琥珀酰酪蛋白铁(iii)及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种琥拍酰酪蛋白铁(III) (iron(III) caseinsuccinylate),其特征在于铁含量在4. 5重量％和7重量％之间并且在水中的溶解率为大约92%以上。
本发明进一步涉及一种用于制备琥珀酰酪蛋白铁(III)的方法。
背景技术：
铁衍生物在药品中广泛使用，用于预防和治疗贫血和妊娠期铁缺乏、吸收不良综合征、哺乳期铁缺乏和生长期铁缺乏。其中，蛋白琥拍酸铁(Iron Protein Succinilate) (通常指的是首字母缩写词IPS)因其生物利用度和耐受性特性而尤为杰出。
意大利专利IT1150213中描述了 起始于牛奶蛋白而获得的IPS的化学、物理学和生物学性质以及制剂(被称为Ironlat)。此外，Ironlat的溶解率在pH>5时表示为对于含有6. 7%的铁的络合物而言，是部分溶解的；并且对于含有4. 6%的铁的络合物而言，是完全溶解的。
Cremonesi 等人在 International Journal of Clinical PharmacologyTherapy and Toxicology 31卷(1993)40-51页中指出琥拍酰酪蛋白铁(III)(起始于琥拍酰酪蛋白而获得的铁(III)络合物)的化学和药理学性质。在体内实验中，相对于其它铁衍生物， 该产品(具有等于5%的铁含量)显示出更好的胃肠耐受性。
欧洲专利EP939083B1中描述了一种用于生产琥珀酰酪蛋白铁(III)的方法，该方法提供使用特定的撕碎和干燥程序以克服产品中存在不溶性成分的问题。此外，还描述了作为待用原料的食品级酪蛋白在琥珀酰酪蛋白铁(III)的生产工艺中的用途。
为了有助于将产品中的微生物污染保持在规定的极限内，在工艺中加入尼泊金甲酯和尼泊金丙酯防腐剂；当分析最终产品时，分别测定以3%和1. 05%的水平存在的尼泊金甲酯和尼泊金丙酯。防腐剂的这种用途同样在专利EP1776382B1中有所描述，其介绍了在工艺中湿式造粒与产品的喷雾干燥或冷冻干燥结合使用以促进溶解过程。
专利申请EP319664提出了一种基于琥珀酰酪蛋白铁(III)的酶促降解的方法以克服在该络合物中观察到的溶解率和粘度的问题，尤其是当铁的特定值超过10%时。
国际专利申请W02007/065812描述了琥珀酰酪蛋白铁(III)的制备，在悬浮液中操作的所述制备不仅进行琥珀酰化反应，而且随后进行使用铁(III)离子的络合反应，然而并未解决关于琥珀酰酪蛋白铁(III)溶解困难的问题。事实上，该专利申请没有提供关于所获得的络合物的溶解的信息，并且没有测定可能获得的溶液的粘度。
当特定铁含量超过5%的极限时，这种溶解问题尤为明显。
由于水溶液中产品浓度增加而观察到的粘度增加的现象使得超过预定浓度时使用琥珀酰酪蛋白铁(III)变得困难，或者甚至阻碍了超过预定浓度时使用琥珀酰酪蛋白铁 (III)。
除非使用超过15ml溶液的制剂，否则这些作用的结合会将产品的剂量限制到不超过800mg的值,相当于每剂大约40mg的铁(III)。
此外，琥珀酰酪蛋白铁(III)的水溶液的粘度使得通过过滤和微细过滤来降低产品中微生物含量的操作复杂化，并且要求使用大量的防腐剂。
因此，显而易见的是，现有技术没有提供用于克服琥珀酰酪蛋白铁(III)(一种高效治疗各种形式的铁缺乏的药物)溶解问题的简单方案。发明内容
目前，人们已经发现如果将食用酪蛋白(所述食用酪蛋白已经经受旨在除去蛋白质杂质、无机杂质和/或提高磷/氮比例(P/N比例)的纯化工艺)用作原料，那么在琥珀酰酪蛋白铁(III)的生产中可以获得令人吃惊的优势。事实上，因此有可能获得琥珀酰酪蛋白铁(III)，其特征不仅在于含有更少杂质的蛋白质性质，而且意想不到地在于改善的水中溶解率。这种改善的溶解率使其有可能获得水溶液和/或悬浮液，所述水溶液和/或悬浮液显示出比起始于商购的食品级酪蛋白而获得的粘度更低的粘度。
关于酪蛋白，根据本发明的表述“蛋白质杂质”用于表示与各种变体酪蛋白不同的蛋白质，所述蛋白质杂质借助于采用考马斯亮蓝(Coomassie Blue)染色和密度计分析的一维电泳来测定。优选地，本发明的所述蛋白质杂质是与α-SI酪蛋白、a-S2酪蛋白、β酪蛋白、K酪蛋白和/或假K酪蛋白不同的蛋白质。
类似地，关于琥珀酰酪蛋白铁(III)，根据本发明的表述“蛋白质杂质”用于表示与各种变体琥珀酰酪蛋白不同的物质，所述蛋白质杂质借助于采用考马斯亮蓝染色和密度计分析的一维电泳来测定。优选地，本发明的所述蛋白质杂质是与α-Sl酪蛋白、a-S2酪蛋白、β酪蛋白、K酪蛋白和/或假K酪蛋白(pseudo-kappa casein)的琥拍酰产品不同的琥拍酰蛋白质。
根据本发明的表述“无机杂质”用于表示硫酸灰分。
术语“P/N比例”用于表示样品中存在的以重量计的磷的量(借助于ICP技术来测定)和以重量计的氮的量(通过元素分析来测定)之间的比例。
根据本发明，以重量百分比表示的值(重量％)应当旨在相对于琥珀酰酪蛋白铁 (III)的总重量或酪蛋白的总重量。
因此，本发明的目的是琥珀酰酪蛋白铁(III)，其特征在于铁含量在4.5重量％和 7重量％之间并且在水中的溶解率为大约92重量％以上。优选地，这种在水中的溶解率被视为在大约11. 5份水中的溶解率。
所述琥珀酰酪蛋白铁(III)进一步含有蛋白质杂质，所述蛋白质杂质的量为大约 15%以下，优选大约10%以下和/或P/N比例为大约5%以上，优选大约5. 5%以上。
本发明的另一个目的是一种用于制备琥珀酰酪蛋白铁(III)的方法，其包含以下步骤
a)将酪蛋白和琥珀酸酐在水里反应以获得琥珀酰酪蛋白，
b)将琥珀酰酪蛋白与三氯化铁(III)反应以获得琥珀酰酪蛋白铁(III)，
其特征在于根据步骤a)的所述酪蛋白是纯化的酪蛋白，其具有低的蛋白质杂质和 /或无机杂质含量和/或高的P/N比例。
优选地,所述蛋白质杂质的含量为15重量％以下,所述无机杂质的含量为1重量％ 以下，并且以重量计的磷含量与以重量计的氮含量之间的比例为大约5重量％以上。
更优选地，所述蛋白质杂质的含量为大约10重量％以下和/或所述无机杂质的含量为大约O. 4重量％以下和/或磷重量含量与氮重量含量之间的比例为大约5. 5%以上。
本发明所述蛋白质杂质是与α -SI酪蛋白、a -S2酪蛋白、β酪蛋白、K酪蛋白和 /或假K酪蛋白不同的蛋白质。
通常根据其制备中应用的沉淀技术来鉴定食用酪蛋白借助于酸化来进行酸凝酪蛋白(acid casein)沉淀,使用凝乳酶(rennet)获得的酪蛋白是酶凝的(presamic),通常也被称为凝乳酶凝酪蛋白(rennetcasein)。
根据本发明，作为原料使用的食用酪蛋白可以是酸凝酪蛋白或酶凝酪蛋白 (presamic casein)。
不管类型(酸凝或酶凝)，这些商购产品通常没有分析文件；典型的指示参数是水含量、蛋白质含量(通过将倍增因数应用于总氮值来测定)、微生物污染水平和粒度测量。这种特性描述水平完全适合在食品工业中使用酪蛋白，但是我们目前已经发现琥珀酰酪蛋白铁(III)的制备需要对该原料进行深入的分析评价。
根据本发明用于制备琥珀酰酪蛋白铁(III)的、作为原料使用的商购食用酪蛋白和纯化的酪蛋白借助于反相HPLC,根据Bonizzi等人Journal of Chromatography A 1261 卷(2009) 165-168页(并入本文用于参考)指示的方法进行分析。
因此，有可能鉴定三种类型的酪蛋白α -S1、a -S2、β、κ和假κ。
通过一维和二维电泳分析，使用考马斯亮蓝作为指示剂，伴随着各种类型的酪蛋白及其衍生自其转录后修饰(如糖基化和磷酸化)的各种变体的分离，还有可能评价蛋白质杂质的存在。
特别地，使用含有14%聚丙烯酰胺凝胶的SDS-PAGE电泳(采用考马斯亮蓝染色和基于以不同量的BSA构建的定标线的密度分析)来定量测定蛋白质杂质。
根据欧洲药典(FarmacopeaEuropea, method Eu. Pharm. 2. 4. 14),使用硫酸灰分方法也可以分析所述酪蛋白和纯化的酪蛋白。然后通过ICP技术来测定其磷(P)含量，并且通过元素分析来测定氮(N)含量，因此将关于磷所观测的重量除以关于氮所观测的重量并且将结果乘以100来计算P/N%比例。下表I显示针对各种类型的酪蛋白，即商购食用酪蛋白(酸凝和酶凝)和根据本发明方法的纯化的酪蛋白获得的结果。
表I
酪蛋白原料蛋白质杂质硫酸灰分P/N%酸凝酪蛋白实施例化合物I和215%1. 6%酶凝酪蛋白实施例化合物320%9. 2%实施例4实施例8A和9A5%0. 4%5. 5%实施例5实施例8B9%0. 9%5. 1%实施例6实施例8C8%0. 2%5. 6%
权利要求
1.一种琥珀酰酪蛋白铁(III)，其特征在于铁含量在4.5重量％和7重量％之间并且溶解率为大约92%以上。
2.根据权利要求1所述的琥珀酰酪蛋白铁(III)，其特征在于其含有的蛋白质杂质的量为大约15重量％以下,优选大约10重量％以下。
3.根据权利要求1所述的琥珀酰酪蛋白铁(III)，其特征在于其具有的磷/氮比例为大约5重量％以上，优选大约5. 5重量％以上。
4.一种用于制备琥珀酰酪蛋白铁(III)的方法，其包含以下步骤a)将酪蛋白和琥珀酸酐在水里反应以获得琥珀酰酪蛋白，b)将琥珀酰酪蛋白与三氯化铁(III)反应以获得琥珀酰酪蛋白铁(III)，其特征在于根据步骤a)的所述酪蛋白是纯化的酪蛋白，其具有的蛋白质杂质含量为 15重量％以下和/或无机杂质含量为I重量％以下和/或磷/氮比例为大约5%以上。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述蛋白质杂质含量为大约10重量％以下和/或所述无机杂质含量为大约O. 4重量％以下。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述蛋白质杂质是与α-Sl酪蛋白、a-S2 酪蛋白、β酪蛋白、K酪蛋白、假K酪蛋白不同的蛋白质。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述纯化的酪蛋白具有的磷/氮比例为大约5重量％以上。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述纯化的酪蛋白是从酸凝酪蛋白或酶凝酿蛋白获得的。
9.根据权利要求4所述的方法，其包含琥珀酰酪蛋白铁(III)水溶液的微细过滤的额外步骤。
10.一种琥珀酰酪蛋白铁，其能够通过根据权利要求4-9中任一项所述的方法获得。
11.一种药物组合物，其含有根据权利要求1至3和/或10所述的琥珀酰酪蛋白铁 (III)和至少一种生理学上可接受的赋形剂。
12.根据权利要求11所述的组合物，其特征在于其是液体或固体形式，优选液体形式。
13.根据权利要求12所述的组合物，其特征在于所述液体形式为溶液或悬浮液，优选水溶液。
14.根据权利要求11所述的组合物，其特征在于所述组合物是含有大约8重量％的琥珀酰酪蛋白铁(III)的溶液，所述溶液具有的粘度为大约400mPa·秒以下，优选大约 300mPa ·秒以下。
15.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中相对于所述组合物的总重量，其中含有的琥珀酰酪蛋白铁(III)的量在5重量％和15重量％之间，优选6重量％和12重量％ 之间，更优选7重量％和9重量％之间。
16.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其用于口服或肠胃外使用，优选用于口服使用。
17.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其用于治疗铁缺乏。
18.根据权利要求17所述的组合物，其用于治疗贫血、妊娠期铁缺乏、吸收不良综合征、哺乳期铁缺乏和生长期铁缺乏。
全文摘要
本发明涉及一种琥珀酰酪蛋白铁(III)，其特征在于铁含量在4.5重量%和7重量%之间，并且在水中的溶解率大约为92%以上。本发明进一步涉及一种用于制备琥珀酰酪蛋白铁(III)的方法。
文档编号C07K14/47GK103025751SQ201080067086
公开日2013年4月3日 申请日期2010年6月30日 优先权日2010年6月30日
发明者A·斯蒂夫纳奇, L·德菲拉, B·平托 申请人:意大发马克股份公司
文档序号 :
【 3505777 】
技术研发人员：A·斯蒂夫纳奇,L·德菲拉,B·平托
技术所有人：意大发马克股份公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
技术研发人员：A·斯蒂夫纳奇,L·德菲拉,B·平托
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