新型超嗜热酯酶催化制备聚(ε－己内酯)的制作方法
专利名称：：新型超嗜热酯酶催化制备聚(ε－己内酯)的制作方法
技术领域：
：本发明涉及到一种利用超嗜热酯酶为催化剂合成聚(ε-己内酯)的方法，属高分子化学与生物
技术领域：
。
背景技术：
：聚(ε-己内酯)是一种具有良好生物相容性和生物降解性的合成聚酯，作为生物医用材料在药物控制释放系统、骨修复及组织工程等方面有着广泛的研究和应用。此外，聚(ε-己内酯)与大多数传统热塑性材料具有良好的相容性而且熔融状态下粘度较低，因而广泛用于塑料加工、热塑性胶粘剂、制模等。低分子量聚(ε-己内酯)被广泛用作合成聚氨酯的软段部分及药物载体。目前，聚(ε-己内酯)的合成主要是通过金属催化剂，如异辛酸亚锡、异丙醇铝等，在本体或溶液条件下催化开环聚合反应来实现。但是，苛刻的反应条件(高温、高压等)、较长的反应时间(多达几十小时)及复杂的后处理过程(耗能、费时及大量的溶剂消耗)给生产带来了困难。同时，重金属催化剂的痕量残留和潜在毒性限制了其在生物医用材料领域中的广泛应用。近年来，酶促聚合由于反应条件温和、无毒、立体选择性和区位选择性高、催化效率高的优点在聚(ε-己内酯)的合成方面发挥着重要的作用。1993年，Knani和Kobayashi最先报道了利用酶促开环聚合反应来合成聚(ε-己内酯)，产物分子量达到7700。目前，多种市售脂肪酶，如猪胰脂肪酶、南极假丝酵母脂肪酶、荧光假单孢菌脂肪酶等都被用来催化ε-己内酯的聚合反应。然而，超嗜热酯酶催化的ε-己内酯聚合反应尚未见报道。酯酶(Esterase，EC3.1.1.1)是一类广泛分布于组织和器官的丝氨酸水解酶类，能水解许多含有酯键、硫酯键、酰胺键的内源性及外源性物质。其主要功能是参与脂质代谢、信号传导及维持生物膜结构的完整性，还可以在有机相中完成转酯、酯化及酯交换等众多反应。近年来，人们从海底热流的嗜热性古菌中分离得到了超嗜热酯酶，为现代酶工程技术展现了新的应用前景。超嗜热酯酶不仅克服了化学催化剂催化效率低、专一性差的劣势，而且与中温酶相比，具有很高的稳定性。这将极大地促进生物技术产业的发展，从而带动技术水平和生活质量的提高。利用超嗜热酯酶作为生物催化剂有如下优点(1)酶制剂制备成本降低。酶的稳定性较高，可以进行室温下的分离纯化和包装运输。(2)反应速率加快。随着反应温度的提高，酶催化能力增强。(3)反应器冷却系统的要求标准降低，能耗降低。(4)产物纯度提高。在催化条件下，很少有杂菌生存，从而减少了细菌代谢物对产物的污染。由于超嗜热酯酶的高温反应活性，以及对有机溶剂、去污剂和变性剂的较强抗性，它在食品、医药、制革、功能材料、石油开采及废物处理等方面都有广泛的应用潜力。
发明内容超嗜热古菌Archaeoglobusfulgidus是生长于火山口、油田沉积物及热泉中的一类嗜热微生物，最适生长温度为83℃。该菌是一种已知菌种，保存于德国微生物菌种保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenZellkulturen，DSMZ，www.dsmz.de)，保存编号为DSM4304。1997年，Klenk报道了该超嗜热古菌的基因组序列(Thecompletegenomesequenceofthehyperthermophilic，sulphate-reducingarchaeonArchaeoglobusfulgidus.Nature1997；390364-370)。文献(Stress-inducedproductionofbiofilminthehyperthermophileArchaeoglobusfulgidus.AppliedandEnvironmentalMicrobiology1997；633158-3163)详细描述了该菌生长状况等特性。本领域的任何研究人员都可以通过文献充分了解Archaeoglobusfulgidus菌种，因为该菌种已经是一种公认产品，且任何人都可以以商品的形式从德国微生物菌种保藏中心购得。2000年，Manco利用聚合酶链式反应(Polymerizationchainreaction，PCR)技术从Archaeoglobusfulgidus基因组中钓取了超嗜热酯酶AFEST的基因AF1716，利用pT7-SCII为表达载体，将重组质粒克隆到大肠杆菌BL21中，得到一株工程菌(Cloning，overexpression，andpropertiesofanewthermophilicandthermostableesterasewithsequencesimilaritytohormone-sensitivelipasesubfamilyfromthearchaeonArchaeoglobusfulgidus.ArchivesofBiochemistryandBiophysics2000；373182-192)。该工程菌不仅培养条件简单，而且能够快速繁殖并高效表达超嗜热酯酶AFEST。该文献详细地介绍了超嗜热酯酶AFEST基因的钓取、所用的载体及工程菌构建的方法。本领域的任何人员都可以通过该文献充分了解该工程菌的构建与特性，并利用相同或相应的技术从Archaeoglobusfulgidus基因组中钓取超嗜酯酶AFEST的基因并进行工程菌的构建。本发明的目的在于利用超嗜热酯酶工程菌发酵、纯化制备的酶制剂为催化剂，在非水介质中催化聚合ε-己内酯，建立一种不用金属催化剂、条件温和的聚(ε-己内酯)的合成及后处理工艺。本发明的主要内容包括超嗜热酯酶制剂的制备及聚(ε-己内酯)的合成与后处理。新型超嗜热酯酶催化制备聚(ε-己内酯)，其是在常压条件下，将单体ε-己内酯与有机溶剂混合，加入酶制剂催化反应，反应物经分离纯化可得到产物聚(ε-己内酯)。所选用的酶制剂为来源于超嗜热古菌Archaeoglobusfulgidus的超嗜热酯酶AFEST。超嗜热酯酶AFEST由超嗜热酯酶工程菌经发酵、纯化制备，超嗜热酯酶工程菌的培养基为1～2％酵母粉，1.5～2.0％蛋白胨，0.5～1.0％氯化钠，pH为7.0～7.5，115～121℃下灭菌15～20min；种子液逐级放大，接种量为1～2％，37℃培养至培养物的生长浊度在OD600达到1.5～2.0；然后，加入异丙基-β-D-硫代吡喃葡糖苷诱导，终浓度为1mM，37℃下继续培养3～4h；将发酵液5000～8000r/min离心20～30min收集菌体；菌体于零下20℃～零下40℃与室温下反复冻融2～3次，按照1∶6～8(w/v)加入50mmol/L磷酸缓冲液，pH值8.0，混合均匀后超声破碎20～30min；细胞破碎液于80～90℃中保温20～30min，以变性沉淀大肠杆菌杂蛋白；冷却后，7000～8000r/min离心15～20min后收集上清，得到粗酶液；粗酶液经过20kD膜包进行超滤，超滤后液体进行冻干，得到超嗜热酯酶AFEST制剂。有机溶剂为甲苯、正己烷或环己烷。有机溶剂与ε-己内酯的体积比为2.0～5.0∶1。超嗜热酯酶制剂AFEST与ε-己内酯的质量比为1∶4～20。催化反应是在封闭反应体系内，在60～100℃温度下反应24～120h。分离纯化是在反应体系中加入二氯甲烷，过滤除去酶，将滤液进行真空浓缩去除有机溶剂，残余物中加入冰冷甲醇，低温下进行沉淀，离心收集沉淀，沉淀经真空干燥得聚合产物。二氯甲烷与ε-己内酯的体积比为25～50∶1。低温沉淀温度为零下20℃～零下40℃，真空干燥时间为16～24h。经核磁共振(1HNMR)表征，产物具有聚(ε-己内酯)的结构(附图1)。产物经凝胶渗透色谱(GPC)分析，数均分子量为1200～2300g/mol，多分散性1.1～1.5，可被广泛用作聚氨酯的软段部分及药物载体。本发明具有以下优点1.本发明使用超嗜热酯酶作为催化剂，由于建立了比较成熟的工程菌发酵和酶制剂的制备工艺，因而较大幅度地降低了生产成本；2.本发明采用具有高度热稳定性的超嗜热酯酶为催化剂，在高温条件进行聚合反应，极大地提高了反应速率，缩短了生产周期，在降低成本的同时为生产规模的扩大提供了有利条件；3.本发明采用的产物提取及后处理工艺，操作简单，同时使用的有机溶剂容易回收和重复利用，在降低生产成本的同时，不会对环境造成污染，符合现在绿色化工的要求。图1通过实施例2方法合成产物的1HNMR图谱；如图1所示，图中，0ppm为内标物四甲基硅烷(TMS)甲基氢的分裂；7.28ppm为溶剂氘代氯仿(CDCl3)中残留的氯仿(CHCl3)中氢的分裂峰。1.38ppm处的三重峰为c处两个氢分裂产生的，1.65ppm处的多重峰是b和d处氢原子分裂的结果，2.31ppm处的三重峰为a处两个氢分裂产生的，4.06ppm则是e处氢原子分裂的结果。此外，3.65处的一个小的三重峰为端基f上两个氢原子的特征分裂峰。具体实施例方式下面给出的实施例子是对本发明作进一步说明，以便于本专业技术人员更全面地理解本发明。但所给出的实施例不能理解为对本发明保护范围的限制，因而该专业的技术人员根据上述
发明内容所做出的非本质的改进和调整也应属于本发明保护范围。实施例1超嗜热酯酶制剂AFEST的制备超嗜热酯酶工程菌的培养基如下1％酵母粉，1.6％蛋白胨，0.5％氯化钠，pH为7.0，115℃下灭菌20min。种子液逐级放大，接种量为1％，培养体积为10升。37℃培养至培养物的生长浊度在OD600达到1.8。然后，加入IPTG诱导(终浓度为1mM)，37℃下继续培养3h。将发酵液5000r/min离心20min收集菌体。菌体于-20℃与室温下反复冻融2次，按照1∶6(w/v)加入50mmol/L磷酸缓冲液(pH8.0)，混合均匀后超声破碎20min。细胞破碎液于80℃中保温30min，以变性沉淀大肠杆菌杂蛋白。冷却后，8000r/min离心15min后收集上清，得到粗酶液。粗酶液经过20kD膜包进行超滤，超滤后液体进行冻干，得到酶制剂AFEST。实施例2将200μL(215mg)ε-己内酯(纯度≥99％)与600μL甲苯混合，加入20mg超嗜热酯酶AFEST作催化剂，在80℃下振荡反应72h后，用10mL二氯甲烷溶解产物，过滤除去酶，滤液经气相色谱(GC)测定单体转化率为99.97％。滤液进行真空浓缩，残余物中加入冰冷甲醇于零下20℃下沉淀，8000r/min离心15min收集沉淀，减压干燥16h得聚合产物。产物经凝胶渗透色谱(GPC)测定，数均分子量为1768g/mol，多分散性为1.21。实施例3将200μL(215mg)ε-己内酯(纯度≥99％)与600μL环己烷混合，加入20mg超嗜热酯酶AFEST作催化剂，在80℃下振荡反应72h后，用10mL二氯甲烷溶解产物，过滤除去酶，滤液经气相色谱(GC)测定单体转化率为95.29％。滤液进行真空浓缩，残余物中加入冰冷甲醇于零下20℃沉淀，8000r/min离心15min收集沉淀，减压干燥16h得聚合产物。产物经凝胶渗透色谱(GPC)测定，数均分子量为2238g/mol，多分散性为1.46。实施例4将200μL(215mg)ε-己内酯(纯度≥99％)与600μL正己烷混合，加入20mg超嗜热酯酶AFEST作催化剂，在80℃下振荡反应72h后，用10mL二氯甲烷溶解产物，过滤除去酶，滤液经气相色谱(GC)测定单体转化率为100％。滤液进行真空浓缩，残余物中加入冰冷甲醇于零下20℃沉淀，8000r/min离心15min收集沉淀，减压干燥16h得聚合产物。产物经凝胶渗透色谱(GPC)测定，数均分子量为2073g/mol，多分散性为1.31。实施例5将200μL(215mg)ε-己内酯(纯度≥99％)与600μL甲苯混合，加入20mg超嗜热酯酶AFEST作催化剂，在80℃下振荡反应60h后，用10mL二氯甲烷溶解产物，过滤除去酶，滤液经气相色谱(GC)测定单体转化率为99.38％。滤液进行真空浓缩，残余物中加入冰冷甲醇于零下20℃沉淀，8000r/min离心15min收集沉淀，减压干燥16h得聚合产物。产物经凝胶渗透色谱(GPC)测定，数均分子量为1268g/mol，多分散性为1.26。实施例6将200μL(215mg)ε-己内酯(纯度≥99％)与600μL甲苯混合，加入30mg超嗜热酯酶AFEST作催化剂，在80℃下振荡反应72h后，用10mL二氯甲烷溶解产物，过滤除去酶，滤液经气相色谱(GC)测定单体转化率为99.65％。滤液进行真空浓缩，残余物中加入冰冷甲醇于零下20℃沉淀，8000r/min离心15min收集沉淀，减压干燥16h得聚合产物。产物经凝胶渗透色谱(GPC)测定，数均分子量为1262g/mol，多分散性为1.29。实施例7将5mL(5.38g)ε-己内酯(纯度≥99％)与15mL甲苯混合，加入500mg超嗜热酯酶AFEST作催化剂，在80℃下振荡反应72h后，用250mL二氯甲烷溶解产物，过滤除去酶，滤液经气相色谱(GC)测定单体转化率为100％。滤液进行真空浓缩，残余物中加入冰冷甲醇于零下20℃沉淀，8000r/min离心15min收集沉淀，减压干燥16h得聚合产物。产物经凝胶渗透色谱(GPC)测定，数均分子量为1215g/mol，多分散性为1.19。实施例8将50mL(53.8g)ε-己内酯(纯度≥99％)与150mL甲苯混合，加入5g超嗜热酯酶AFEST作催化剂，在80℃下振荡反应72h后，用2L二氯甲烷溶解产物，过滤除去酶，滤液经气相色谱(GC)测定单体转化率为100％。滤液经真空浓缩，残余物中加入冰冷甲醇于零下20℃沉淀，8000r/min离心15min收集沉淀，减压干燥16h得聚合产物。产物经凝胶渗透色谱(GPC)测定，数均分子量为1355g/mol，多分散性为1.24。权利要求1.新型超嗜热酯酶催化制备聚(ε-己内酯)，其特征在于在常压条件下，将单体ε-己内酯与有机溶剂混合，加入酶制剂催化反应，反应物经分离纯化可得到产物聚(ε-己内酯)。2.如权利要求1所述的新型超嗜热酯酶催化制备聚(ε-己内酯)，其特征在于所选用的酶制剂为来源于超嗜热古菌Archaeoglobusfulgidus的超嗜热酯酶AFEST。3.如权利要求2所述的新型超嗜热酯酶催化制备聚(ε-己内酯)，其特征在于超嗜热酯酶AFEST由超嗜热酯酶工程菌经发酵、纯化制备，超嗜热酯酶工程菌的培养基为1～2％酵母粉，1.5～2.0％蛋白胨，0.5～1.0％氯化钠，pH为7.0～7.5，115～121℃下灭菌15～20min；种子液逐级放大，接种量为1～2％，37℃培养至培养物的生长浊度在OD600达到1.5～2.0；然后，加入异丙基-β-D-硫代吡喃葡糖苷诱导，终浓度为1mM，37℃下继续培养3～4h；将发酵液5000～8000r/min离心20～30min收集菌体；菌体于零下20℃～零下40℃与室温下反复冻融2～3次，按照1∶6～8(w/v)加入50mmol/L磷酸缓冲液，pH值8.0，混合均匀后超声破碎20～30min；细胞破碎液于80～90℃中保温20～30min，以变性沉淀大肠杆菌杂蛋白；冷却后，7000～8000r/min离心15～20min后收集上清，得到粗酶液；粗酶液经过20kD膜包进行超滤，超滤后液体进行冻干，得到超嗜热酯酶AFEST制剂。4.如权利要求1所述的新型超嗜热酯酶催化制备聚(ε-己内酯)，其特征在于有机溶剂为甲苯、正己烷或环己烷。5.如权利要求4所述的新型超嗜热酯酶催化制备聚(ε-己内酯)，其特征在于有机溶剂与ε-己内酯的体积比为2.0～5.0∶1。6.如权利要求1所述的新型超嗜热酯酶催化制备聚(ε-己内酯)，其特征在于超嗜热酯酶制剂AFEST与ε-己内酯的质量比为1∶4～20。7.如权利要求1所述的新型超嗜热酯酶催化制备聚(ε-己内酯)，其特征在于催化反应是在封闭反应体系内，在60～100℃温度下反应24～120h。8.如权利要求1所述的新型超嗜热酯酶催化制备聚(ε-己内酯)，其特征在于分离纯化是在反应体系中加入二氯甲烷，过滤除去酶，将滤液进行真空浓缩去除有机溶剂，残余物中加入冰冷甲醇，低温下进行沉淀，离心收集沉淀，沉淀经真空干燥得聚合产物。9.如权利要求8所述的新型超嗜热酯酶催化制备聚(ε-己内酯)，其特征在于二氯甲烷与ε-己内酯的体积比为25～50∶1。10.如权利要求8所述的新型超嗜热酯酶催化制备聚(ε-己内酯)，其特征在于低温沉淀温度为零下20℃～零下40℃，真空干燥时间为16～24h。全文摘要本发明涉及到一种利用超嗜热酯酶为催化剂合成聚(ε－己内酯)的方法，属高分子化学与生物
技术领域：
。是在常压条件下，将单体ε－己内酯与有机溶剂混合，加入酶制剂催化反应，在60～100℃温度下反应24～120h，反应结束后，在反应体系中加入二氯甲烷，过滤除去酶，将滤液进行真空浓缩去除有机溶剂，残余物中加入冰冷甲醇，低温下进行沉淀，离心收集沉淀，沉淀经真空干燥得聚合产物。所选用的酶制剂为来源于超嗜热古菌Archaeoglobusfulgidus的超嗜热酯酶AFEST。本发明克服了减压、惰性气体保护等苛刻的反应条件，并以成熟的合成与后处理工艺实施，因而具有生产工艺简单、安全、能耗低、产量高的特点。文档编号C12N9/18GK101020740SQ20071005545公开日2007年8月22日申请日期2007年3月27日优先权日2007年3月27日发明者冯雁,马玖彤,李全顺,宋搏申请人:吉林大学
文档序号 :
【 434392 】
技术研发人员：冯雁,马玖彤,李全顺,宋搏
技术所有人：吉林大学
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
技术研发人员：冯雁,马玖彤,李全顺,宋搏
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