤靶向治疗发展而出现的一种新型治疗方法。重组免疫毒素(RIT)是将某些细菌和植物产生的毒素蛋白，通过基因重组或者短肽连接等方式与抗体或某些细胞因子等连接形成的，具有细胞靶向识别和耙细胞杀伤两种功能，用以杀伤表面带有特定抗原或受体的靶细胞的新型嵌合分子。目前，肿瘤的生物治疗方法已成为继手术、放疗和化疗之后的第四种肿瘤治疗模式。随着越来越多的肿瘤细胞表面分子被发现并用作肿瘤靶向治疗的耙分子，重组免疫毒素在肿瘤靶向治疗中的地位日渐突出，已经成为肿瘤的生物治疗中的重要手段。肿瘤的靶向治疗是利用肿瘤细胞表面富含突变或过量表达的致癌基因的产物作为药物作用的靶点，因此在肿瘤治疗的同时不会损害正常的组织或细胞。靶向分子可以是肿瘤抗原的特异性抗体或肿瘤细胞表面过量表达的受体。而效应分子可以是放射性同位素、细胞毒药物、小分子细胞毒素或毒素大分子。尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)系统是基质降解酶系统的重要组成之一。降解细胞外基质需要一系列的蛋白酶的参与，纤溶酶(Pm)除直接降解细胞外基质成份外，还可激活金属蛋白酶参与细胞外蛋白水解作用，而肿瘤细胞分泌的uPA是纤溶酶形成的启动物。uPA作为体内重要的生理性调控分子参与多种生理和病理过程的调节，其本身的表达亦受多种因子包括激素、生长因子和细胞因子等的影响。uPA系统在肿瘤组织中的高表达与细胞的致癌性转化有关。细胞学实验表明，某些细胞致癌基因的激活可直接导致uPA系统成分的高表达。实验研究和临床资料均显示，尿激酶系统中的uPA和uPA受体(uPAR)与肿瘤转移呈明显的正相关。普遍认为，uPA系统可能成为一种新的抗肿瘤转移治疗的耙点。通过干扰uPA/uPAR的相互作用及抑制uPA活性来抑制肿瘤细胞侵袭转移，成为抗肿瘤侵袭转移治疗的一种新思路。uPA以其单链的前体尿激酶原(pro-uPA)的形式分泌，其纤溶活性较双链的uPA至少低几百倍。通过在lys158处催化断裂肽键K158-1159，pro-uPA转化为双链形式的uPA。a链含有生长因子样结构域，b链含有催化结构域。纤溶活性显著增强，但失去了纤维蛋白的特异性。这种活化可经纤溶酶、组织蛋白酶B和L、凝血因子XIIa、神经生长因子，前列腺特异性抗原等催化完成。uPA通过其生长因子结构域识别并结合uPAR的结构域使两者达到高效的结合。蜂毒素是蜂毒中发挥作用的主要物质，由26个氨基酸残基组成。蜂毒素分子的结构特征决定了它既可以溶于水中，又可以与膜自然结合，进而溶解细胞，而无需经过细胞内化。因此可以用蜂毒素替代b链(uPAb)发挥抗肿瘤作用，主要作用机理是使细胞膜的通透性增加，导致细胞内容物泄露和细胞裂解。蜂毒素分子量小，比起其他的一些如蓖麻毒素、白喉毒素等分子量较大的毒素免疫原性低，不易产生过敏反应，这些优点使其更具有研究与应用价值。本发明首次制备并提供了一种由人尿激酶型纤溶酶原激活剂a链(uPAa)与蜂毒素组成的融合蛋白，其制备方法及其在肿瘤治疗中的应用。
发明内容本发明的一个目的是提供一种由尿激酶型纤溶酶原激活剂a链(uPAa)与蜂毒素(蜂毒素)结合形成的融合蛋白，其中所说的uPAa链和蜂毒素分别与天然人uPA和天然蜂毒素至少有85%的序列同源性。在本发明的融合蛋白中，可以是与人uPAa链同源的区域位于融合蛋白的N-端，与天然蜂毒素同源的区域位于融合蛋白的C-端；也可以是与人uPAa链同源的区域位于融合蛋白的C-端，与天然蜂毒素同源的区域位于融合蛋白的N-端。也就是说，融合蛋白分子中，uPAa与蜂毒素的连接次序或位置是可以互换的。根据本发明的优选实施方案，所说的融合蛋白是以DNA重组技术产生的。根据本发明的优选实施方案，其中所使用的重组表达系统是酵母表达系统，更优选的是毕赤酵母，最优选的是毕赤酵母X-33。本发明将人uPAa链分子，或其有至少85%序列同源性的类似物与蜂毒素或其有至少85%序列同源性的类似物相融合，所形成的融合蛋白既保留了与uPAR相结合的活性，又保留了蜂毒素溶解细胞的活性。因此，本发明的融合蛋白既可以通过人uPAa链与表达uPAR的肿瘤细胞结合，在肿瘤细胞周围富集高浓度的rhuPAa-蜂毒素，借助蜂毒素的溶解细胞的活性，达到靶向杀伤肿瘤细胞的目的，同时，当uPAa-蜂毒素与uPAR结合后，还可以与双链活性的uPA竞争uPAR的结合位点，从而减弱了uPA降解细胞外基质的作用，最终达到抑制肿瘤细胞的粘附、迁移及侵袭的作用。实验研究证实本发明的rhuPAa-蜂毒素融合蛋白具有高效结合、靶向杀伤肿瘤细胞的活性。可以使用本领域熟知的方法，如PCR、RT-PCR方法、人工合成方法和构建筛选cDNA文库等方法获得编码人uPAa链的多聚核苷酸和编码蜂毒素的多聚核苷酸。用作PCR模板和用于构建cDNA文库的mRNA或cDNA可以来源于任何含有相应mRNA或cDNA的组织、细胞及文库等，如从人卵巢癌组织和工蜂毒腺cDNA文库获得，也可以用人工合成的方法获得。人工合成时可选用宿主偏爱的密码子，借以提高产物的表达效率。必要时，可采用本领域周知的方法对多聚核苷酸进行突变、缺失、插入和与其它多聚核苷酸连接等。可以使用本领域周知的各种方法，如通过PCR的方法，在保持各自阅读框不变的前提下，在编码序列的两侧引入适当的限制性内切酶位点，通过酶切产生粘性末端，并在DNA连接酶作用下，实现编码人uPAa链和编码蜂毒素的多聚核苷酸的粘性末端彼此连接，得到编码本发明融合蛋白的基因。如果需要，可在本发明的融合蛋白基因两侧引入适当的限制性内切酶识别位点。可用本领域公知的方法将含编码融合蛋白序列的基因序列克隆到各种适当的表达载体中。所用标准的分子克隆方法参见丄萨姆布鲁克等《分子克隆试验指南》第三版，科学出版社，2002。许多表达载体和其对应的宿主如酵母表达载体pPICZa，pPIC9，pHIL-sl(InvitrogenCorp.SanDiego，California,USA.)均可从市场上购得。可以将编码本发明融合蛋白或多肽的核苷酸序列克隆至酵母表达载体中。本发明优选的巴斯德毕赤酵母表达系统可以是胞内表达的，也可以是分泌表达的。这些载体都包括一个由大约0.9kb的5'醇氧化酶操纵子(AOX1)序列和大约0.3kb的转录终止基因的3'--序列组成的表达盒，因此可以便于目的基因在酵母染色体中整合与表达。表达融合蛋白的宿主可以是酵母、细菌、动物细胞、植物细胞等，但本发明优选的是酵母。融合蛋白或多肽可以存在于宿主细胞内，也可以是从宿主中分泌出来，但最好是在信号肽的帮助下从宿主细胞内分泌出来。本发明优选的信号肽是ci因子(aMF)。a因子信号序列由87个氨基酸组成，来自于啤酒酵母(S.cerevsia)的a性成熟因子前导序列。编码融合蛋白的核酸序列，可以插入至宿主染色体，或以游离质粒形式存在。得到携带融合蛋白基因的重组表达载体后，可使用通常的方法，如锂盐法、PEG法、原生质球法和电穿孔法等方法转化宿主细胞。其中，本发明优选的转化方法是电穿孔法。可通过人们熟知的技术加以鉴定，如收集并裂解细胞，提取DNA，然后用PCR方法鉴定被成功转化的细胞，即含有本发明DNA构建体的细胞。或者，可用抗人uPAa链或抗蜂毒素的抗体检测细胞培养上清或细胞破碎液中的蛋白。可以使用摇瓶或生物反应器，培养含有本发明DNA构建体的宿主细胞，以生产本发明的融合蛋白。所使用的培养基应能提供菌体(或细胞)生长和产物表达所需的物质，包含氮源、碳源、pH调节成分等，培养基配方应根据不同培养对象，通过试验获得。培养可分为两个阶段，第一阶段主要用于菌体(或细胞)生长，第二阶段主要用于产物的合成。可以用各种蛋白分离的方法自含有本发明DNA构建体的细菌或细胞培养物中分离、纯化融合蛋白，如盐析、有机溶剂沉淀、超滤、液相层析等技术及这些技术的组合。其中液相层析可以用分子筛、亲和、离子交换、疏水、反相等层析技术。我们的实验结果表明，本发明获得的融合蛋白rhuPAa-蜂毒素具有"一耙双效"的特点，一效是rhuPAa-蜂毒素与肿瘤细胞的uPAR结合后，蜂毒素释放杀伤肿瘤细胞；二效是当rhuPAa-蜂毒素与uPAR结合后，与双链活性的uPA竞争uPAR的结合位点从而减弱了uPA降解细胞外基质作用，抑制了肿瘤细胞的粘附、迁移及侵袭作用。本发明将uPA/uPAR系统作为治疗肿瘤的靶点，构建融合蛋白uPAa-蜂毒素，实现特异性靶点、高效结合、靶向杀伤肿瘤细胞，为肿瘤的治疗开辟一个全新的设计思路与途径。进一步的生物学实验表明，按照本发明方法制备的融合蛋白可以与卵巢癌细胞表面的受体靶向结合并且能够抑制卵巢癌细胞的生长。rhuPAa-蜂毒素抑制卵巢癌细胞生长的机制可能与其能够诱导卵巢癌细胞凋亡有关，而卵巢癌细胞的凋亡途径可能与线粒体途径有关。本发明中的融合蛋白可以有各种衍生物，这些衍生物可以是但不局限于其不同形式的盐、修饰后产物等。如在多肽的氨基、羧基、羟基、巯基上再进行修饰。所用的修饰剂可以是但不局限于聚乙二醇，葡聚糖等。本发明中的融合蛋白或其衍生物可以单独使用，优选的为与一种或多种药学上可接受的载体一起组成药物制剂。药物载体一般应与融合蛋白相容且不能对受体自身有害，典型的载体为水、盐水、糖类、醇类或氨基酸，它们须无菌且无致热原。药物制剂可通过本领域已知的方法制备。这些方法包括将融合蛋白与一种或多种辅助成分混合的步骤。优选的药物制剂包括含水的液体制剂和含水量低于10%或不含水的冻干制剂。这些制剂可以含有缓冲剂，盐类，小分子糖类等。本发明中的融合蛋白及其衍生物或其药物组合物可以通过任何已知的方法，包括注射(如皮下或肌肉)、静脉输注、透皮、吸入等方法给药。优选的方法为静脉输注或注射给药。治疗包括在一段时间内使用单一剂量或复合剂量。下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。图1显示重组质粒rhuPAa-蜂毒素-pPICZa转化酵母菌DNA的PCR鉴定电泳图谱其中泳道l、3~5、7-8为不同酵母菌转化子基因组DNA的PCR产物；泳道2为DNAmarker;泳道6为空质粒转化的酵母菌基因组DNA的PCR产物。图2显示纯化的rhuPAa-蜂毒素蛋白质的十二垸基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果(考马斯亮蓝染色)。其中泳道1为纯化后的rhuPAa-蜂毒素，M为宽分子量蛋白marker。图3显示融合蛋白rhuPAa-蜂毒素的Western免疫印迹分析结果。其中泳道1、2、3和4是本发明制备的rhuPAa-蜂毒素样品。图4显示SKOV3细胞中uPAR免疫荧光染色的结果。图5显示透射电子显微镜下观察不同浓度的rhuPAa-蜂毒素对人卵巢癌细胞系SKOV3细胞超微结构的影响。其中图5A为使用16.0ng/mlrhuPAa-蜂毒素组细胞超微结构的变化，图5B为使用g/mlrhuPAa-蜂毒素组细胞超微结构的变化。图6显示不同浓度rhuPAa-蜂毒素对人卵巢癌细胞系SKOV3细胞的增殖周期及凋亡的影响。其中图6A为使用0ug/mlrhuPAa-蜂毒素组细胞的增殖周期及凋亡的图像，图6B为使用2.0ng/mlrhuPAa-蜂毒素组细胞的增殖周期及凋亡的图像，图6C为使用4.0ug/mlrhuPAa-蜂毒素组细胞的增殖周期及凋亡的图像，图6D为使用8.0yg/mlrhuPAa-蜂毒素组细胞的增殖周期及凋亡的图像，图6E为使用g/mlrhuPAa-蜂毒素组细胞的增殖周期及凋亡的图像。具体实施方式以下借助实施例描述本发明的最佳实施方式。这些实施例旨在进一步举例阐明本发明，而不是以任何方式限制本发明待批权利要求的范围。实施例1:人UM3链基因的克隆和扩增1、.RNA的制备取手术过程中经快速病理证实为浆液性囊腺癌的卵巢癌组织放入液氮中速冻。使用Trizol试剂(InvitrogenCorp.SanDiego,California，USA.),以一步法提取卵巢癌组织RNA。具体步骤如下-具体地说，首先将冰冻的小块卵巢癌组织放入盛有液氮的研钵中研磨至粉末状。然后，将碾碎的组织移入1.5ml无RNA酶EP管中，加入约lmlTrizol。再加入200ul氯仿，剧烈振荡摇匀，室温下放置30秒。4'C离心(12000r/min)5分钟后，将上清液小心转移到另一个无RNA酶的EP管中。向其中加入等体积异丙醇，室温放置5分钟，并于4。C离心(12000r/min)5分钟，弃去上清。加入70%乙醇lml洗涤沉淀两次，4'C离心(12000r/min)5分钟。室温下空气蒸发残存乙醇后，将沉淀溶于50ulDEPC水中，进行RNA的分析与定量，取lul样品稀释100倍后经紫外分光光度计测定0026。和0028。，按下列公式计算其浓度和纯度。RNA含量RNA(ug/ml)40XOD26。X稀释倍数，0D26。/0D28。=1.82.O表示纯度合格。以琼脂糖凝胶电泳法，观察RNA的完整性。2、人"Wa链基因的克隆(RT-PCR法)取如上提取的人卵巢癌组织总RNAlug，按如下比例建立逆转录(RT)反应体系人卵巢癌组织总RNA1yg;10XRNAPCR缓冲液2u1;MgCl2(25腿ol/L)4ul;腦A酶抑制剂(40U/ul)0.5ul;dNTPs(各10mmol/L)2ul;AMV逆转录酶(200U/ul)lul;OligodT(20pmol/ul)lul;无RNA酶灭菌水加入至终体积20u1。于PCR仪上42。C反应60分钟，然后99°C5分钟使逆转录酶灭活。合成cDNA后，按照如下比例建立PCR反应体系上述cDNA反应液20y1;MgCl2(25國ol/L)6u1;10XLAPCR缓冲液8ul;上游引物5，-GTTCCATCGAACTGTGACTG-3，(SEQIDNO:1)1y1(20pmo1/u1);下游引物5'-GGTTCTCGATGGTGGTGAAT-3,(SEQIDNO:2)1"1(20pmol/y1);TaKaRaLATaq(5U/ul)lul;;灭菌超纯水至终体积100u1。PCR反应条件是94°C4分钟；94°C30秒，50°C30秒，72°C1分钟，共30个循环，然后72。C8分钟。对扩增产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳分析，观察片段大小，确定是否得到正确目的基因。3、克隆载体的构建、转化与扩增回收RT-PCR扩增的人uPAa链基因片段进行0.8%琼脂糖凝胶电泳分析。回收后，将人uPAa链基因片段与T载体16'C连接30分钟。连接反应体系包括人uPAa链RT-PCR产物0.10.3pmol;T载体0.03pmol;溶液I(含DNA连接酶和连接缓冲液，见Takara公司T载体试剂盒)5ul;灭菌超纯水至终体积10y1。按照常规方法，从37。C培养16小时的XL,-Blue阴性培养板(不含抗生素的LB琼脂平板)上挑取单个菌落(直径23mm)，接种于含有100mlLB培养基的1L培养瓶中，以制备感受态大肠杆菌细胞，并于-8(TC冻存备用。取一份冻存的感受态细胞，融化后加入上述连接产物，进行常规转化。然后取200ul已转化的感受态细胞涂布于含X-Gal、IPTG(二者可在涂菌前半小时涂于LB琼脂平板表面)和氨苄青霉素(lOOlig/ml)的LB琼脂平板上，37。C培养箱中培养1216小时。4、重组载体的鉴定随机t兆取转化后的白色单菌落("蓝白筛选")，接种于含氨苄青霉素G00ug/ml)的LB培养基中，37t:强烈震荡培养过夜，然后常规提取质粒DNA。取1u1溶解的DNA沉淀物进行琼脂糖凝胶电泳定量分析和酶切鉴定。37。C下用Sall、BglII双酶切鉴定消化2小时，1%琼脂糖凝胶电泳后根据内切酶谱鉴定为正确克隆。挑选酶切鉴定正确的克隆，提取质粒，用于DNA测序分析。实施例2:huPAa-蜂毒素毕赤酵母分泌型表达载体huPAa-蜂毒素-pPICZa表达载体的构建1、构建可任意替换uPAb链的huPAa基因真核表达载体骨架huPAa-X-pPICZa取上述测序鉴定正确含有huPAa的克隆质粒100ng，按如下比例在0.2mlEP管中建立PCR反应体系huPAa重组质粒100ng;含Mg"的10XLAPCR缓冲液10ul;dNTPs(各2.5,1/L)8u1;上游引物5'-CTGCTCGAGAAGAGATCTAACGAGCACCAAGTTCCATCGAAC-3，(SEQIDNO:3)lul(20pmol/ul);下游引物5'-CAGGAATTCTCAAATCTTAAACCGCGGGCCTCAGAGTCTTTT-3，(SEQIDNO:4)1yl(20pmol/yl);TaKaRaLATaq(5U/ul)lul;灭菌超纯水至终体积100u1。在PCR仪上进行循环扩增。扩增程序为94°C4分钟；94°C30秒，50°C30秒，72°Cl分钟，共30个循环，然后72t:8分钟。1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，然后进行0.8%琼脂糖凝胶电泳，分离并回收适当大小的PCR产物。2、huPAa-X-pPICZa表达载体的构建用Xhol和EcoRI消化如上述回收的PCR产物huPAa和载体pPICZa，琼脂糖凝胶电泳定量后，16'C连接过夜。连接反应体系如下目的基因0.10.3pmol;酶切后的载体pPICZa0.03pmol;IOX连接缓冲液1u1;T4DNA连接酶(350U/iU)lul;灭菌超纯水至终体积10ul。将连接产物与感受态细胞XLl-blue轻轻混匀，常规方法转化。取200y1已转化的大肠杆菌细胞涂布于含Zeocin(25ug/ml)的低盐LB琼脂平板上，37°C培养箱培养1216小时。挑取不同的克隆，于LB液体培养基中培养过夜，然后提取质粒，并进行Xhol和EcoRI双酶切鉴定。选取酶切鉴定正确的克隆，用质粒快速提取试剂盒提取质粒。进行DNA序列测定。3、huPAa-蜂毒素-pPICZa表达载体的构建根据genebank检索序列，人工合成带有特异性酶切位点的蜂毒素一组互补的寡核苷酸，5'-AATTCTCATTGTTGTCTCTTTCTCTTAATCCA織甜CM紅TGGCAAACCAGTAGTCAAAACCTTCAAAACAGCACCAATCTTGAACCGC-3'(SEQIDNO:5);5'-GGTTCAAGATTGGTGCTGTTTTGAAGGTTTTGACTACTGGTTTGCCAGCTTTGATTTCTTGGATTAAGAGAAAGAGACAACAATGAG-3，(SEQIDNO:6)两条链各取25umol与0.5molNaCl6ul建立20ul体系，95。C煮2分钟，80'C煮3分钟，缓慢冷却至室温。互补链退火后分别形成带有SacII和EcoRI粘性末端双链的接头。用SacII和EcoRI酶切huPAa-X-pPICZa载体，回收并进行琼脂糖凝胶电泳定量后，16'C连接过夜。连接反应体系如下退火的蜂毒素基因0.10.3pmol;huPAa-X-pPICZa0.03pmol;IOX连接缓冲液1u1;T4DNA连接酶(350U/U1)1U1;灭菌超纯水至终体积10nl。将连接产物与感受态细胞XLl-blue轻轻混匀，常规方法转化。取200ul已转化的大肠杆菌细胞涂布于含Zeocin(25ug/ml)的低盐LB琼脂平板上，37°C培养箱培养1216小时。挑取不同的克隆，于LB液体培养基中培养过夜，然后提取质粒并进行双酶(XhoI和SacII)切鉴定。选取酶切鉴定正确的克隆，用质粒快速提取试剂盒提取质粒。进行DNA序列测定。实施例3:rhuPAa-蜂毒素毕赤酵母表达体系的建立及筛选取测序正确的培养菌液，按质粒提取试剂盒说明书提取质粒DNA并用琼脂糖凝胶电泳法进行定量分析。取2025ug表达载体huPAa-蜂毒素-pPICZa，经SacI酶消化(线性化)后用酚/氯仿抽提并用乙醇沉淀。线性化的质粒用10ul超纯水溶解后置冰上备用。从毕赤酵母X-33的YPD阴性培养板上(不含抗生素的YPD琼脂平板)挑取单个菌落，接种于5mlYPD培养基中，250rpm，3(TC震荡培养8小时，常规方法制备酵母感受态细胞。然后取80u1上述感受态细胞，与2025yg线性化的重组表达质粒混合，移入0.2cm电转化杯内进行电转化。取50100y1转化后的菌液涂布于含Zeocin(100iig/ml)的YPD平板上，30'C培养箱培养23天，观察转化子的生长状况。然后用PCR方法(所使用的引物为上游引物5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3，(SEQIDNO:7)和下游引物5'陽ATCGATCTCACAGTGTTGACC-3，(SEQIDNO:8)，反应条件同上)筛选转化酵母菌。离心回收菌体后，以玻璃珠法提取酵母基因组DNA并进行PCR鉴定，扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，观察是否得到预期大小的基因片段。鉴定结果如附图l所示。实施例4:rhuPAa-蜂毒素的表达和纯化1、rhuPAa-蜂毒素的表达取上述鉴定结果阳性的克隆接种于10mlBMGY(pH6.0)培养基中，30。C震荡培养24小时，至0D6。。达到2.06.0时收集细胞。用等体积(10ml)BMMY(pH6.0)重悬细胞沉淀，3(TC震荡培养，诱导表达。诱导过程中，每24小时补充一次甲醇至终浓度0.5%，同时补充灭菌超纯水，使发酵液总体积保持不变。在培养的第0、24、48、72、96、120、144和168小时等时间点各取0.5ml发酵液，离心收集上清用于蛋白质分析(SDS-PAGE，WesternBlot和N-端氨基酸序列分析)。2、rhuPAa-蜂毒素的纯化(1)溶液与试剂溶液A:HAc-NaAc缓冲液200mmol/L(pH4.0);溶液B:20mmol/LHAc-NaAc缓冲液(pH4.0);溶液C:溶液B含2mol/LNaCl;溶液D:1%(v/v)TFA;溶液E:0.1%(v/v)TFA;溶液F:溶液E含100%乙腈。(2)1MonoS阳离子柱层析用10倍柱体积溶液B平衡MonoS阳离子层析柱(Sigma公司)。用0.5mol/LNaOH调整发酵上清液pH值为4.0,离心(12000rpm)10分钟，去除颗粒物质，而后上清添加1/10体积溶液A缓冲液。以0.5ml/min的速率加样至MonoS阳离子树脂，波长280nm,260nm紫外在线监测。加样结束后，用溶液B冲洗至OD280值降至基线。然后用溶液B和溶液C梯度洗脱，并分部收集蛋白峰。SDS-PAGE方法确定huPAa-蜂毒素的洗脱峰。(3)Source30RPC反相疏水柱层析用10倍柱体积溶液E平衡source30RPC反相疏水层析柱(Sigma公司)。然后将上述收集的蛋白样品添加1/10体积溶液D。以0.5ml/min的速率加样，波长280nm,260nm紫外在线监测。加样结束后，用溶液E冲洗至0028()值降至基线。用溶液E和溶液F进行梯度洗脱，并分部收集蛋白峰。SDS-PAGE方法确定huPAa-蜂毒素的洗脱峰。15%SDS-PAGE分析结果显示，经此方法纯化的huPAa-蜂毒素纯度可达到约95%(参见附图2)。实施例5:rhuPAa-蜂毒素融合蛋白的理化性质鉴定1.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)用SDS-PAGE法进行蛋白质分子量测定和初步定量分析。方法如下配制15%分离胶5%浓縮胶。分别取每24小时培养物上清按4:1比例加入5XSDS样品缓冲液，混匀后，煮沸35分钟。取上述样品，冷却至室温后，离心(lOOOOrpm)30秒，取上清每孔加样20yl。40V电泳至浓縮胶与分离胶交界处，调整电压到IOOV，继续恒压电泳分离。考马斯亮蓝染色并脱色后，观察分析结果。2.表达产物的Western印迹分析按照常规方法将发酵液上清经SDS-PAGE后，转印到硝酸纤维素(NC)膜上，室温干燥3060分钟。将上述NC膜置于平皿中，加入20ml封闭液(含0.2%BSA的TTBS)，室温轻轻振荡23小时或4'C封闭过夜。然后，将NC膜放入杂交袋中按0.lml抗体溶液/cr^膜加入兔抗人uPA抗体，室温振荡14小时。TTBS漂洗35次后，将用抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(1:2001:1000)，加入杂交袋中，与NC膜一起室温振荡24小时。加入lml0.3%(W/V)NiCl或CoCl2及10u130%&02溶液。洗膜后，将膜移入显色液中，室温下轻轻摇动并观察显色反应。结果如附图3所示。3)表达产物的氨基酸序列分析蛋白质的一级结构是其高级结构的基础，用基因重组技术表达分泌型蛋白时，表达的异源蛋白在加工成熟过程中容易出现信号肽错误切割现象，继而影响表达产物的高级结构和生物学活性。因此，在SDS-PAGE确定分子量正确的情况下，应对所表达的重组蛋白进行蛋白质N-末端的氨基酸序列测定，以确定其一级结构的正确性。我们的测序结果表明，按照本发明的rhuPAa-蜂毒素融合蛋白具有与预期的氨基酸序列。实施例6:rhuPAa-蜂毒素的生物学活性本实施例通过观察rhuPAa-蜂毒素对人卵巢癌细胞SKOV3细胞的形态、生长曲线、细胞增殖周期、凋亡、细胞凋亡相关蛋白等的影响，判断和确定本发明生产的rhuPAa-蜂毒素的生物学活性。1.RT-PCR方法检测SKOV3细胞株uPAR的表达收集SK0V3L5X1()6个细胞，加lmLTrizol吹打后室温放置5分钟。然后提取SKOV3细胞株的RNA(参见实施例1),并以RT-PCR方法检测uPAR的表达(使用的上游引物为5，一CAGTGTAAGACCAACGGGGAT-3'下游引物5'一TCAGGTTTAGGTCCAGAGGAG-3')。结果表明，在SKOV3细胞株中，uPAR表达量较高。将预先清洗、经多聚赖氨酸处理过高压消毒的盖玻片放入24孔培养板。然后将已消化、离心洗涤的SK0V3细胞(用含10%胎牛血清H-DMEM培养液重悬)加入24孔板(0.5ml/孔)。将培养板置于37°C，5%C02孵箱继续培养，约24小时后培养至细胞对数生长期。实验组加入huPAa-蜂毒素使其终浓度达到4.0Ug/ml、8.0iig/ml,对照组加入培养液至等体积。24小时后取出24孔板，吸出培养液，加入PBS冲洗两次。37°C，用4%多聚甲醛固定30分钟后取出细胞爬片，用蒸馏水冲洗2次。室温干燥，-2(TC冻存，于两周内使用。细胞爬片加入蒸馏水水化30分钟。滴加0.l%TritonX-100，处理10分钟。0.01MPBS洗三次(5分钟/次)后，用0.3%H2O2溶液阻断内源性过氧化物酶15分钟后，再次用PBS洗3次并用血清封闭30分钟。然后倾去血清，加入兔抗人uPAR多克隆抗体，37°C1小时。以PBS代替一抗作为阴性对照。PBS洗3次后加入FITC标记的羊抗兔抗体，室温避光孵育30分钟。PBS洗30分钟(避光)后用甘油封片。激光共聚焦显微镜观察结果显示，SKOV3细胞表面的uPAR表达呈强阳性(见附图4)。2.本发明的融合蛋白huPAa-蜂毒素对人卵巢癌细胞SKOV3的作用(1)、MTT法测定huPAa-蜂毒素对SK0V3细胞生长的抑制作用取指数生长期的SK0V3细胞(1X104)接种2块96孔板。其中1块96孔板为正常加药组，另外1块为uPAR抗体拮抗处理后加药组。每个浓度设3个平行孔。正常加药组huPAa-蜂毒素浓度分别为0.1ug/ml、0.2ug/ml、0.4"g/ml、0.8ug/ml、1.6ug/ml、3.2ng/ml、6.4ug/ml、12.8wg/ml，对照组加入10%胎牛血清的H-DMEM培养液至等体积放入37°C，5%(;02孵箱培养。uPAR抗体拮抗后加药组预先在每孔内加入uPAR抗体20yg/ml，37°C，5%C02培养2小时后再分别按上述浓度加入huPAa-蜂毒素，对照组加入10%胎牛血清的H-DMEM培养液至等体积后放入37r，5%0)2孵箱培养。24小时后取出96孔板，向各孔内加入MTT溶液20ul(5mg/ml)，37°C5%C02孵育4小时后终止培养。小心吸弃孔内上清液，每孔加入100ylDMSO，振荡10分钟。待沉淀完全溶解后在Bio-red550酶标仪上测定吸光度值(OD值)。按下列公式分别计算两组在不同浓度huPAa-蜂毒素作用后的细胞生长抑制率(三次重复的平均值)。以细胞生长抑制率对药物浓度做曲线，求出IC50。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>结果如下列表1所示。可见拮抗组中存活的细胞明显多于rhuPAa-蜂毒素组，提示由于在拮抗组中预先加入uPAR多克隆抗体，该抗体可以与SK0V3细胞中的uPAR结合，从而使拮抗组中可供rhuPAa-蜂毒素结合的uPAR的受体数量减少，进而释放蜂毒素杀伤肿瘤细胞的能力减低。结果表明本发明的rhuPAa-蜂毒素具有耙向结合受体uPAR的能力，也证明融合状态下的rhuPAa-蜂毒素无毒或者低毒性，融合蛋白只有与其受体结合后才会发挥毒性作用。表1.拮抗组与rhuPAa-蜂毒素组对SKOV3的生长抑制率<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>(2)、透射电子显微镜观察将胰酶消化80%融合状态的SK0V3细胞，细胞计数以1X107接种于250ml培养瓶中。实验组加入终浓度为4.0ug/ml、8.0ug/ml，huPAa-蜂毒素作用24h。对照组加入至与实验组等体积的培养液。PBS洗2-3次后，以0.25%胰蛋白酶细胞消化，用含血清的培养液终止反应。800rpm离心5分钟并用PBS洗2-3次。最后一次离心后，形成的细胞团块轻加入l一2ml的戊二醛，4'C放置2小时并用1%鹅酸在4'C固定1小时。弃去鹅酸液，PBS洗2次，每次20分钟。0.5%醋酸双氧铀预染，室温，摇床过夜。用30%、50%、70%、90%，100%梯度乙醇脱水各10—15分钟，最后用100%乙醇脱水2次每次10分钟。用Epon812环氧树脂包埋，LKB-III型超薄切片机半薄切片定位后做超薄切片。P/。(w/v)醋酸双氧铀与柠檬酸铅双重染色。JEM-1200EX透射电子显微镜观察。附图5所示的结果表明，在一定浓度范围内，凋亡可能是rhuPAa-蜂毒素抑制卵巢癌细胞生长的作用机制，而在浓度过高时其对卵巢癌细胞的作用可能是直接的。(3)、流式细胞术检测不同浓度huPAa-蜂毒素对SK0V3细胞周期及凋亡率的影响收集分别经0ng/ml、2.0yg/ml、4.0yg/ml、8.0ug/ml、16.0ug/mlhuPAa-蜂毒素作用24小时的各组SK0V3细胞5X106个；以0.25%胰蛋白酶细胞消化，制成细胞悬液；1000rpm5分钟离心后PBS清洗2-3次，70%冰乙醇固定，并在4。C下保存。检测前以1000rpm离心5分钟，弃上清后加入20ugRNaseA;37。C水浴中保温30分钟后，加入800ulPI染液混匀。于4。C下避光保存30分钟后，在流式细胞仪上检测。附图5所示的结果表明，rhuPAa-蜂毒素可通过影响SK0V3细胞的周期分布，使之阻断在S期，同时诱导SK0V3细胞凋亡，进而抑制卵巢癌细胞的分裂增殖达到抑制其生长的目的。序歹ij表<no>吉林圣元科技有限公司<120>尿激酶型纤溶酶原激活剂a链与蜂毒素的融合蛋白及其制备<140><141><160>8<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计的用作构建克隆载体的PCR扩增引物。<400>1GTTCCATCGAACTGTGACTG<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计的用作构建克隆载体的PCR扩增引物。<400>2GGTTCTCGATGGTGGTGAAT<210>3<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计的用作构建表达载体的PCR扩增引物。<400>3CTGCTCGAGAAGAGATCTAACGAGCACCAAGTTCCATCGAAC<210>4<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计的用作构建表达载体的PCR扩增引物。<400>4CAGGAATTCTCAAATCTTAAACCGCGGGCCTCAGAGTCTTTT<210>5<211>93<2I2>DNA<213>人工序列<220><223>化学合成的蜂毒素的编码序列。<400>5AATTCTCATTGTTGTCTCTTTCTCTTAATCCAAGAAATCAAAGCTGGCAAACCAGTAGTCAAAACCTTCAAAACAGCACCAATCTTGAACCGC<210>6<211>87<212>DNA<213>人工序列<220><223>化学合成的蜂毒素的编码序列。<400>6GGTTCMGATTGGTGCTGTTTTGMGGTTTTGACTACTGGTTTGCCAGCTTTGATTTCTTGGATTMGAGAMGAGAC.AACAATGAG<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计的用作PCR鉴定的引物。<400>7GACTGGTTCCAATTGACAAGC<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计的用作PCR鉴定的引物。<400>8ATCGATCTCACAGTGTTGACC<221>mutation<222>(13)...(21)<223>额外添加N-糖基化位点突变部分的引物序列<400>25ctgggcgccccaaatactactatctgt27<210>26<211>27<212>DNA<213>人工序列<220<221>mutation<222>(13)...(21)<223>额外添加N-糖基化位点突变部分的引物序列<400>26ctgggcgccccaaatcacactatctgt27<210>27<211>27<212>DNA<213>人工序列权利要求1、一种由尿激酶型纤溶酶原激活剂a链(uPAa)与蜂毒素结合形成的融合蛋白，其中所说的uPAa链和蜂毒素分别与天然人uPA和天然蜂毒素至少有85％的序列同源性。2、根据权利要求l的融合蛋白，特征在于所说的融合蛋白是以DNA重组技术产生的。3、根据权利要求1的融合蛋白，特征在于所说的融合蛋白是所使用巴斯德毕赤酵母系统表达产生的。4、根据权利要求1的融合蛋白，特征在于所说的融合蛋白分子中，uPAa与蜂毒素的连接次序是可以互换的。5、权利要求1的融合蛋白在于生产肿瘤治疗药物中的应用。全文摘要本发明提供了一种由尿激酶型纤溶酶原激活剂a链与蜂毒素结合形成的融合蛋白、其制备方法及该融合蛋白质在肿瘤治疗中的应用。文档编号A61P35/00GK101337992SQ200710055840公开日2009年1月7日申请日期2007年7月4日优先权日2007年7月4日发明者许天敏,颜炜群申请人:吉林圣元科技有限责任公司

文档序号 : 【 1129949 】

技术研发人员：颜炜群,许天敏
技术所有人：吉林圣元科技有限责任公司

备注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除

颜炜群丨许天敏丨吉林圣元科技有限责任公司