一种密码子偏爱优化的二羟基联苯双加氧酶基因rrbphci降解多氯联苯的的生物学方法
技术领域：
本发明属微生物基因工程领域，具体涉及一种密码子偏爱优化的二羟基联苯双加氧酶基因降解多氯联苯的生物学方法。
背景技术：
多氯联苯是一种结构稳定、毒性大和水溶性低的芳香族化合物，具有致癌、致突变和生殖发育毒性，是《斯德哥尔摩公约》中禁止使用的12种有机污染物之一。生物修复多氯联苯(Polychlorinated biphenyls, PCBs)作为一种很有潜力的修复方法优势明显。综合考虑各种因素的生物修复系统也是将来的一个研究方向。微生物降解PCBs主要分为两个方向，即好氧菌的氧化作用和厌氧菌的还原脱氯作用Furukawa，J Gen Appl Microbiol, 2000,46 :283-296。近年来，许多研究都集中在分离降解PCBs的菌株上，分析降解PCBs的机理，分离相关基因，然后进一步改造基因构建新的降解工程菌株。PCBs的降解是一系列联苯降解酶控制辅助代谢的过程Abramowicz，Cri Rev Biotech,1990，10 :241-251 ；Furukawa, Biodegradation,1994,5 :289_300。这些酶主要分为四类，包括联苯双加氧酶(BphA)，二氢二羟基脱氢酶(BphB)，2，3 二羟基双加氧酶 (BphC)和水解酶(BphD)Furukawa 和 Fuiihara，J Biosci Bioeng，2008，105 :433_449。 这一系列酶是由bph的基因簇编码的，根据基因的结构该家族可以分为四类Hong等， Int BiodeterBiodegr, 2009,63 :365-370。第一类 bph 基因簇是在 Burkholderia sp.LB400Erickson 禾口 Mondello，J Bact,1992,174:2903-2312 ；Hofer 等，Gene, 1994,144:9-16
禾口 Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707 [Furukawa 禾口 Miyazaki, Bacteriol，1986，166 :392-398]中间发现的，包含 bphRAlA2A3A4BCKHJID 基因；第二类基因簇(bphSEGFAlA2A;3BCDA4)是在 Achromobactergeorgiopolitanum strain KKS10Kimbara 等，J Bact，1989，171 :2740-2747 ；Kikuchi 等，J Bact，1994，176 :4269_4276和 Alcaligenes eutrophus ASpringael 等，J Bact,1993,175 :1674-1681 ；Mouz 等，Mol gen genet, 1999,262 :790-799中发现的；第三类由bphAlA2A3A4CBST组成的基因簇是在 Rhodococcus sp.strain RHAlMasai ·， Appl Environ Micro，1995，61 :2079_2085胃现的；最近一种新的 bph 基因簇(bphBCAlA2A3A4D)在 Rhodococcus sp. strain R0Yang 等，J Appl Micro，2007，103 :2214-2224和 Rhodococcus sp.strain K3Taguchi 等， Biosci Biotechnol Biochem, 2007, 71 :1136_1144中被发现，而且与过去报道的基因簇不同，故归类为第四种bph家族。为了提高微生物降解PCBs的能力，许多科研工作者将目光对准了基因，从基因下手，改造基因，从而改变这些基因编码酶的氨基酸序列，然后适当地筛选，从而获得降解能力更强的菌株。Erickson禾口 Mondello利用定点突变技术(site-directed mutagenesis), 将I^seudomonas sp. strain LB400的bphA基因突变，使得突变后的菌株比原先菌株拥有更广泛的底物特异性，而且提高了降解能力。也表明了联苯双加氧酶(BphA)的氨基酸亚基在底物选择性上起着有很重要的作用Erickson和Mondello，Appl Environ Microbiol, 1993,59 :3858_3862。Suenaga 等利用 DNA 改组技术(DNA shuffling)对 Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707 禾口 Burkholderia cepacia LB400 的相关基因进行了改组，获得联苯双加氧酶突变库，利用大肠杆菌表达进行突变联苯双加氧酶筛选， 获得显著对苯、甲苯和烷基苯降解能力显著提高的突变菌株Suenaga等，J Bacteriol, 2001，183 :5441-5444。同时利用引物随机重组技术(Random priming recombination)对 Pseudomonas pseudoalcaligenesKF707的相关基因进行了功能进化，获得多功能的双加氧酶，突变酶不仅仅可以降解多氯联苯，而且可以降解其它一些类似物Suenaga等，J Biol Chem, 2001, 276 :22500-22506。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种密码子偏爱优化的二羟基联苯双加氧酶基因RRBPHCI降解多氯联苯的生物学方法，根据本发明方法，可获得一种降解多氯联苯微生物基因工程菌株，并将其应用于降解多氯联苯。所述密码子偏爱优化的二羟基联苯双加氧酶基因RRBPHCI在制备降解多氯联苯工程菌株中的应用，具体包括以下步骤首先，构建二羟基联苯双加氧酶基因RRBPHCI的荧光假单胞菌表达基因载体；其次，对含有该二羟基联苯双加氧酶基因RRBPHCI的荧光假单胞菌表达载体进行遗传转化； 最后，对上述所得转化子降解二羟基联苯结果进行测定。所述二羟基联苯双加氧酶基因RRBPHCI的合成采取PTDS方法Xiong，aisheng 等，2004，Nucl Acids Res 32，e98，共设计22根引物用于基因的合成，每个引物的长度为 60bp。参见表1。引物两端分别引入BamH I和Mc I的酶切位点。引物由上海生工生物工程技术有限公司合成(http://www. sanRRon, com/)。表 权利要求
1.一种密码子偏爱优化的二羟基联苯双加氧酶基因RRBPHCI降解多氯联苯的生物学方法，其特征在于，包括以下步骤首先，构建二羟基联苯双加氧酶基因RRBPHCI荧光假单胞菌表达基因载体； 其次，对含有二羟基联苯双加氧酶基因RRBPHCI表达载体荧光假单胞菌进行遗传转化；最后，对上述所得转化子降解二羟基联苯结果进行测定。
2.权利要求1所述方法在制备降解多氯联苯微生物基因工程菌株中的应用。
3.权利要求1所述方法在降解多氯联苯中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种密码子偏爱优化的二羟基联苯双加氧酶基因RRBPHCI降解多氯联苯工程菌株的生物学方法，具体包括以下步骤首先，构建密码子偏爱优化的二羟基联苯双加氧酶基因RRBPHCI荧光假单胞菌表达载体；其次，对含有该偏爱密码子优化的二羟基联苯双加氧酶基因RRBPHCI的荧光假单胞菌表达载体进行遗传转化；最后，对上述所得转化子降解2，3-二羟基联苯结果进行测定。根据本发明方法表明构建荧光假单胞菌表达载体能够显著提高二羟基联苯的降解能力。本发明方法可用于制备降解多氯联苯微生物基因工程菌株。
文档编号C12R1/39GK102373228SQ20101025220
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月12日 优先权日2010年8月12日
发明者付晓燕, 姚泉洪, 帅建军, 彭日荷, 朱波, 熊爱生, 田永生, 许晶, 赵伟, 金晓芬, 陈晨, 韩红娟 申请人:上海市农业科学院
文档序号 :
【 430350 】
技术研发人员：熊爱生,姚泉洪,彭日荷,帅建军,田永生,赵伟,付晓燕,金晓芬,朱波,许晶,韩红娟,陈晨
技术所有人：上海市农业科学院
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
技术研发人员：熊爱生,姚泉洪,彭日荷,帅建军,田永生,赵伟,付晓燕,金晓芬,朱波,许晶,韩红娟,陈晨
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