二乙基对硝基苯磷酸酯酶活性浓度的测定方法及诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药、食品、环境等领域内对二乙基对硝基苯磷酸酯酶活性浓度的检测，尤其涉及利用酶比色法及酶(偶)联法测定二乙基对硝基苯磷酸酯酶活性浓度的方法，以及由此制得的二乙基对硝基苯磷酸酯酶诊断试剂盒，属于二乙基对硝基苯磷酸酯酶活性浓度分析检测技术领域。
背景技术：
血清中的二乙基对硝基苯磷酸酯酶，主要在肝脏表达，其作用是水解组织中磷酸酯。血清中的二乙基对硝基苯磷酸酯酶与人体中的高、低密度脂蛋白代谢有关。二乙基对硝基苯磷酸酯酶可以保护低密度脂蛋白，避免氧化修饰，所以，可以认为，二乙基对硝基苯磷酸酯酶是一种具有抗动脉粥样硬化以及抗炎作用的酶。血浆二乙基对硝基苯磷酸酯酶活性的增加，使血浆中抗氧化修饰型低密度脂蛋白的自身抗体水平降低18.8％，而高密度脂蛋白上二乙基对硝基苯磷酸酯酶活性的增加，使高密度脂蛋白水平升高9.1％。
吸烟者体内的二乙基对硝基苯磷酸酯酶的活性浓度较之非吸烟者或戒烟者的活性浓度低，因而抗氧化作用也随之降低，导致血管中产生较多胆固醇沉积，而多余的胆固醇可以导致血管堵塞，最终导致心脏病或中风发生。除吸烟之外，糖尿病和衰老也与二乙基对硝基苯磷酸酯酶水平降低有关。
发明内容
本发明的目的是提供一种测定二乙基对硝基苯磷酸酯酶活性浓度的方法，以及应用该方法配制而成的二乙基对硝基苯磷酸酯酶诊断试剂盒。
为实现本发明的目的，一种利用酶比色法(Enzymatic ColorimetricMethod)及酶(偶)联法(Couple Reaction)测定二乙基对硝基苯磷酸酯酶活性浓度的方法，采用以下步骤进行首先，将测定的样品与含有苯乙酸酯、醛脱氢酶和还原型辅酶的试剂混匀，使之发生以下反应，
然后，将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出二乙基对硝基苯磷酸酯酶的活性浓度大小。
上述利用利用酶比色法及酶(偶)联法测定二乙基对硝基苯磷酸酯酶活性浓度的方法中，所述还原型辅酶是NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH中的一种。
实现本发明二乙基对硝基苯磷酸酯酶诊断试剂盒可以是单剂，由以下成分组成缓冲液20～500mmol/L，稳定剂5～100g/ml，还原型辅酶0.1～0.35mmol/L，醛脱氢酶 1000～80000U/L，苯乙酸酯 1～50mmol/L。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将以上单剂中的各种成分进行组合配制成双剂，比如
双剂的配方不仅仅限于上述表中所列，其中试剂I的成分还原型辅酶、苯乙酸酯，可以放在试剂II；试剂II中的醛脱氢酶也可以放到试剂I，如此可以形成多种配方，不再一一列举。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将试剂配成如下三试剂
与双剂类似，三剂的配方也不仅仅限于上述配方，其中试剂I中的还原型辅酶可以放在试剂II或试剂III中，试剂II中的苯乙酸酯可以放在试剂I或试剂III中，试剂III中的醛脱氢酶也可以放到试剂I或者试剂II中，如此可以形成多种配方，不再一一列举。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
此外，为减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I/试剂II、三剂的试剂I/试剂II/试剂III当中通常加入稳定剂，活性浓度在0.1～3mol/L，或5～100g/ml，或5～50％v/v范围之内。
用作稳定剂的物质可以是硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)中的至少一种。
研究表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下配方成分关系的诊断/检测试剂盒较为理想，也是本发明的优选方案缓冲液100mmol/L，稳定剂2mol/L，还原型辅酶0.25mmol/L，醛脱氢酶 8000U/L，苯乙酸酯 16mmol/L。
本发明利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定二乙基对硝基苯磷酸酯酶活性浓度的方法，同时，本发明还给出用以实现该方法的二乙基对硝基苯磷酸酯酶诊断试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行二乙基对硝基苯磷酸酯酶活性浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明技术方案的突出的实质性特点和显著的进步主要表现在(1)本发明完全利用酶比色法及酶(偶)联法测定二乙基对硝基苯磷酸酯酶活性浓度，测试结果准确；(2)参与反应的成分都是外加的，不受内、外源物质的污染，测试过程精确度高；(3)该方法简便、易操作，可快速得到检测结果，而且反应是在缓冲液条件下进行，不会污染环境；(4)该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于行业内推广应用；(5)应用本发明提供的测定方法可以制成液态试剂、干粉试剂等多种形式的试剂，用于测定各种样品中二乙基对硝基苯磷酸酯酶活性浓度的大小；(6)本发明提供的液态二乙基对硝基苯磷酸酯酶诊断/检测试剂盒，稳定性好，很好地保证了应用测试效果。配成双剂或者三剂以后，能够进一步降低各种成分之间的交叉影响，检测结果更加可信，试剂更为稳定，可以长时间储存。
具体实施例方式
本发明一种二乙基对硝基苯磷酸酯酶活性浓度的测定方法及二乙基对硝基苯磷酸酯酶诊断试剂盒，利用二乙基对硝基苯磷酸酯酶(Paraoxonase；EC 3.1.1.2)酶(偶)联醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase；EC 1.2.1.3；EC 1.2.1.4；EC 1.2.1.5)酶促反应连续监测法。二乙基对硝基苯磷酸酯酶酶解苯乙酸酯反应产生乙酸，再通过(偶)联合醛脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算二乙基对硝基苯磷酸酯酶的活性浓度大小。
下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步说明。这些例子仅是一些应用范例，不能理解为对本发明权利要求保护范围的一种限制。
实施例一(单剂)按以下成分和用量配制二乙基对硝基苯磷酸酯酶诊断试剂盒三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L，硫酸铵 80g/ml，NADH 0.25mmol/L，醛脱氢酶 8000U/L，苯乙酸酯 16mmol/L。
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测二乙基对硝基苯磷酸酯酶样品与试剂的体积比为1∶25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值-4180。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出二乙基对硝基苯磷酸酯酶的活性浓度大小。
实施例二(双剂)按以下成分和用量配制二乙基对硝基苯磷酸酯酶诊断试剂盒试剂I——三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L，甘油 2mol/L，thio-NADH0.25mmol/L，
苯乙酸酯 12mmol/L；试剂II——三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L，丙二醇 50％v/v，醛脱氢酶 12000U/L。
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测二乙基对硝基苯磷酸酯酶样品与试剂I、试剂II的体积比为2∶20∶5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值-2170。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出二乙基对硝基苯磷酸酯酶的活性浓度大小。
实施例三(三剂)按以下成分和用量配制二乙基对硝基苯磷酸酯酶诊断试剂盒试剂I——三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L，硫酸铵 80g/ml，NADPH0.25mmol/L；试剂II——三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L，乙二醇 2mol/L，
苯乙酸酯 20mmol/L；试剂III——三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L，甘油 50％v/v，醛脱氢酶 6000U/L。
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
测定二乙基对硝基苯磷酸酯酶活性浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测二乙基对硝基苯磷酸酯酶样品与试剂I、试剂II、试剂III的体积比例为4∶40∶5∶5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值-2170。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出二乙基对硝基苯磷酸酯酶的活性浓度大小。
经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。
权利要求
1.二乙基对硝基苯磷酸酯酶活性浓度的测定方法，包括以下步骤①将测定的样品与含有苯乙酸酯、醛脱氢酶和还原型辅酶的试剂混匀，使之发生以下反应，②将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出二乙基对硝基苯磷酸酯酶的活性浓度大小。
2.二乙基对硝基苯磷酸酯酶诊断试剂盒，盒中试剂由以下成分组成缓冲液 20～500mmol/L，稳定剂 0.1～3mol/L，或5～100g/ml，或5～50％v/v，还原型辅酶 0.1～0.35mmol/L，醛脱氢酶1000～80000U/L，苯乙酸酯1～50mmol/L。
3.根据权利要求2所述的二乙基对硝基苯磷酸酯酶诊断试剂盒，其特征在于所述还原型辅酶是NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH中的一种。
4.根据权利要求2所述的二乙基对硝基苯磷酸酯酶诊断试剂盒，其特征在于所述稳定剂为硫酸铵、甘油、丙二醇、乙二醇中的至少一种。
5.权利要求2～4中任意一种二乙基对硝基苯磷酸酯酶诊断试剂盒，其特征在于所述试剂配成单剂、双剂或者三剂。
6.权利要求2～4中任意一种二乙基对硝基苯磷酸酯酶诊断试剂盒，其特征在于所述试剂盒为干粉试剂盒或液体试剂盒。
全文摘要
本发明涉及二乙基对硝基苯磷酸酯酶活性浓度的测定方法及二乙基对硝基苯磷酸酯酶诊断试剂盒，利用二乙基对硝基苯磷酸酯酶酶(偶)联醛脱氢酶酶促反应连续监测法，二乙基对硝基苯磷酸酯酶酶解苯乙酸酯反应产生乙酸，再通过(偶)联合醛脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶氧化成为辅酶，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，测算二乙基对硝基苯磷酸酯酶的活性浓度大小。该方法测试结果精确、准确性好。试剂盒成分包括缓冲液、还原型辅酶、苯乙酸酯、醛脱氢酶及稳定剂；将诊断试剂盒制成双剂或三剂可减少各成分的交叉影响，本发明完全可以通过紫外/可见光分析仪器得出所需的测定结果。
文档编号C12Q1/00GK1975383SQ20061016122
公开日2007年6月6日 申请日期2006年12月15日 优先权日2006年12月15日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司
文档序号 :
【 557354 】
技术研发人员：王尔中
技术所有人：苏州艾杰生物科技有限公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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