利用化学反应性非天然氨基酸产生载体-肽偶联物的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质化学领域。本文描述了产生载体多肽-靶多肽偶联物的方法， 其中掺入所述载体多肽变体的第一非天然氨基酸与掺入所述靶多肽变体的第二非天然氨基酸反应。还描述了这些方法产生的组合物。
背景技术：
各种限制条件妨碍肽的开发以供治疗应用。例如，治疗性肽通常显示体内稳定性低，常在给予对象后通过化学或酶促降解而快速清除，例如在数分钟到数小时内，即，在达到任何疗效之前。因此，生物利用度低要求频繁给予肽，常通过相当高剂量的注射以维持活性。此类高剂量可导致不良副作用。此外，膜屏障(例如，肠和血脑屏障)的选择性透过限制了治疗性肽的递送。为促进递送入细胞、延长它们的半衰期和/或维持它们的活性，可将感兴趣的多肽，例如小的治疗性多肽共价偶联于载体多肽，例如对特定配体或配体的基团， 如糖、核苷、盐、氨基酸、脂肪酸或其它分子具有高亲和力的各种多肽。载体多肽通常有助于此类配体的转运，例如转运入亚细胞隔室，胞外液体(例如，血液)或穿过细胞膜。因此，载体-靶多肽偶联物给予对象后，载体蛋白有利地促进将共价连接的靶多肽递送入细胞，降低它们的毒性和/或延长它们的稳定性和/或活性。将小肽化学偶联于载体多肽的现有方法包括利用非特异性试剂，例如戊二醛或碳二亚胺活化的N-羟基琥珀酰亚胺酯和防止载体多肽_载体多肽或靶多肽_靶多肽偶联物形成的高特异性异双功能交联剂。然而，此类试剂仅可用于修饰有限数量的氨基酸残基 (例如，包含胺、酮、硫醇、巯基或羧基的氨基酸)。利用此类交联剂将载体多肽偶联于靶多肽可扰乱载体多肽、靶多肽或得到的载体-靶多肽偶联物的构象，因而降低偶联物的稳定性、生物学活性、药代动力学活性等。利用这些交联剂的偶联反应可产生载体多肽-靶多肽偶联物的异质群体，从而降低生产效率并使质量控制复杂。本领域需要 能有效、成本节约地大规模产生载体多肽_靶多肽偶联物的均质群体的方法和组合物。纵览以下内容后会明白本发明提供了这些和其它需求。发明概述本发明提供制备载体多肽-靶多肽偶联物的方法和组合物，所述偶联物显示生物利用度提高、药理学活性增强、生物学活性升高、半衰期延长和/或免疫原性增加。本发明采用将第一和第二非天然氨基酸分别直接掺入载体多肽和靶多肽。然后存在于载体和靶多肽变体中的所述第一和第二非天然氨基酸反应以产生本发明的偶联物。此类偶联物可治疗性应用或药学应用，它们可有利地在低成本表达系统中产生，所述系统能产生包含复杂翻译后修饰的生物学活性异源蛋白质。本发明一方面提供制备载体多肽-靶多肽偶联物的方法。该方法包括在载体多肽的合成或翻译期间将第一非天然氨基酸残基掺入载体多肽，在靶多肽的合成或翻译期间将第二非天然氨基酸残基掺入靶多肽，以及所述第一和第二残基反应以产生载体多肽-靶多肽偶联物。所述第一和第二非天然氨基酸可任选通过一种或多种以下机制反应 亲电-亲核反应、酮与亲核试剂反应、肟连接、醛与亲核试剂反应、羰基和亲核试剂之间的反应、磺酰基和亲核试剂之间的反应、酯化反应、位阻酯基和亲核试剂之间的反应、硫酯基团和亲核试剂之间的反应、稳定的亚胺基和亲核试剂之间的反应、环氧基团和亲核试剂之间的反应、氮丙啶基团和亲核试剂之间的反应、亲电试剂和脂族胺或芳族胺之间的反应、亲电试剂和酰胼之间的反应、亲电试剂和碳酰胼之间的反应、亲电试剂和氨基脲之间的反应、 亲电试剂和氨基硫脲之间的反应、亲电试剂和羰基酰胼之间的反应、亲电试剂和硫代羰基酰胼之间的反应、亲电试剂和磺酰基酰胼之间的反应、亲电试剂和卡巴胼之间的反应、亲电试剂和硫卡巴胼之间的反应、亲电试剂和羟胺之间的反应、亲核试剂或亲核试剂，例如羟基或二醇和硼酸或酯之间的反应、过渡金属催化的反应、钯催化的反应、铜催化的杂原子烷化反应、环加成反应、1，3环加成反应、2，3环加成反应、炔-叠氮化物反应、狄尔斯-阿德尔 (Diels-Alder)反应或铃木偶联反应。在优选的实施方式中，产生偶联物的反应的效率任选大于50%、大于70%或大于90%。翻译期间将第一非天然氨基酸掺入载体多肽可任选包括提供翻译系统，该系统包含所述第一非天然氨基酸、正交tRNA-合成酶(O-RS)、被所述O-RS用所述第一非天然氨基酸特异性氨酰化的正交tRNA(Ο-tRNA)，和编码载体肽的核酸，其中所述核酸包含所述 Ο-tRNA识别的选择者密码子；和翻译所述核酸，藉此在翻译期间将所述第一非天然氨基酸掺入所述载体多肽。任选可在甲基营养酵母细胞，例如假丝酵母(Candida)细胞、汉逊酵母 (Hansenula)细胞、毕赤酵母(Pichia)细胞或球拟酵母菌(Torulopsis)细胞中，在翻译期间产生所述载体多肽(或靶多肽)。在所述方法的具体实施方式
中，将第一非天然氨基酸掺入载体多肽产生包含该第一非天然氨基酸的HSA变体，例如包含对乙酰基苯丙氨酸的HSA变体。可任选在翻译期间将第一非天然氨基酸掺入HSA变体。例如，可任选将第一非天然氨基酸掺入HSA变体的氨基酸37位，其中氨基酸位置的编号是依照SEQ ID N0:1的。然而，第一非天然氨基酸所掺入的载体多肽可任选对于各种多肽是同源的，所述多肽包括但不限于，例如抗体(例如，0KT3 抗体、HER2抗体等)、抗体片段(例如，Fc、Fab、scFv等)、白蛋白、血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、C-反应性 蛋白、伴白蛋白、乳清蛋白、匙孔贼血蓝蛋白(KLH)、离子载体蛋白、 酰基载体蛋白、信号转导衔接蛋白、雄激素结合蛋白、钙结合蛋白、钙调蛋白结合蛋白、血浆铜蓝蛋白、胆固醇酯转移蛋白、f_盒蛋白、脂肪酸-结合蛋白、卵泡抑素、卵泡抑素-相关蛋白、GTP-结合蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白、铁-结合蛋白、潜在TGF-β结合蛋白、 光-收集蛋白复合物、淋巴细胞抗原、膜转运蛋白、神经垂体素运载蛋白、周质结合蛋白、磷酸-结合蛋白、磷脂酰乙醇胺结合蛋白、磷脂转移蛋白、视黄醇-结合蛋白、RNA-结合蛋白、 S-期激酶-相关蛋白、性激素_结合球蛋白、甲状腺素-结合蛋白、钴胺素传递蛋白、皮质激素传递蛋白、运铁蛋白_结合蛋白、和/或维生素D-结合蛋白。在所述方法的某些实施方式中，将第二非天然氨基酸掺入靶多肽产生包含该第二非天然氨基酸的TSP-I变体，例如包含ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸的TSP-I变体。可任选将ε-(2_(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸掺入TSP-I变体的氨基酸6位或氨基酸1位，其中氨基酸位置的编号是依照SEQ ID Ν0:2的。在所述方法的其它实施方式中， 将第二非天然氨基酸掺入靶多肽产生包含该第二非天然氨基酸的ΑΒΤ-510变体，例如包含 ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L_赖氨酸的ΑΒΤ-510变体。可任选将ε_(2_(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸掺入ΑΒΤ-510变体的氨基酸6位或氨基酸1位，其中氨基酸位置的编号是依照SEQ ID Ν0:3的。ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸任选在合成期间掺入TSP-I 变体或ΑΒΤ-510变体。然而，掺入第二非天然氨基酸的靶多肽可任选对于以下是同源的，例如，TSP-1、ABT-510、胰高血糖素(glugacon)-样肽-1 (GLP-I)、甲状旁腺激素(PTH)、核糖体灭活蛋白(RIP)、血管抑素、艾赛那肽(EXedin)-4、脱辅基蛋白、心房钠尿因子、心房利钠多肽、心房肽、C-X-C 趋化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro_a、gro_b、gro_c、IP-10、GCP-2、 NAP-4、PF4、MIG、降钙素、c-kit配体、细胞因子、CC趋化因子、单核细胞趋化蛋白_1、单核细胞趋化蛋白_2、单核细胞趋化蛋白_3、单核细胞炎性蛋白-1 α、单核细胞炎性蛋白-1 β、 RANTES, 1309、R83915、R91733、Τ58847、D31065、Τ64262、CD40 配体、补体抑制剂、细胞因子、上皮嗜中性粒细胞活化肽-78、GRO α、MGSA、GR0 3、GRO Y、MIPl-α、MIPl-β、MCP_1、 上皮嗜中性粒细胞活化肽、促红细胞生成素(EPO)、剥落毒素(exfoliating toxin)、成纤维细胞生长因子(FGF)、FGF21、G-CSF、促性腺激素、生长因子、水蛭素、LFA-1、人胰岛素、 人胰岛素样生长因子(hIGF)、hIGF-I、hIGF-II、人干扰素、IFN-α、IFN-, IFN-Y、白介素、 IL-U IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12、角质形成细胞生长因子(KGF)、白血病抑制因子、神经生长因子(neurturinhPDGF、肽激素、多效生长因子(pleiotropin)、热原性外毒素A、热原性外毒素B、热原性外毒素C、松弛素、促生长素抑制素、超氧化物歧化酶、胸腺素α 1、人肿瘤坏死因子(hTNF)、人肿瘤坏死因子α、人肿瘤坏死因子β、Ras, Tat、炎性分子、信号转导分子、牛胰蛋白酶抑制剂(BPTI)和/或BP320抗原，其中所述靶多肽包含第二非天然氨基酸。应该知道以上清单不打算限制本文的实施方式。例如，采用上述方法可在翻译期间将对-乙酰基苯丙氨酸掺入HSA变体的氨基酸 37位，其中HSA中氨基酸位置的编号依照SEQ ID N0:1，可在合成期间将ε-(2_(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸掺入TSP-I变体的氨基酸6位，其中TSP-I中氨基酸位置的编号依照SEQ ID NO :2，对-乙酰基苯丙氨酸与ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸通过肟连接反应以产生HSA-TSP-I偶联物。任选采用上述方法可在翻译期间将对-乙酰基苯丙氨酸掺入HSA变体的氨基酸37位，其中HSA中氨基酸位置的编号依照SEQ ID NO :1，可在合成期间将ε_(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸掺入ΑΒΤ-510变体的氨基酸6位，其中ΑΒΤ-510 中氨基酸位置的编号依照SEQ ID NO :3，对-乙酰基苯丙氨酸与ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸通过肟连接反应以产生HSA-ABT-510偶联物。 在相关方面，本发明提供上述方法产生的载体多肽-靶多肽偶联物。本发明的载体多肽-靶多肽偶联物任选显示长于靶多肽的血清半衰期。本发明的偶联物可任选包含任何一个或多个上述载体多肽和任何一个或多个上述靶多肽。然而，应该知道本发明偶联物不限于包含所述载体和靶多肽的那些。偶联物可任选包含载体多肽和靶多肽，所述载体多肽其是包含至少一个第一非天然氨基酸的HSA变体，所述靶多肽是包含第二非天然氨基酸的TSP-I变体或ΑΒΤ-510变体。所述第一非天然氨基酸可任选是，例如在翻译期间掺入，例如HSA变体的氨基酸37位的对-乙酰基苯丙氨酸，其中氨基酸位置的编号依照SEQ ID Ν0:1的。所述第二非天然氨基酸可任选是，例如在合成期间掺入，例如TSP-I变体的氨基酸6位的ε -(2-(氨基氧基) 乙酰基)-L-赖氨酸，其中氨基酸位置的编号依照SEQ ID Ν0:2的。所述第二非天然氨基酸可任选是，例如在合成期间掺入，例如ΑΒΤ-510变体的氨基酸6位的ε-(2_(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸，其中氨基酸位置的编号依照SEQ ID Ν0:3的。例如，本发明的偶联物可包含载体多肽和靶多肽，所述载体多肽是在氨基酸37位包含对-乙酰基苯丙氨酸的HSA变体，其中氨基酸位置的编号依照SEQ ID NO :1的，所述靶多肽是在氨基酸6位包含ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸的TSP-I变体，其中氨基酸位置的编号依照SEQ ID NO :2的。或者，本发明的偶联物可包含载体多肽和靶多肽，所述载体多肽是在氨基酸37位包含对-乙酰基苯丙氨酸的HSA变体，其中氨基酸位置的编号依照SEQ ID NO :1的，所述靶多肽是在氨基酸6位包含ε -(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸的ΑΒΤ-510变体，其中氨基酸位置的编号依照SEQ ID NO :3的。在这些实施方式中， 对-乙酰基苯丙氨酸与ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸通过肟连接反应产生偶联物。相关地，本发明提供包含载体多肽结构域和靶多肽结构域的载体多肽_靶多肽偶联物，所述载体多肽结构域包含第一非天然氨基酸残基，所述靶多肽结构域包含第二氨基酸残基，其中所述载体多肽结构域和所述靶多肽结构域通过第一和第二非天然氨基酸残基偶联在一起。所述偶联物的载体多肽结构域可任选包含本文所述的任何载体多肽，所述偶联物的靶多肽可任选包含任一(或多个)本文所述的靶多肽变体。在具体的实施方式中，载体多肽_靶多肽偶联物的载体多肽结构域包含HSA，第一非天然氨基酸残基是对-乙酰基苯丙氨酸，靶多肽结构域包含TSP-I，第二非天然氨基酸残基是ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸。在其它实施方式中，载体多肽-靶多肽偶联物的载体多肽结构域包含HSA，第一非天然氨基酸残基是对-乙酰基苯丙氨酸，靶多肽结构域包含ΑΒΤ-510，第二非天然氨基酸残基是ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)_L_赖氨酸。任选可在甲基营养酵母细胞，例如假丝酵母细胞、汉逊酵母细胞、毕赤酵母细胞或球拟酵母菌细胞中，在翻译期间将第一非天然氨基酸残基掺入载体多肽结构域。可任选在本文所述任一或多个反应中，通过第一和第二非天然氨基酸的反应而共价偶联载体多肽和靶多肽。本发明还提供包含本文所述载体多肽-靶多肽偶联物的细胞。例如，此类细胞可任选包含多肽-靶多肽偶联物，其中所述偶联物的载体多肽结构域包含HSA变体，其包含第一非天然氨基酸，例如对-乙酰基苯丙氨酸。本发明细胞可包含多肽-靶多肽偶联物，其中所述偶联物的靶多肽结构域包含TSP-I变体，其包含第二非天然氨基酸，例如ε _(2-(氨基氧基)乙酰基)_L-赖氨酸。在其它实施方式中，本发明细胞可包含多肽 -靶多肽偶联物，其中所述偶联物的靶多肽结构域包含ABT-510变体，其包含第二非天然氨基酸，例如 ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸。试剂盒也是本发明的特征之一。例如，试剂盒可任选装有本文提供的任一或多种组合物。或者，试剂盒可装有合成载体多肽和/或靶多肽，例如治疗性小肽的试剂，所述载体多肽包含第一化学反应性非天然氨基酸，所述靶多肽包含第二化学反应性非天然氨基酸。此类试剂可包括，例如反应性非天然氨基酸，包含适合产生含非天然氨基酸的载体多肽和/或靶多肽的正交翻译系统组分的宿主细胞，例如甲基营养酵母细胞，进行连接反应产生本发明偶联物的溶液，产生包含一种或多种本发明偶联物的治疗性制剂的试剂、培养基等。本发明试剂盒可装有附加组分，例如使用说明书以构建能表达包含非天然氨基酸的载体多肽和/或靶多肽的甲基营养酵母菌株，进行化学连接反应从而产生载体多肽_靶多肽偶联物，等等。试剂盒装有容纳试剂盒组分的容器，实施本文的任何方法或任何方法组合的使用说明材料，利用试剂盒提供的细胞(例如，甲基营养酵母细胞)产生在所选氨基酸位置包含化学反应性非天然氨基酸的感兴趣载体和/或靶多肽的使用说明书。本领域技术人员应知道可单用或联用本发明提供的方法、试剂盒和组合物。例如， 可采用本发明方法产生本发明的载体多肽-靶多肽偶联物。技术人员应知道本文所述本发明特征的其它组合。定义在详细描述本发明之前，应理解，本发明不限于具体的生物学系统，因为它们当然可能变化。还应理解本文所用的术语仅为了描述特定实施方式而非限制性的。在本说明书和随附权利要求书中所用的单数形式“一个”，“一种”和“该”包括多个指示物，除非上下文中另有明确表示。因此，例如述及“氨酰tRNA合成酶(RS) ”任选包括两个或更多个RS分子的组合；述及“载体多肽”或“甲基营养酵母细胞”实际上任选包括多个载体多肽或许多甲基营养酵母细胞。除非另有限定，本文所用的所有技术和科学术语均与本发明所属领域普通技术人员的通常理解一致。虽然也可采用与本文所述相似或等同的任何方法和材料实施或测试本发明，但本文描述了优选的方法和材料。描述和要求保护本发明时，依据以下定义使用下列术语。载体多肽术语“载体多肽”指可采用，例如本文提供的方法偶联于靶多肽的各种多肽中的任何一种。利用载体多肽可有利于，例如在载体-靶标偶联物给予对象后促进共价连接的靶多肽递送入细胞，降低它们的毒性和/或延长它们的稳定性和/或活性。载体蛋白质的优选特征可包括溶解度高和半衰期长，然而，并不打算根据是否具有任何特定的生物学活性来限制载体多肽。常规使用的载体蛋白质包括人血清白蛋白(HSA ； 66kDa)、牛血清白蛋白(BSA ;67kDa)、抗体片段，如Fc(45kDa)，和匙孔贼血蓝蛋白(KLH ； 4. 5xl05-l. 3xl07Da)。在下述一个有用的实例中，将治疗肽ABT-510共价连接于载体多肽 HSA可增加肽的血清半衰期。
载体多肽可任选是此类多肽的修饰形式，例如通过包含非天然氨基酸作修饰。掺入非天然氨基酸的载体多肽在本文称为“载体多肽变体”。术语“相关”指共同起作用或彼此具有一定特异性的组分，例如正交 tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)，其中该O-RS用非天然氨基酸特异性氨酰化该0-tRNA。本文所用术语“衍生自”指组分从特定分子或生物分离或制备、或者根据该特定分子或生物的序列信息分离或制备。例如，衍生自第二多肽的多肽可包含与该第二多肽的氨基酸序列相同或基本相似的氨基酸序列。以多肽为例，可通过例如天然产生的诱变、人工定点诱变或人工随机诱变获得衍生种类。用来衍生多肽的诱变可以是有意定点的或是有意随机的，或混用这两者。诱变多肽以产生衍生自第一多肽的不同多肽可以是随机事件，例如聚合酶失真(infidelity)所致，而鉴定衍生的多肽可通过例如本文引用的参考文献所述的合适筛选方法完成。多肽的诱变通常需要操作编码该多肽的多核苷酸。编遇:本文所用的术语“编码”指用多聚大分子或序列链中的信息来指导不同于该第一分子或序列链的第二分子或序列链产生的任何过程。本文所用的该术语应用广泛，可用于各领域。在一些方面，术语“编码”描述了半保留DNA复制的过程，其中双链DNA分子的一条链用作模板，借助依赖DNA的DNA合成酶来编码新合成的互补姊妹链。在另一方面， 术语“编码”指用一种分子的信息来指导化学性质不同于该第一分子的第二分子产生的任何过程。例如，DNA分子可编码RNA分子，例如，通过包括依赖DNA的RNA聚合酶的转录过程。RNA分子也可编码多肽，例如在翻译过程中。当术语“编码”用于描述翻译过程时，其含义也延伸至编码氨基酸的三联密码子。在一些方面，RNA分子可编码DNA分子，例如通过包括依赖RNA的DNA合成酶的逆转录过程。在另一方面，DNA分子可编码多肽，应该知道该情况中用“编码”同时包括转录和翻译过程。掺入非天然氨基酸本文所用的“掺入非天然氨基酸”，例如掺入载体或靶多肽指在载体过靶多肽的一级构建中，例如通过翻译或化学合成将非天然氨基酸直接加入延伸中的多肽链。 起反应本文所用的术语“起反应”指本发明的Ο-tRNA识别选择者密码子并介导与该tRNA偶联的非天然氨基酸掺入延伸中的多肽链的过程。非_真核牛物本文所用的术语“非_真核生物”指属于原核生物界(也称为原核生物(Procarya))的生物。非-真核生物，例如原核生物通常因其以下特征而区别于真核生物单细胞组织，通过出芽或分裂的无性生殖，缺乏膜结合的核与其它膜结合的细胞器， 环状染色体，存在操纵子，不存在内含子、信使(RNA)加帽和聚-A mRNA,以及其它生物化学特征，如不同的核糖体结构。原核生物包括真细菌和古细菌(Archaea)(有时称为“古细菌 (Archaebacteria)")亚界。在原核生物界有时将蓝细菌(蓝绿藻)与支原体分为不同类另O。然而，真细菌、古细菌、蓝细菌和支原体均理解为非-真核生物。^ 本文所用的术语“正交，，指与某细胞或翻译系统的内源性相应分子相比，某分子(例如，正交tRNA (Ο-tRNA)和/或正交氨酰tRNA合成酶(O-RS))与该细胞内源性组分起作用的效率降低，或不能与该细胞的内源性组分起作用。就tRNA和氨酰基-tRNA合成酶而言，正交指与和内源性tRNA合成酶起作用的内源性tRNA相比，正交tRNA不能与内源性tRNA合成酶起作用或起作用的效率降低；或者与和内源性tRNA起作用的内源性tRNA合成酶相比，正交氨酰tRNA合成酶与内源性tRNA不起作用或起作用的效率降低，所述效率降低例如，小于20%的效率，小于10%的效率，小于5%的效率，或小于的效率。正交分子缺乏细胞中功能正常的内源性互补分子。例如，与内源性RS氨酰化内源性tRNA相比，细胞的任何内源性RS氨酰化细胞中正交tRNA的效率降低或者甚至为0。在另一例子中，与内源性RS氨酰化内源性tRNA相比，正交RS氨酰化感兴趣细胞中任何内源性tRNA的效率降低或者甚至为0。可将第二正交分子引入与第一正交分子起作用的细胞。例如，正交tRNA/RS配对包括在细胞中共同起作用的所引入互补组分，且与对照相比，其效率是，例如45%效率、 50%效率、60%效率、70%效率、75%效率、80%效率、90%效率、95%效率或99%效率，或更高，所述对照例如相应的tRNA/RS内源性配对或活性正交配对。ιΗ交氨酰tRNA合成酶本文所用的正交氨酰tRNA合成酶(O-RS)是在感兴趣翻译系统内用氨基酸优先氨酰化Ο-tRNA的酶。O-RS加载到Ο-tRNA上的氨基酸可以是任何氨基酸，无论是天然、非天然或是人工的，并且不限于本文所述的。该合成酶任选与 天然酪氨酰氨基酸合成酶相同或同源，或者与称为O-RS的合成酶相同或同源。ιΗ交-tRNA 本文所用的正交tRNA (Ο-tRNA)是与感兴趣翻译系统正交的tRNA，其中所述tRNA是，例如(1)与天然产生的tRNA相同或基本类似；(2)通过天然或人工诱变衍生自天然产生的tRNA; (3)由考虑了(1)或(2)的野生型或突变型tRNA序列的任何方法产生；(4)与野生型或突变型tRNA同源；(5)与称为正交tRNA合成酶底物的任何示例性 tRNA同源；或(6)称为正交tRNA合成酶底物的任何示例性tRNA的保守变体。Ο-tRNA可加载有氨基酸，或处于非负载状态。还应知道“Ο-tRNA”任选被相关合成酶用非天然氨基酸加载(氨酰化)。应该知道，实际上优选利用本发明的Ο-tRNA在翻译期间对选择者密码子起反应而将基本上任何非天然氨基酸掺入延伸的多肽。多肽多肽是仵何长度的氨基酸残基(天然或非天然的，或其组合)的任何寡聚物，通常但不绝对是由共价肽键连接在一起的。多肽可以是任何来源的，例如，天然多肽、通过重组分子基因技术制备的多肽、来自细胞和翻译系统的多肽、或者以无细胞合成方式制备的多肽。多肽的特征由其氨基酸序列决定，例如，其组成氨基酸残基的一级结构。在本文中，多肽的氨基酸序列不限于全长序列，也可能是部分序列或完整序列。另外，这并不意味着根据是否拥有任何特定生物活性来限制多肽。在本文中，术语“蛋白质”是多肽的同义词。 术语“肽”是指小的多肽，例如但不限于长2-25个氨基酸的多肽。优先氨酰化对于本文所用正交翻译系统，当某表达系统中O-RS使Ο-tRNA加载氨基酸的效率高于其使任何内源性tRNA加载氨基酸的效率时，该O-RS “优先氨酰化”相关 0-tRNA。即，当翻译系统中存在摩尔比大致相等的Ο-tRNA与任何给定的内源性tRNA时， O-RS加载Ο-tRNA的频率高于它加载内源性tRNA的频率。当翻译系统中存在等摩尔浓度的 Ο-tRNA与内源性tRNA时，由O-RS加载的Ο-tRNA与由O-RS加载的内源性tRNA的相对比例优选较高，最好导致O-RS仅加载或几乎仅加载Ο-tRNA。当存在等摩尔浓度的Ο-tRNA与 O-RS时，O-RS加载的Ο-tRNA与内源性tRNA的相对比例大于1 1，优选至少约2 1，更优选5 1，更优选10 1，更优选20 1，更优选50 1，更优选75 1，更优选95 1、 98 1、99 UlOO 1,500 1,1,000 1,5,000 1 或更高。当(a)与内源性tRNA相比，O-RS优先氨酰化0_tRNA，和(b)与O-RS用任何天然氨基酸氨酰化Ο-tRNA相比，氨酰化对非天然氨基酸特异时，称O-RS “优先用非天然氨基酸氨酰化O-tRNA”。即，当包含O-RS和Ο-tRNA的翻译系统中存在等摩尔量的非天然和天然氨基酸时，O-RS用非天然氨基酸加载Ο-tRNA的频率高于用天然氨基酸加载的频率。加载有非天然氨基酸的Ο-tRNA与加载有天然氨基酸的Ο-tRNA的相对比例优选较高。O-RS最好使 Ο-tRNA仅加载，或者几乎仅加载有非天然氨基酸。当翻译系统中存在等摩尔浓度的天然和非天然氨基酸时，使Ο-tRNA加载非天然氨基酸与使Ο-tRNA加载天然氨基酸的相对比例大于1 1，优选至少约2 1，更优选5 1，更优选10 1，更优选20 1，更优选50 1， 更优选 75 1，更优选 95 1、98 1、99 UlOO 1,500 1,1,000 1,5,000 1 或更高。诜择者密码子术语“选择者密码子”指翻译过程中Ο-tRNA识别而内源性tRNA不识别的密码子。Ο-tRNA反密码子环识别mRNA上的选择者密码子并在多肽的此位置掺入其氨基酸，例如非天然氨 基酸。选择者密码子可包括，例如无义密码子，如终止密码子(如，琥珀、赭石和乳白密码子)；四碱基或四碱基以上密码子；罕用密码子；衍生自天然或非天然碱基对的密码子，等等。抑制活件本文所用的术语“抑制活性”通常指tRNA (例如，抑制型tRNA)能翻译连读在其它情况中可导致翻译终止或错译(例如，移码)的密码子(例如，作为琥珀密码子或四个或以上个碱基密码子的选择者密码子)的能力。抑制型tRNA的抑制活性可表示为与第二抑制型tRNA，或与对照系统，例如缺乏O-RS的对照系统相比，观察到的翻译连读活性百分比。可通过本领域已知的许多试验测定抑制效率。例如，可采用β-半乳糖苷酶报道试验，如可将衍生的IacZ质粒(该构建物在IacZ核酸序列中含有选择者密码子)连同含有本发明Ο-tRNA的质粒引入合适生物(例如，可利用正交组分的生物)的细胞。还可引入相关合成酶(可以是多肽或表达时能编码该相关合成酶的多核苷酸)。细胞在培养基中生长至所需密度，例如至OD6tltl约为0.5，进行β-半乳糖苷酶试验，例如用诺瓦金公司(Novagen) 的BetaFluor β -半乳糖苷酶试验试剂盒。可将抑制百分比计算为样品相对于可比较对照，例如，衍生的IacZ构建物的观察值的活性百分比，该构建物在所需位置具有相应的有义密码子而非选择者密码子。抑制型tRNA 抑制型tRNA是在多肽翻译期间通常对终止密码子起反应而掺入氨基酸(即，“连读”)来改变给定翻译系统中信使RNA(mRNA)阅读的tRNA。在一些方面，本发明的选择者密码子是抑制型密码子，例如，终止密码子(如，琥珀、赭石和乳白密码子)、四碱基密码子、罕用密码子等。靶多肽术语“靶多肽”指感兴趣的任何多肽，在共价连接于载体多肽时，其生物利用度、药理学活性、生物学活性、半衰期、免疫原性等得到维持或提高。靶多肽可任选是治疗性小肽，例如TSP-I或ABT-510。或者，靶多肽可以是免疫原性的、衍生自外来生物的、 自身蛋白质或合成多肽。并不打算根据是否具有任何特定生物学活性来限制靶多肽。本发明可用的治疗性小肽的例子包括，例如TSP-I多肽或其衍生物、ABT-510、胰高血糖素样肽-1 (GLP-I)、甲状旁腺激素(PTH)、艾赛那肽_4和许多其它肽，例如本文所述的。靶多肽可任选是此类多肽的修饰形式，例如通过插入非天然氨基酸作修饰。本文将掺入了非天然氨基酸的靶多肽称为“靶多肽变体”。翻译系统术语“翻译系统”指将氨基酸掺入延伸中的多肽链(蛋白质)的各组分。翻译系统的组分可包括，例如核糖 体、tRNA、合成酶、mRNA、O-RS, 0-tRNA等。非天然氨某酸本文所用的术语“非天然氨基酸”指不在20种常见天然氨基酸或罕见的天然氨基酸之列的任何氨基酸，修饰的氨基酸和/或氨基酸类似物，例如硒代半胱氨酸或吡咯赖氨酸(pyrrolysine)。M 本文所用的术语“变体”指包含至少一个化学反应性非天然氨基酸的多肽， 其通常衍生自不含非天然氨基酸的相应“天然”多肽。例如，载体多肽变体(或靶多肽变体) 是“天然”载体多肽(或“天然”靶多肽)的突变体，该突变体包化学反应性非天然氨基酸。 载体多肽变体和/或靶多肽变体中的化学反应性非天然氨基酸可任选替代载体和/或靶多肽的一级序列中的天然氨基酸。或者，可将一个(或多个)非天然氨基酸加入载体或靶多肽的一级序列。掺入载体或靶多肽变体的化学反应性非天然氨基酸可以是保守性或非保守性替代(与不含非天然氨基酸的“天然”载体或靶多肽中的相应天然氨基酸相比)。附图简述
图1是本发明所用各种质粒的示意图。图2显示为测定对选择者密码子起反应将非天然氨基酸对_乙酰基苯丙氨酸掺入 HSA氨基酸37位的保真度和特异性而进行的实验结果。图3显示为比较启动子以优化pApaRS表达和琥珀型抑制而进行的实验结果。图4显示为测定Paqx2、Pypti、Picli、Pfldi、Pgap或Paqxi驱动的aaRS的琥珀型抑制水平而进行的实验结果，通过培养基中rHSAE37pApa水平检验。图5a显示ABT-510肽肟连接于rHSAE37pApa的示意图。图5b显示为测定偶联程度而进行的MALDI质谱法的结果。图6描述了为证明在巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)中，可利用本发明的正交翻译系统将除PApa以外的非天然氨基酸(例如，结构3-9)掺入rHSAE37X而进行的实验。图7描述了为测定pPIC3. 5k和pREAV盒(cassette)是否成功掺入 GS200-rHSAE37X/pREAV-PADH1-pApaRS 而对 4 个转化子进行 PCR 的结果。图8描述了一次转化的GS200-rHSAE37X/pREAV-PADH1-pApaRS的四个不同克隆中 pApaRS-His6x的蛋白质印迹。图9描述了为测定rHSAE37X在巴斯德毕赤酵母Mut+突变株中是否更强效表达的实验结果。图10描述了为扩增各种巴斯德毕赤酵母基因启动子而进行PCR的结果。图11是图4结果的柱状图，显示rHSAE37pApa的琥珀型抑制与启动子驱动pApaRS产生的函数关系。图12显示对25 μ 1 BSA标准品或测试蛋白质表达的未纯化rHSAH生型( )培养基作电泳的蛋白质凝胶。图13显示图6f的泳道2的胰凝乳蛋白酶消化的rHSAE37__c蛋白的LC-MS/MS。图14提供用于实施例1中菌株和质粒构建的寡核苷酸引物的序列。发明详述MM本发明为利用目前可用的交联剂产生载体多肽-靶多肽偶联物提供有益的备选方案。本文提供的方法包括将已直接掺入载体多肽变体的第一化学反应性非天然氨基酸残基与已直接掺入靶多肽变体的第二化学反应性非天然氨基酸残基反应以产生稳定的充分确定的偶联物。此类偶联物可任选用作具有新颖或改善的生物学特性、毒性降低、活性增强和/或半衰期延长的治疗剂。这些方法通过持续产生均质偶联物群体(例如各偶联物包含相同的化学计量和连接位点)而有利于最大程度提高产率和降低成本。从本说明书可知，本发 明的各种实施方式可包括含有第一反应性非天然氨基酸的各种载体多肽变体和含有第二反应性非天然氨基酸的各种靶多肽，其中所述第一和第二非天然氨基酸经反应形成稳定的、共价连接的载体多肽_靶多肽偶联物。载体多肽和/或靶多肽可任选是治疗性的、免疫原性的、衍生自外来生物、自身蛋白质、合成的，等等。下文详述了感兴趣的特定载体多肽。本发明可用的靶多肽包括但不限于治疗性小肽，如TSP-1、 ABT-510、GLP-1、艾赛那肽-4、前述物质的肽衍生物和其它物质，本文它处将进一步描述。在本文所述的某些实施方式中，可以在例如，甲基营养酵母菌，如巴斯德毕赤酵母(P. pastoris)、甲醇毕赤酵母(P. methanolica)、安格斯毕赤酵母(P. angusta)(也称为多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha))、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)和球拟酵母菌(Torulopsis spp)中利用正交tRNA/氨酰基-tRNA合成酶配对将非天然氨基酸高效和高保真度地位点特异性地掺入载体或靶多肽变体。甲基营养酵母菌是用作异源、治疗上有用的蛋白质的重组表达系统的有吸引力的候选对象(Lin-Cereghino等，(2000) “在甲基营养巴斯德毕赤酵母中表达异源蛋白质(Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. )，，FEMS Microbiol Rev 24 45~66 ；2008 年12月10日提交的国际专利申请号PCT/US2008/013568，名为“甲基营养巴斯德毕赤 —巾白勺(In Vivo Unnatural Amino Acid Expression in the Methylotrophic Yeast Pichia Pastoris)，，；和 2008 年 12 月 10 日提交的美国专利申请公布2009/0197339，名为“甲基营养巴斯德毕赤酵母中的体内非天然氨基酸表达(In Vivo Unnatural Amino Acid Expression in the Methylotrophic Yeast Pichia Pastoris)”)。 甲基营养酵母菌的真核亚细胞组织使得它们能进行合成衍生自哺乳动物的生物学活性载体多肽和/或靶多肽所需的许多翻译后折叠、加工和修饰。与酿酒酵母(S. cerevisiae) 表达的蛋白质不同，甲基营养酵母菌，例如巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、安格斯毕赤酵母(也称为多形汉逊酵母)、博伊丁假丝酵母和球拟酵母菌产生的蛋白质不大可能含有能妨碍异源表达的糖蛋白下游加工的高甘露糖聚糖结构。此外，甲基营养酵母菌中合成的载体和/或靶多肽优选不含热原性和抗原性化合物，而这常是大肠杆菌中表达的蛋白质的特征。最有意义的是，甲基营养酵母菌表达系统尤其可用于大规模合成。例如，甲基营养酵母菌中的正交翻译系统表达的含非天然氨基酸的重组载体和/或靶多肽的水平比酿酒酵母、 细菌、昆虫或哺乳动物系统中高10-100倍。此外，不难在简单的、成分明确的盐培养基中培养甲基营养酵母菌，从而无需杆状病毒表达系统所需的昂贵培养基添加剂和设备。在甲基营养酵母菌中利用正交翻译系统的进一步细节见2008年12月10日提交的国际专利申请号PCT/US2008/013568，名为“甲基营养巴斯德毕赤酵母中的体内非天然氨基酸表达”和 2008年12月10日提交的美国专利申请公布2009/0197339，名为“甲基营养巴斯德毕赤酵母中的体内非天然氨基酸表达”。可采用本领域已知的多种方法将第一和第二非天然氨基酸分别直接掺入载体和靶多肽。虽然许多实施方式利用，例如巴斯德毕赤酵母(见下文)或其它甲基营养酵母菌(例如，甲醇毕赤酵母、安格斯毕赤酵母(也称为多形汉逊酵母)、博伊丁假丝酵母和球拟酵母菌)中的正交翻译系统作为直接掺入非天然氨基酸的途径，但也任选采用其它直接掺入方法(例如，体外翻译系统、固相合成等)。应该知道在本文的典型实施方式中，非天然氨基酸在多肽的构建期间掺入载体和/或靶多肽，而不是通过翻译后化学衍生加入的。 在一个说明性实例中，本发明提供用于产生HSA-ABT-510偶联物的方法和组合物。ABT-510是衍生自人血小板反应蛋白的抗血管原性肽模拟物，其在人中显示强效的抗肿瘤活性，但在静脉内给予时其通过肾脏快速清除(Hoekstra等.，(2005) “血小板反应蛋白-1-模拟性抗血管原性抑制剂ABT-510在晚期癌症患者的I期安全性、药代动力学禾口药效学石if究(Phase I safety, pharmacokinetic，and pharmacodynamic study of the thrombospondin-l-mimetic angiogenesis inhibitor ABT-510 in patients with advanced cancer). ”J Clin Oncol 23 :5188_5197 ；Yang 等.，(2007) “血小板反应蛋白 _1 肽ABT-510与丙戊酸的组合是成神经细胞瘤的有效抗血管原性方案(Thrombospondin-1 peptide ABT-510 combined with valproic acid is an effective antiangiogenesis strategy in neuroblastoma). "Cancer Res 67 1716-1724 ；Reiher ^ . , (2002) “用小板反应蛋白-1肽模拟物全身性治疗来抑制肿瘤生长(Inhibition of tumor growth by systemic treatment with thrombospondin-1 peptide mimetics). ” Int J Cancer 98:682-689)。HSA是定性清楚的可溶性血清蛋白，半衰期为19天，其功能主要是作为类固醇、脂肪酸和甲状腺激素的载体蛋白。HSA在，例如在线孟德尔遗传人数据库(Online Mendelian Inheritance in Man database)条目 103600 中有描述(也参见GenBank登录号 AAA98797. 1)。已掺入HSA变体氨基酸37位的对-乙酰基苯丙氨酸残基和已掺入ABT-510 变体氨基酸6位的ε _(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸残基通过选择性肟连接反应产生HSA-ABT-510偶联物。与HSA偶联可延长偶联肽的半衰期，因此增加其治疗应用。已掺入HSA变体氨基酸37位的对-乙酰基苯丙氨酸残基和已掺入ABT-510变体氨基酸1位的 ε _ (2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸残基也可通过选择性肟连接反应产生有用的偶联物。详述的组成是首先阐明可利用本发明提供的方法和组合物化学连接的各种载体多肽和靶多肽。随后描述了产生分别包含第一和第二反应性非天然氨基酸的载体多肽变体和/或靶多肽变体的方法的细节。然后阐明了可用于偶联载体多肽变体与靶多肽变体的化学偶联反应。此后描述了包含本发明偶联物的药物组合物和它们的给药细节。最后，描述了包含本发明偶联物的试剂盒和/或它们的产生方法。感兴趣的载体多肽和靶多肽如上所述，本发明提供产生载体多肽-靶多肽偶联物的方法和组合物，其中分别直接掺入载体多肽和靶多肽的具有独特化学功能的第一和第二非天然氨基酸残基经反应产生指定偶联物的均质群体。载体和靶多肽变体的反应性非天然氨基酸可任选在多肽内的任何位置。载体和靶多肽变体中非天然氨基酸位置的选择任选根据，例如相对于衍生其的 “天然”多肽，置于该位置是否会改变载体和/或靶多肽变体的，例如构象、生物学活性、药理学活性或其它相关特性。任意选择载体和靶多肽中化学反应性非天然氨基酸的位置的另一标准是位置是否使得反应性非天然氨基酸可接近(例如，两个非天然氨基酸能参与连接反应以产生稳定偶联物)，等等。
掺入载体和靶多肽变体的第一和第二氨基酸分别可以是保守性或非保守性替代 (与不含非天然氨基酸的“天然”载体和靶多肽中的相应天然氨基酸相比)。载体多肽和/ 或靶多肽中的化学反应性非天然氨基酸可任选替代该载体多肽和/或靶多肽的一级序列中的天然氨基酸。或者，可将一个(或多个)反应性非天然氨基酸加入载体或靶多肽的一级序列。可采用许多方法分别构建包含第一和第二反应性非天然氨基酸的载体和靶多肽， 所述方法能将非天然氨基酸直接掺入延伸中的多肽链。虽然许多实施方式利用，例如巴斯德毕赤酵母(见下文)或其它甲基营养酵母菌(例如，甲醇毕赤酵母、安格斯毕赤酵母(也称为多形汉逊酵母)、博伊丁假丝酵母和球拟酵母菌)中的正交翻译系统作为直接掺入非天然氨基酸 的途径，但也任选采用其它直接掺入方法(例如，体外翻译系统、固相合成等)， 或可联用这些方法。然而，在甲基营养酵母菌中表达的优点包括它们便于遗传操作、它们对于重组蛋白质生产的经济性和它们能进行真核生物蛋白通常相关的复杂翻译后修饰。下文进一步解释在甲基营养酵母菌中重组蛋白表达的这些和其它优点。在某些实施方式中，可采用本文所述的一种或多种连接化学反应将载体多肽偶联于多个靶多肽以产生，例如治疗上有用的载体-靶偶联物，例如多抗原肽(MAP)。相反，靶多肽可任选偶联于多个载体多肽。分别选择HSA和ABT-510作为载体多肽和靶多肽以说明本发明的诸方面。HSA是定性清楚的血清蛋白，血清半衰期为19天，ABT-510是天然血管原性抑制剂血小板反应蛋白-1的衍生物，其在人中显示强效的抗肿瘤活性，但在静脉内给予时其通过肾脏快速清除 (Hoekstra等.，(2005) “血小板反应蛋白-1-模拟性抗血管原性抑制剂ABT-510在晚期癌症患者的I期安全性、药代动力学和药效学研究”J Clin Oncol 23 :5188_5197 ；Yang等·， (2007) “血小板反应蛋白-1肽ABT-510与丙戊酸的组合是成神经细胞瘤的有效抗血管原性方案”Cancer Res 67 1716-1724 ；Reiher等·，(2002) “用血小板反应蛋白_1肽模拟物全身性治疗来抑制肿瘤生长”Int J Cancer 98:682-689)。如以下实施例所述，已掺入HSA 或HSA变体的对-乙酰基苯丙氨酸残基和已掺入ABT-510或ABT-510变体的ε _(2_(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸残基通过，例如肟连接反应。应该知道以下实施例并不是本发明仅有的实施方式。从本文的描述可以明白，本发明的各种实施方式可包括含有第一反应性非天然氨基酸的各种载体多肽变体和含有第二反应性非天然氨基酸的各种靶多肽变体，其中所述第一和第二非天然氨基酸经反应形成稳定的共价连接的载体多肽_靶多肽偶联物。 因此，在各种实施方式中，所述载体多肽和/或靶多肽可任选是治疗性的、免疫原性的、衍生自外来生物、自身蛋白、合成的，等等。下文描述了感兴趣的具体载体和靶多肽。感兴趣的载体多肽如本文它处所述，可采用本发明提供的方法将载体蛋白有利地连接于靶多肽，例如治疗性肽，如ΑΒΤ-510，以便例如在给予对象后促进靶多肽递送入细胞、增加其血清半衰期、维持稳定其活性、防止其聚集，等等。载体蛋白的优选特征可包括溶解度高和半衰期长； 然而，并不打算根据是否具有任何特定生物学活性来限制靶多肽。载体多肽可任选包含以下物质、是以下物质或与以下物质同源，例如抗体(例如， 0ΚΤ3抗体、HER2抗体等)、抗体片段(例如，SCFV、Fab、FC等)、白蛋白、血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、C-反应性蛋白、伴白蛋白、乳清蛋白、匙孔贼血蓝蛋白(KLH)、离子载体蛋白、酰基载体蛋白、信号转导衔接蛋白、雄激素结合蛋白、钙结合蛋白、钙调蛋白结合蛋白、血浆铜蓝蛋白、胆固醇酯转移蛋白、f-盒蛋白、脂肪酸-结合蛋白、卵泡抑素、卵泡抑素-相关蛋白、GTP-结合蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白、铁-结合蛋白、潜在TGF- β结合蛋白、光-收集蛋白复合物、淋巴细胞抗原、膜转运蛋白、神经垂体素运载蛋白、周质结合蛋白、磷酸-结合蛋白、磷脂酰乙醇胺结合蛋白、磷脂转移蛋白、视黄醇_结合蛋白、RNA-结合蛋白、S-期激酶-相关蛋白、性激素-结合球蛋白、甲状腺素_结合蛋白、钴胺素传递蛋白、皮质激素传递蛋白、运铁蛋白-结合蛋白、和/或维生素D-结合蛋白。然而，应该知道本发明方法和组合物不限于以上所列多肽。本发明的载体多肽_靶多肽偶联物可任选包含本领域熟知的任何载体多肽。感兴趣的靶多肽
靶多肽可包含感兴趣的任何多肽，通过将靶多肽化学连接于载体蛋白可稳定或改善其半衰期、药理学活性、生物学活性、生物利用度。靶多肽可任选是治疗性的、免疫原性的、衍生自外来生物、自身蛋白、合成的，等等。在尤其有用的实施方式中，靶多肽可以是治疗性小肽(参见下文)。然而，并不打算根据是否具有任何特定生物学活性来限制靶多肽。 在本文的实施方式中，靶多肽可包含以下物质、是以下物质的变体或与以下物质同源，例如 TSP-U ΑΒΤ-510、胰高血糖素样肽-1 (GLP-I)、甲状旁腺激素(PTH)、艾赛那肽_4、核糖体灭活蛋白(RIP)、血管抑素、脱辅基蛋白、心房钠尿因子、心房利钠多肽、心房肽、C-X-C趋化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro_a、gro_b、gro_c、IP-10、GCP-2、NAP-4、PF4、MIG、降钙素、 c-kit配体、细胞因子、CC趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1 α、单核细胞炎性蛋白-1 β、RANTES, 1309、R83915、 R91733、T58847、D31065、T64262、CD40配体、补体抑制剂、细胞因子、上皮嗜中性粒细胞活化肽-78、GR0a、MGSA、GRO0 ,GROy ,MIPl-α、ΜΙΡ1_β、MCP_1、上皮嗜中性粒细胞活化肽、促红细胞生成素(EPO)、剥落毒素(exfoliating toxin)、成纤维细胞生长因子(FGF)、FGF21、 G-CSF、促性腺激素、生长因子、水蛭素、LFA-1、人胰岛素、人胰岛素样生长因子(hIGF)、 hIGF-I、hIGF-II、人干扰素、IFN-α、IFN-, IFN-γ、白介素、IL-U IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、 IL-6、IL-7、IL-8、IL_9、IL-10、IL-11、IL-12、角质形成细胞生长因子(KGF)、白血病抑制因子、神经生长因子、PDGF、肽激素、多效生长因子、热原性外毒素Α、热原性外毒素B、热原性外毒素C、松弛素、促生长素抑制素、超氧化物歧化酶、胸腺素α 、人肿瘤坏死因子(hTNF)、 人肿瘤坏死因子α、人肿瘤坏死因子β、Ras、Tat、炎性分子、信号转导分子、牛胰胰蛋白酶抑制剂(BPTI)或BP320抗原。应该知道本发明的方法和组合物也不限于以上所列的那些靶多肽。产牛in本多肽变体和/mp^mm^i可采用能将非天然氨基酸直接掺入延伸中的多肽链的各种方法产生，例如经反应产生本发明偶联物的载体多肽变体和/或靶多肽变体。因此，虽然说明书和实施例主要集中在利用甲基营养酵母菌，例如巴斯德毕赤酵母(见下文)、甲醇毕赤酵母、安格斯毕赤酵母(也称为多形汉逊酵母)、博伊丁假丝酵母和球拟酵母菌中的正交翻译系统分别将化学反应性第一和第二非天然氨基酸掺入载体多肽变体和靶多肽变体，但可任选采用其它正交翻译系统和/或其它非正交直接掺入方法产生包含此类非天然氨基酸的靶和载体多肽变体。在几个实施方式中，可将化学反应性非天然氨基酸掺入载体多肽变体或靶多肽变体，例如治疗性小肽，而所述多肽在，例如利用O-tRNA/O-RS配对的翻译期间、利用化学合成方法等的体外合成期间产生。因此，虽然本文详述了构建包含非天然氨基酸的载体和/或靶多肽变体的具体方法，例如在甲基营养酵母菌中利用正交翻译系统，但不应将它们视作限制性的。本发明的许多实施方式还包括在一级装配期间将非天然氨基酸直接掺入载体和/或多肽的其它方法。 采用，例如下文所述的任何方法将反应性第一和第二非天然氨基酸分别掺入载体多肽和靶多肽之后，载体多肽变体中存在的第一非天然氨基酸可经，例如本文它处所述任一种连接化学反应与靶多肽变体中存在的第二非天然氨基酸反应形成稳定的指定偶联物。应该知道，在一些实施方式中，先将非天然氨基酸遗传掺入载体多肽和靶多肽 (例如，通过正交翻译系统，如本文所述和引用的那些)，再形成稳定的载体多肽_靶多肽偶联物优于采用目前可用的方法产生载体多肽-靶多肽偶联物。例如，目前将靶多肽偶联于载体HSA的一种方法包括通过马来酰亚胺连接键利用其单游离半胱氨酸(残基34)。该方案有数个缺点，包括马来酰亚胺的抗原性和内源性一氧化氮、游离半胱氨酸、谷胱甘肽或糖造成半胱氨酸34的频繁修饰，从而导致偶联效率不定。利用体内正交翻译系统将非天然氨基酸遗传掺入载体多肽和/或靶多肽可产生生物学和/或药理学活性的载体多肽变体和/或靶多肽变体，但含有通过非天然氨基酸的直接掺入而添加的活性/官能基团，官能基团可反应以便产生稳定的载体-靶多肽偶联物。 此外，利用体内掺入非天然氨基酸的新颖生物技术工具可有助于高收率、低成本地产生天然构象合适的包含非天然氨基酸的载体和/或靶多肽。此外，可根据，例如分子接头长度、 反应条件、所得接头是否可切割等标准精心选择分别掺入载体和靶多肽变体的第一和第二非天然氨基酸的反应性。相反，在一些实施方式中，采用例如固相肽合成等其它体外方法，全合成含非天然氨基酸的载体或靶多肽变体产生较短的分子(例如，约60-100个氨基酸)以及产生变性的蛋白质，产率较低。在某些实施方式中，利用甲基营养酵母菌中的正交翻译系统产生包含非天然氨基酸，例如对_乙酰基苯丙氨酸的载体多肽变体，例如HSA，该非天然氨基酸可与靶多肽变体， 例如TSP-I或ABT-510中的第二非天然氨基酸，例如ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸反应以形成稳定的载体多肽-靶多肽偶联物。对于产生此类蛋白质，利用甲基营养酵母菌，例如巴斯德毕赤酵母(见下文)、甲醇毕赤酵母、安格斯毕赤酵母(也称为多形汉逊酵母)、博伊丁假丝酵母和球拟酵母菌中的0-RS/0-tRNA配对的特征在于优于其它正交系统， 例如大肠杆菌、酿酒酵母或哺乳动物细胞中那些系统的数个优点。如下文进一步描述的，它们便于遗传操作、它们对于重组蛋白质生产的经济性和它们能进行真核生物蛋白通常相关的翻译后修饰使得甲基营养酵母菌成为表达含非天然氨基酸的异源蛋白质，例如载体多肽变体和/或靶多肽变体的有利系统。ιΗ交tRNA/ ιΗ交氨酰t-RNA合成酶技术在某些实施方式中，先将可参与化学连接反应的化学反应性第一和第二非天然氨基酸(例如本文它处所述那些)分别掺入载体多肽和/或靶多肽，再通过正交 tRNA(Ο-tRNA)/氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)系统进行化学连接反应。因此，通过对0_tRNA/ O-RS配对相关活性的理解，而进一步加深对本发明提供的组合物和方法的理解。通常，为在遗传编码中加入非天然氨基酸，需要包含氨酰基-tRNA合成酶和合适tRNA的新正交配对， 该配对在宿主翻译机器中有效起作用，但与所述翻译系统“正交”。因此，正交部分起作用不依赖于翻译系统的内源性合成酶和tRNA。正交配对所需的特征包括，仅解码或识别特定密码子，例如选择者密码子，如琥珀终止密码子的tRNA，所述密码子不被任何内源性tRNA 解码，以及氨酰基-tRNA合成酶，该合成酶仅用一种特定的非天然氨基酸优先氨酰化或“加载”其相关tRNA。O-tRNA通常不被或很少被内源性合成酶氨酰化，即，加载。
本领域已知适合产生包含一个或多个非天然氨基酸的本发明蛋白质的正交翻译系统的一般原理，它们是产生正交翻译系统的一般方法。例如参见名为“生产正交tRNA-酰胺-tRNA 合成酶对的方法和组合物”(METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA-AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS)的国际公布号 WO 2002/086075 ； 名为“体内掺入非天然氨基酸”(IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS)的国际公布号WO 2002/085923 ；名为“扩展真核遗传编码”的国际公布号WO 2004/094593 ； 2004 年7月 7 日提交的 WO 2005/019415 ；2004 年7 月 7 日提交的WO 2005/007870 ； 2004 年 7 月 7 日提交的 WO 2005/007624 ;2005 年 10 月 27 日提交的 WO 2006/110182，名为“体内非天然氨基酸掺入所用正交翻译组分”(ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS FOR THE VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS)；以及 2007 年 3 月 7 日提交的WO 2007/103490，名 为“在真核宿主细胞中表达正交翻译组分的系统”(SYSTEMS FOR THE EXPRESSION OF ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS IN EUBACTERIAL HOST CELLS)；和2008年12月10日提交的国际专利申请号PCT/US2008/013568，名为“甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中的体内非天然氨基酸表达(In Vivo Unnatural Amino Acid Expression in the Methylotrophic Yeast Pichia Pastoris) ”。还可参见如 Liu 等(2007)《在哺乳动物细胞中使用遗传学方法将非天然氨基酸掺入蛋白质》“Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in mammalian cells"Nat Methods 4 :239_244 ；2008 年 10 月 30 日提交的国际申请号 PCT/US2008/081868，名为“遗传学编码的硼酸氨基酸”(A Genetically Encoded Boronate Amino Acid) ；2006 年 10 月11日提交的W02007/047301 “对噬菌体展示多肽进行选择性翻译后修饰”(Selective Posttranslational Modification of Phage-Displayed Polypeptides)；以及 2005 年10月27日提交的W02006/110182，名为“体内非天然氨基酸掺入所用正交翻译组分，，(Orthogonal Translation Components for the In vivo Incorporation of Unnatural Amino Acids)。这些前述申请各自通过引用全文纳入本文。为了讨论掺入非天然氨基酸的正交翻译系统，及其产生和使用方法，还可参见Wang和Schultz，(2005) “扩展遗传编石马” (Expanding the Genetic Code) Angewandte Chemie Int Ed 44 :34_66 ；Xie 禾口 Schultz, (2005) “扩展的遗传编码” (An Expanding Genetic Code)Methods 36 :227_238 ； Xie 和 Schultz, (2005) “在遗传库中加入氨基酸”(Adding Amino Acids to the Genetic Repertoire) Curr Opinion in Chemical Biology 9 548-554 ；Wang ^ (2006)"扩展遗传编石马，，(Expanding the Genetic Code)Annu Rev Biophys Biomol Struct 35 :225_249 ； Deiters等(2005) “在大肠杆菌体内将炔掺入蛋白质”(In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Escherichia coli)Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 15 :1521-1524 ;Chin等，(2002) “在大肠杆菌遗传编码中加入L_4_叠氮基苯丙氨酸，，(Addition of p-Azido-L-phenylalanine to the Genetic Code of Escherichia coli) J Am Chem Soc 124 =9026-9027 ；以及2005年9月20日提交的国际公布号 W02006/034332。这些文件各自的内容通过引用全文纳入本文。正交翻译系统的其它细节参见美国专利号 7, 045，337 ；7，083，970 ；7，238，510 ；7，129，333 ；7，262,040 ；7，183,082 ； 7，199，222 和 7，217，809。本文所用的非天然氨基酸指除20种遗传编码的α氨基酸以外的任何氨基酸，修饰的氨基酸和/或氨基酸类似物。本文所用的硒代半胱氨酸或吡咯赖氨酸可掺入载体多肽和/或靶多肽。参见例如，L. Stryer的《生物化学》，第三版，1988，纽约自由人公司(Freeman and Company, New York)中二十种天然氨基酸的结构。非天然氨基酸具有区别于天然氨基酸的侧链基团，虽然非天然氨基酸可以是除20种蛋白α-氨基酸外的天然产生的化合物。本发明所用的非天然氨基酸包括对_(炔丙基氧基)苯丙氨酸、对-甲氧基苯丙氨酸、 丹酰基丙氨酸、DMNB-丝氨酸、邻-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、邻-4-烯丙基-L-酪氨酸、邻-炔丙基-L-酪氨酸、L-Dopa、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对-叠氮-L-苯丙氨酸、对-酰基-L-苯丙氨酸、对-苯甲酰-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰丝氨酸、膦酰酪氨酸、对-碘-苯丙氨酸、对_溴苯丙氨酸、对_氨基-L-苯丙氨酸、酪氨酸的非天然类似物；谷氨酰胺的非天然类似物；苯丙氨酸的非天然类似物；丝氨酸的非天然类似物；苏氨酸的非天然类似物；烷基、芳基、酰基、叠氮基、氰基、卤素、胼、酰胼、羟基、烯基、 炔基(alkynl)、醚、硫醇、磺酰基、磺基、硒代、酯、硫代酸、硼酸盐、硼化物(boronate)、磷、 膦酰基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、烷氧基胺、羟胺、酮或氨基取代的氨基酸、或其任何组合； 带有光活化交联剂的氨基酸；自旋标记的氨基酸；荧光氨基酸；带有新型官能团的氨基酸； 与另一分子共价或非共价相互作用的氨基酸；结合金属的氨基酸；含金属的氨基酸；放射性氨基酸；光束缚的和/或光敏异构化的氨基酸；含生物素或生物素类似物的氨基酸；糖基化或碳水化合物修饰的氨基酸；含酮氨基酸；包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸；重原子取代的氨基酸；可化学切割或可光切割的氨基酸；带有延长侧链的氨基酸；含有毒性基团的氨基酸；糖取代的氨基酸，例如糖取代的丝氨酸等；含碳连接的糖的氨基酸；糖取代的半胱氨酸；氧化还原活性的氨基酸；含α “羟基的酸；含氨基硫代酸的氨基酸；α、α 二取代氨基酸；β -氨基酸；磺基酪氨酸、4-硼(borono)苯丙氨酸、氨基氧基氨基酸、氨基氧基赖氨酸、 氨基氧基鸟氨酸、氨基氧基酪氨酸，或脯氨酸之外的环状氨基酸。可掺入，例如靶多肽和/或载体多肽的其它非天然氨基酸包括但不限于包含任一或多个以下官能团的非天然氨基酸醛部分、酮部分、二酮部分、烷氧基胺部分、酰基酰胼部分、脱氢丙氨酸部分、硫酯部分、酯部分、硼酸酯部分、叠氮化物部分、炔部分、烯部分、 邻位巯基胺部分等。存在于靶或载体多肽中包含此类官能团的非天然氨基酸可分别与，例如存在于载体或靶多肽中的第二非天然氨基酸反应，其包含反应性亲核和/或亲电部分， 例如酮部分、醛部分、烷氧基胺部分、酰基酰胼部分、叠氮化物部分、炔部分、烯部分、氨基部分、巯基部分、氨基苯酚部分、碘代苯基部分，等等。ιΗ交翻译系统正交翻译系统通常包括细胞，例如原核细胞，如大肠杆菌；和真核细胞，如酿酒酵母、哺乳动物细胞和甲基营养酵母菌细胞(例如巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、安格斯毕赤酵母(也称为多形汉逊酵母)、博伊丁假丝酵母和球拟酵母菌)等，所述细胞包含正交tRNA(O-tRNA)、正交氨酰tRNA合成酶(O-RS)和非天然氨基酸，其中O-RS用非天然氨基酸氨酰化Ο-tRNA。正交配对可包括0-tRNA，如抑制型tRNA、移框tRNA等，以及相关O-RS。可用于产生本文的载体多肽和/或靶多肽变体的正交系统(通常包括0-tRNA/0-RS对)可包含细胞或无细胞环境。通常，当正交配对识别选择者密码子并对该选择者密码子起反应而加载氨基酸时，该正交配对称为“抑制”该选择者密码子。即，翻译系统的内源性机器不识别的选择者密码子通常不加载，从而阻止了多肽的产生，否则多肽就可以从核酸上翻译出来。在正交配对系统中，O-RS用特定的非天然氨基酸，如本文实施例中所用的对乙酰基苯丙氨酸氨酰化 Ο-tRNA。加载的Ο- tRNA识别选择者密码子，并且抑制该选择者密码子引起的翻译阻断，例如产生在氨基酸37位包含对-乙酰基苯丙氨酸的HSA变体。翻译系统利用0-tRNA/0-RS配对将非天然氨基酸掺入延伸中的多肽链，如通过编码感兴趣多肽(例如载体多肽和/或靶多肽)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含被 Ο-tRNA识别的选择者密码子。在某些系统中，细胞可包含一个或多个附加的0-tRNA/0-RS 配对，其中附加的O-RS用不同的非天然氨基酸加载附加的Ο-tRNA。例如，一个Ο-tRNA可以识别4碱基密码子，其它Ο-tRNA可识别终止密码子。或者，多个不同的终止密码子，多个不同的四碱基密码子，多个不同的罕用密码子和/或多个不同的非编码密码子可用于同一编码核酸中。因此，单个多肽，如载体多肽和/或靶多肽变体可包含多个非天然氨基酸。或者，系统中产生不同的载体和/或靶多肽或多肽变体可包含不同的非天然氨基酸。关于可用的0-RS/0-tRNA相关配对及其应用的进一步细节可参见例如本文它处标注的参考文献。因此，一些翻译系统可包含多个0-tRNA/0-RS配对，从而能将多于一种非天然氨基酸掺入载体变体和/或靶多肽变体。例如，翻译系统还可包含其它附加的不同0-tRNA/ O-RS配对和第二种非天然氨基酸，其中该附加的0-tRNA识别第二选择者密码子，该附加的 O-RS优选使用该第二非天然氨基酸氨酰化Ο-tRNA。例如，包含0-tRNA/0-RS配对的细胞 (其中Ο-tRNA识别如琥珀选择者密码子)还可包含第二正交配对，其中第二 Ο-tRNA识别不同的选择者密码子，如蛋白石密码子、赭石密码子、四碱基密码子、罕用密码子、非编码密码子等。在一些系统中，不同的正交配对衍生自不同来源，这有利于识别不同选择者密码子。某些翻译系统可包含细胞，如大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞、酿酒酵母细胞或甲基营养酵母菌细胞(例如巴斯德毕赤酵母细胞、甲醇毕赤酵母细胞、安格斯毕赤酵母 (或多形汉逊酵母)细胞、博伊丁假丝酵母细胞和球拟酵母菌细胞)，所述细胞包含正交 tRNA (Ο-tRNA)、正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)、非天然氨基酸和包含编码感兴趣多肽， 例如载体多肽变体和/或靶多肽变体的多核苷酸的核酸，其中所述多核苷酸包含被所述 Ο-tRNA识别的选择者密码子。尽管正交翻译系统可使用培养细胞产生含有非天然氨基酸的蛋白质，这并不意味着本文所用的正交翻译系统需要完整的活细胞。例如，正交翻译系统可使用存在细胞提取物的无细胞系统。事实上，使用无细胞体外转录/翻译系统用于蛋白质的生产是一项成熟技术。改进这些体外系统使之利用本文所述正交翻译系统组分产生具有非天然氨基酸的蛋白质也属于本发明的范围内。Ο-tRNA和/或O-RS可以是天然产生的或可通过天然产生的tRNA和/或RS的突变，如通过产生各种生物的tRNA文库和/或RS文库和/或使用多种可用的突变策略产生。 例如，一种用于产生正交tRNA/氨酰基-tRNA合成酶配对的策略包括将异源tRNA/合成酶配对引入系统，其中所述配对作为一种来源或者多种来源，而非使用tRNA/合成酶配对的翻译系统。候选的异源合成酶的特征包括，如不加载任何宿主细胞tRNA，候选的异源tRNA 的特征包括，如不被任何宿主细胞合成酶氨酰化。此外，异源tRNA对于所有宿主细胞合成酶是正交的。产生正交配对的第二个策略包括产生突变文库用于筛选和/或选择0-tRNA 或0-RS。也可将这些策略组合。ιΗ交 tRNA (0-tRNA)希望正交tRNA(Ο-tRNA)介导将非天然氨基酸掺入多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含Ο-tRNA在体内或体外识别的选择者密码子。因此包含Ο-tRNA的组合物还包含正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)，其中O-RS优选用非天然氨基酸氨酰化Ο-tRNA。含有Ο-tRNA的此类组合物还可包含体外或体内翻译系统。细胞中还可存在包含编码感兴趣多肽的多核苷酸的核酸，其中所述多核苷酸包含被 Ο-tRNA识别的选择者密码子，或一种或多种选择者密码子的组合。产生重组正交tRNA并筛选其对选择者密码子起反应而将非天然氨基酸掺入多肽的效率的方法参见如，国际申请公布号WO 2002/086075，“产生正交tRNA酰胺基tRNA合成酶对的方法和组合物”(METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS";W0 2004/094593，“扩展遗传编码”(EXPANDING EUKARY0TIC GENETIC CODE，，;以及 2004 年 7 月 7 日提交的 TO 2005/019415。参见 Forster 等，(2003) “通过全新设计的翻译遗传编码程序性肽模拟物合成酶” “Programming peptidomimetic synthetases by translating genetic codes designed de novo，，Proc Natl Acad Sci U S A 100:6353-6357 ；和 Feng 等，(2003)“通过单一氨基酸变换扩展 tRNA 合成Bl的 tRNA i只另Ij""Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change"Proc Natl Acad Sci USA 100:5676-5681。其它细节参见美国专利号 7，045，337 ；7，083，970 ；7，238，510 ；7，129，333 ；7，262，040 ；7，183，082 ；7，199，222 和 7，217，809。ιΗ交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)用于产生，例如包含非天然氨基酸的载体和/或靶多肽变体的O-RS系统优选在体外或体内用非天然氨基酸氨酰化Ο-tRNA。通过包含O-RS的多肽和/或通过编码O-RS或其部分的多核苷酸可将O-RS提供给翻译系统。产生0-RS，测定其氨酰化效率，和/或改变其底物特异性的一般细节参见国际公布号WO 2002/086075，名为“产生正交tRNA氨酰基-tRNA合成酶对的方法和组合物”(METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS)；和 WO 2004/094593,名为“扩展真核遗传编码”(EXPANDING THE EUKARY0TIC GENETIC CODE)。还参见，Wang 和 Schultz “扩展遗传编石马，，(Expanding the genetic Code)Angewandte Chemie Int Ed 44:34-66(2005)；及Hoben 和Soil (1985)Methods Enzymol 113 :55_59，它们的内容通过引用全文纳入本文。此类系统的其它细节参见美国专利号 7, 045，337 ；7，083，970 ；7，238，510 ；7，129，333 ；7，262，040 ； 7，183，082 ；7，199，222 和 7，217，809。来源和宿主生物体可任选用于产生，例如包含非天然氨基酸的载体多肽变体和靶多肽变体的正交翻译组分(Ο-tRNA和0-RS)可衍生自任何生物或生物的组合，以便用于任何其它物种的宿主翻译系统，只要所述O-tRNA/0-RS组分与宿主系统能以正交方式起作用，所述非天然氨基酸经反应形成稳定的本发明载体_靶偶联物。正交配对中的Ο-tRNA和O-RS无需衍生自同一生物。例如，正交组分可衍生自用于真细菌宿主系统的古细菌基因。另外，正交Ο-tRNA可衍生自古细菌，如詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii) > ^m ^ ￥ !^υ If lif (Methanobacterium thermoautotrophicum) ； 盐菌，如沃氏富盐菌(Haloferax volcanii)和盐细菌种NRC-1 ；闪烁古生球菌 (Archaeoglobus fulgidus)、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、极端嗜热古菌 (Pyrococcus horikoshii)、嗜热泉生古细菌(Aeuropyrum pernix)、海沼甲烧球菌 (Methanococcus maripaludis) > ￥ ^υ Bf ^(Methanopyrus kandleri) > K ￥ ^tA 叠球菌(Methanosarcina mazei) (Mm)、而才超高温热棒菌(Pyrobaculum aerophilum)、深海火球菌(Pyrococcus abyssi)、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus) (Ss)、超嗜热古菌(Sulfolobus tokodaii)、嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)、火山热原体(Thermoplasma volcanium)等；或真细菌，如大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、嗜热脂肪芽孢杆菌 (Bacillus stearothermphilus)等；而正交O-RS可衍生自以下生物(或生物的组合)，例如古细菌，如詹氏甲烷球菌、嗜热碱甲烷杆菌；盐细菌，如沃氏富盐菌和盐细菌种NRC-I ；闪烁古生球菌、激烈火球菌、极端嗜热古菌、嗜热泉生古细菌、海沼甲烷球菌、甲烷嗜高热菌、 梅氏甲烷八叠球菌、耐超高温热棒菌、深海火球菌、硫磺矿硫化叶菌、超嗜热古菌、嗜酸热原体、火山热原体等；或真细菌，如大肠杆菌、嗜热栖热菌、枯草芽胞杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌等。在其它系统中，真核生物来源，例如植物、藻类、原生动物、真菌、酵母菌、动物(例如哺乳动物、昆虫、节肢动)等也可用作Ο-tRNA和O-RS的来源。而且，O-tRNA/O-RS配对的各组分可衍生自同一生物或不同生物。Ο-tRNA、O-RS或O-tRNA/O-RS配对可在体内或体外选择或筛选和/或可用于细胞， 例如真细菌细胞，从而产生含有非天然氨基酸的多肽。所用的真细菌细胞可包括但不限于， 例如，大肠杆菌、嗜热栖热菌、枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌等。选择者密码子各种选择者密码子均可扩增蛋白质生物合成机器的遗传密码子框架。例如，选择者密码子可包括，如独特的三碱基密码子、无义密码子(如终止密码子(如琥珀密码子(UAG)或乳白密码子(UGA)))、非天然密码子、至少四碱基的密码子、罕用密码子等。可将许多选择者密码子引入所需基因，例如一个或一个以上、两个或两个以上、三个以上等。可采用常规的定点诱变将选择者密码子引入编码感兴趣多肽(例如，对象的自身抗原等)的多核苷酸中感兴趣的位点。可参见，例如Sayers等(1988)，“硫代磷酸酯寡核苷酸定向诱变中的 5，，3，核酸外切酶(5'，3' Exonuclease in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis)，，，Nucleic Acids Res, 16 :791_802o 利用不同的选择者密码子，可利用多对正交tRNA/合成酶配对，从而能利用这些不同的选择者密码子同时位点特异性地掺入多个非天然氨基酸，例如包含至少一个非天然氨基酸。非天然氨基酸也可由罕用密码子编码。例如，当体外蛋白合成反应中的精氨酸浓度下降时，证实罕用的精氨酸密码子AGG可利用丙氨酸酰化的合成tRNA而有效插入Ala。参见例如，Ma等，(1993) “用具有不同反密码子的合成tRNAAla进行体外蛋白质工程改造”(In vitro protein engineering using synthetic tRNAa1s with different anticodons) Biochemistry 32:7939-7945。在这种情况下，合成tRNA与大肠杆菌中少量存在的天然 tRNAtog竞争。此外，一些生物不能利用所有三联密码子。已可在体外转录/翻译提取物中利用藤黄微球菌(Micrococcus luteus)的未指定密码子AGA插入氨基酸。参见例如， Kowal和Oliver，(1997) “在藤黄微球菌中使用未指定的密码子进行基于tRNA的氨基酸诱变(Exploiting unassigned codons in Micrococcus luteus for tRNA-based amino acid mutagenesis) "Nucl Acid Res 25:4685—4689。选择者密码子也可包括延伸密码子，例如四个或四个以上碱基的密码子，如四个、 五个、六个或更多碱基的密码子。四碱基密码子的例子包括，例如AGGA、CUAG, UAGA, CCCU 等。五碱基密码子的例子包括,例如AGGAC、CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, UAGGC等。将非天然氨基酸掺入蛋白质，例如本文它处所述的载体多肽和/或靶多肽的具体方法可包括使用基于移框抑制的扩展密码子。四个或四个以上碱基的密码子可将例如一个或多个非天然氨基酸插入同一蛋白质。在其它例子中，反密码子环可解码，例如至少一种四碱基密码子、至少一种五碱基密码子或至少一种六碱基密码子或更多。由于可能的四碱基密码子有256种，所以同一细胞中可用四个或四个以上碱基的密码子编码多种非天然氨基酸。参见Anderson等，(2002) “探索密码子和反密码子大小的极限”(Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size)Chemistry and Biology 9 :237_244 ;Magliery等，(2001)“扩展遗传编码选择有效的四碱基密码抑制子，以及在大肠杆菌中使用文库法鉴定“狡猾的” 四减基密石马子，，(Expanding the Genetic Code -Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of “Shifty，，Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli) J Mol Biol 307 :755_769 ;Ma 等，(1993) “体外使用具有不同反密码子的合成tRNAAlaI程改造蛋白”(In vitro protein engineering using synthetic tRNAaia with different anticodons)Biochemistry 32 :7939 ；Hohsaka 等，(1999) “在体外蛋白合成系统中将含大芳族基团的非天然氨基酸有效掺入链霉亲合素，，(Efficient Incorporation of Nonnatural Amino Acids with Large Aromatic Groups into Streptavidin in In Vitro Protein Synthesizing Systems)J Am Chem Soc 121 :34-40 ；以及Moore等，(2000) “四联密码子密码子扩增的启示，以及翻译步骤大小的说明，？ (Quadruplet Codons !implications for Code Expansion and the Specification of Translation Step Size) J Mol Biol 298:195-209。四碱基密码子已在各种正交系统中用作选择者密码子。可参见，例如，WO 2005/019415 ；WO 2005/007870和WO 2005/07624。 还可参见 Wang 和 Schultz，(2005) “扩展遗传编码”(Expanding the genetic Code) Angewandte Chemie Int Ed 44 :34_66。对于给定系统，选择者密码子还可包括天然三碱基密码子中内源性系统不用(或很少用)的那个天然碱基密码子。例如，这包括缺乏能识别该天然三碱基密码子的tRNA的系统，和/或该三碱基密码子是罕用密码子的系统。选择者密码子任选包含非天然碱基对。适用于本文方法和组合物的非天然碱基对的描述包括例如Hirao等，(2002)，“将氨基酸类似物掺入蛋白质的非天然碱基对(An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein)”，Nature Biotechnology，20 :177—182。·， (2002) “Enzymatic Phosphorylation
of Unnatural Nucleosides”(非天然核苷的酶促磷酸化)J Am Chem Soc 124 14626-14630。删if相 圣碰表汰禾口·滅 遞肽和/或靶多肽在实施例所述的实施方式中，在巴斯德毕赤酵母中利用正交翻译系统产生包含第一非天然氨基酸，对-乙酰基苯丙氨酸的载体多肽HSA以便与包含第二非天然氨基酸的靶多肽偶联。巴斯德毕赤酵母中所用的正交组分包括衍生自大肠杆菌酪氨酰tRNA-合成酶的 O-RS和Ο-tRNA，例如衍生自大肠杆菌的突变型酪氨酰tRNA。UA琥珀型抑制因子，二者用作宿主巴斯德毕赤酵母细胞中的正交配对。对于产生包含非天然氨基酸的载体多肽和/或靶多肽，在甲基营养酵母菌中利用0-RS/0-tRNA配对的特征在于，其具有优于其它正交系统，例如大肠杆菌、酿酒酵母或哺乳动物细胞的数个优点。首先，甲基营养酵母菌，例如巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、 安格斯毕赤酵母(多形汉逊酵母)、博伊丁假丝酵母细胞和球拟酵母菌的真核亚细胞结构能将UAA掺入要求复杂翻译后修饰的蛋白质，例如哺乳动物蛋白质，如人血清白蛋白 (HSA)和人中性中性肽链内切酶(NEP)，所述翻译后修饰例如是为生物学活性进行的糖基化、二硫键形成、硫酸化、乙酰化、异戊烯化和蛋白水解加工。因此，在细菌系统中最终成为无活性包涵体的许多蛋白质在甲基营养酵母菌中成为生物学活性分子。第二，在甲基营养酵母菌中表达和制备的包含UAA的蛋白质不含可能妨碍蛋白质所专门设计的治疗应用效力的高浓度热原，例如脂多糖或抗原，如高甘露糖寡糖。第三，外来基因在甲基营养酵母菌中的遗传操作可采用许多良好建立的技术和方法，例如基因靶向、高频DNA转化、 功能互补克隆(Lin-Cereghino等，(2002) “在巴斯德毕赤酵母的发酵培养物中产生重组蛋白，，(Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastor is.) " Curr Opin Biotechnol 13:329-332)。有内源性诱导型启动子和可选择标记物可用为由甲基营养酵母菌宿主产生各种含UAA蛋白质增加了灵活性。除了这些优点，甲基营养酵母菌，例如巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、安格斯毕赤酵母(多形汉逊酵母)、博伊丁假丝酵母细胞和球拟酵母菌也良好适用于低成本、大规模合成包含UAA的复杂蛋白质。不难在简单的、成分明确的盐培养基中培养甲基营养酵母菌， 从而无需，例如杆状病毒表达系统或哺乳动物组织培养所需的昂贵培养基添加剂和高成本设备。通常，甲基营养菌可培养至极高细胞密度，在理想条件下甲基营养酵母菌可倍增至细胞悬液呈粘稠浆液。其快速的生长速度使得重组甲基营养酵母菌株能产生高水平(例如比酿酒酵母的水平高10-100倍)的包含UAA的载体和/或靶多肽。它们便于遗传操作、重组蛋白生产经济并且能进行真核生物蛋白质通常相关的翻译后修饰使得它们成为表达包含 UAA的异源蛋白质的有利系统。4种已知的甲基营养酵母菌属，例如汉森酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属和球拟酵母菌属具有共同的代谢途径从而能利用甲醇作为单一碳源。在对甲醇诱导的转录调控反应中，几种酶快速高水平合成。由于控制这些基因表达的启动予是最强且最严格调控的酵母菌启动子，甲基营养酵母菌成为大规模生产重组蛋白的最有吸引力的宿主。这些甲基营养酵母菌的细胞可以快速生长至高密度，可通过简单的培养基操作来调节产物表达水平。早已在巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、安格斯毕赤酵母(或多形汉森酵母)和博伊丁假丝酵母中开发了表达系统，以下文献进一步描述了这些系统H0Uard等， (2002) “工程改造非常规酵母菌以便有效合成大分子甲基营养酵母菌属(Engineering of non-conventional yeasts for efficient synthesis of macromolecules :the methylotrophic genera.)”Biochimie 84 :1089-1093 ;Gellison(2002)《多形汉森酵母 生物学禾口应用》(Hansenula Polymorpha :Biology and Applications),第 1 版，W-V 公司 (Wiley-VCH)，纽约；美国专利号6，645，739 ；Gellisen (2000) “在甲基营养酵母菌中产生异源蛋白质(Heterologous protein production in methylotrophic yeasts. ) "Applied Microbiology and Biotechnology 54 :741_750。可商品化购得许多这些系统用于学术和工业实验室，例如阿特斯生物技术公司(Artes Biotecnology)的汉森酵母试剂盒和英杰公司(Invitrogen)的毕赤酵母试剂盒。可从甲基营养酵母菌表达和纯化包含一个(或多个)非天然氨基酸的载体多肽变体和/或靶多肽变体。如本文它处所述，可在巴斯德毕赤酵母中从调节特征非常适合该目的的醇氧化酶I(AOXl)启动子表达外来基因。酵母菌在利用大多数碳源，例如甘油、葡萄糖或乙醇生长期间，AOXl启动子受到严格阻遏，但在用甲醇生长期间被高度诱导(Tschorp 等.(1987) “在巴斯德毕赤酵母中从两个甲醇调节启动子表达IacZ基因(Expression of the IacZ gene from two methanol-regulated promoters in Pichia pastoris. )"Nucl Acids Res 15:3859-3876)。Paqxi调节的基因所编码蛋白质的表达，例如载体多肽变体和/ 或靶多肽变体，通常达到用甲醇培养的巴斯德毕赤酵母中可溶总蛋白的> 30%。为产生重组载体和/或靶多肽变体，首先用阻遏碳源培养Paoti-控制的表达菌株以产生生物质，例如最大程度提高培养密度，然后换以含甲醇的培养基，例如BMGY、BMMY或BMM作为单一能源以诱导外来基因表达。然而，甲醇不诱导的启动子也宜用于表达编码载体多肽或多肽变体和/或靶多肽或多肽变体的异源基因。该表达系统中AOXl启动子的备选启动子是巴斯德毕赤酵母GAP、 FLDU A0X2、ILCl和YPTl启动子。关于这些启动子的调控、可能最有利于从这些启动子表达外来基因的条件和巴斯德毕赤酵母中通过这些启动子表达外来蛋白质的其它细节描述于，例如Sears等，(1998) “巴斯德毕赤酵母中组成型和受调控基因表达的一套通用载体 (A Versatile Set of Vectors for Constitutive and Regulated Gene Expression in Pichia pastoris.) "Yeast 14 :783_790 ；Vassileva 等，(2001) “利用 GAP 启动子在甲基异源酵母菌巴斯德毕赤酵母中表达乙型肝炎表面抗原(Expression of hepatitis B surface antigen in the methylotrophic yeast Pichia pastoris using the GAP promoter. )"J Biotechnology 88 :21_35 ;Shen等，(1998) “在巴斯德毕赤酵母中控制外来基因表达的氮源调控的强启动子(A strong nitrogen-source regulated promoter for controlled expression of foreign genes in the yeast Pichia pastoris. )，，Gene 216:93-102; Lin-Cereghino等，“在巴斯德毕赤酵母中表达外来基因(Expression of foreign genes in the yeast Pichia pastoris.)，，《遗传工禾呈改造原理禾口方法》(Genetic Engineering Principles and Methods)，第 23 卷，第 1 版，Jane K. Setlow 编，斯普林格公司(Springer), 纽约(2005)。虽然可用摇瓶培养在巴斯德毕赤酵母或其它甲基营养酵母菌中表达载体和/或
29靶多肽，但该系统中表达的蛋白质水平通常在发酵罐培养中更高，因为在发酵罐中可以控制诸如PH、通气和碳源加料速度等参数，从而达到超高细胞密度，例如> 100克/升干细胞重量；> 400克/升湿细胞重量；> 5000D_单位/毫升(参见，例如Lin-Cereghino 等，(2002) “发酵罐培养巴斯德毕赤酵母来产生重组蛋白(Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris. )" Curr Opin Biotechnol 13 =329-332)。巴斯德毕赤酵母表达系统的特点是便于将表达菌株从摇瓶放大到高密度发酵罐培养。通常采用三步方法在巴斯德毕赤酵母或其它甲基营养酵母菌的发酵罐培养中表达P_A。X1转录控制下的基因编码的载体和/或靶多肽变体。在第一步中，用简单的成分确定培养基培养工程改造的巴斯德毕赤酵母表达菌株，该培养基包含不可发酵的Paoti-抑制型碳源以允许细胞生长。第二步包括过渡期，该期间以生长限制速度向培养物中加入甘油以进一步增加培养物的生物质并制备细胞以供诱导。在第三步中，向培养物中加入甲醇，其添加速度应使细胞在生理上适应代谢甲醇并合成重组蛋白。然后定期上调甲醇加料速度直至获得所需生长速度和蛋白质表达速度(Lin-Cereghino等，“在巴斯德毕赤酵母中表达外来基因(Expression of foreign genes in the yeast Pichia pastoris.) ”〈〈遗传工禾呈改造原理禾口方法》(Genetic Engineering Principles and Methods),第 23 卷，第 1 版，Jane K. Setlow编，斯普林格公司，纽约(2005))。培养甲基营养酵母的培养基廉价，成分确定，由诸如甘油和/或甲醇等碳源、生物素、盐、痕量元素和水构成。培养基不含热原和毒素，因此与人用药剂的制备相容。可以在胞内或胞外制备在甲基营养酵母菌中表达的重组载体多肽变体和/或靶多肽变体。由于甲基营养酵母菌只分泌低水平的内源蛋白，分泌的重组蛋白可占培养基中蛋白的大部分。因此，将重组载体和/或靶多肽变体导入培养基可用作蛋白质纯化中的第一步，从而无需采用苛刻的酵母菌裂解方法并避免内源性酵母蛋白污染重组蛋白的可能性。然而由于蛋白质稳定性和折叠要求，将异源蛋白质分泌入培养基通常只针对正常情况下由它们的天然宿主细胞分泌的那些蛋白质。然而，可利用试剂盒，例如英杰公司的原创毕赤酵母表达试剂盒(Original Pichia Expression Kit, Invitrogen)、英杰公司的多拷贝毕赤酵母表达试剂盒(Multi-Copy Pichia Expression Kit, Invitrogen)、研发协作技术公司的毕赤酵母蛋白表达系统(Pichia Protein Expression System, Research Corporation Technologies)，其中从业人员可用预先制备的表达盒将感兴趣基因与编码其天然分泌信号、酿酒酵母α-因子前肽原或巴斯德毕赤酵母酸性磷酸酶(ΡΗ01)信号的序列克隆在框内，从而能分泌入培养基。现已开发了许多技术来回收甲基营养酵母的胞内重组蛋白(Sh印ard等，(2002) “通过细胞透化处理回收巴斯德毕赤酵母的胞内重组蛋白 (Recovery of intracellular recombinant proteins from the yeast Pichia pastoris by cell permeabilization.) ” J Biotechnology 99 :149-160 ；美国专利号 6，821，752)。AA^g^^Mir^^iigajiT^iiMTffe各种蛋白质纯化方法是本领域熟知的，可用于纯化和分析在甲基营养酵母菌中表达的包含UAA的载体和/或靶多肽和多肽变体。这些技术以及分析多肽所需的其它技术包括下列文献所描述的那些:R. Scopes,《蛋白质纯化》(Protein Purification)，S-V公司(Springer-Verlag), (1982) ；Deutscher，去》(Methods in Enzymology),182卷蛋白质纯化指导(Guide to Protein Purification)，学术出版公司(Academic Press, Inc).纽约.(1990) ；Sandana(1997)《蛋白质的生物分离》(Bioseparation of Proteins)，学术出版公司；Bollag等(1996)《蛋白质方法》(Protein Methods)，第2版， W-L 公司(Wiley-Liss)，纽约；Walker (1996)《蛋白质方法手册》(The Protein Protocols Handbook)休玛効β出版社(Humana Press)，新泽西州；Harris和Angal (1990)《蛋白质纯化应用实用方法》(Protein Purification Applications :A Practical Approach)牛津 IRL出版社(IRL Press at Oxford)，牛津，英格兰；Harris和Angal《蛋白质纯化方法使用方法》(Protein Purification Methods :A Practical Approach)牛津 IRL 出版社，牛津，英格兰；Scopes (1993)《蛋白质纯化原理和实践》(Protein Purification principles and Practice)，第3版，S_V公司，纽约Janson和Ryden (1998)《蛋白质纯化原则、高分辨率方法及应用》(Protein Purification principles, High Resolution Methods and Applications)，第2版，WV公司，纽约；以及Walker (1998)《蛋白质方法，光盘版》(Protein Protocols on⑶-ROM)，休玛娜出版社，新泽西州；以及其中引用的参考文献。诚禾口·通常利用适合在大肠杆菌中复制的穿梭载体工程改造将感兴趣基因，例如编码载体多肽和/或靶多肽或其变体并包含选择者密码子的基因置于高度诱导型甲基营养酵母菌启动子控制下的核酸构建物。由于质粒在甲基营养酵母菌中较不稳定，通常随后使表达构建物线性化，转化入，例如巴斯德毕赤酵母属细胞、汉森酵母属细胞、假丝酵母属细胞或球拟酵母属细胞，并整合入基因组。整合通常是位点特异性的；然而，在多形汉森酵母中观察到高频率的非同源整合(Agaphonov等，(2005) “空泡蛋白分选缺陷刺激多形汉森酵母中人尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂的蛋白水解加工(Defect of vacuolar protein sorting stimulates proteolytic processing of human urokinase-type plasminogen activator in the yeast Hansenula polymorpha. )"FEMS Yeast Reseach 5:1029-1035)。 关于甲基营养酵母菌的通用分子操作，例如转化、基因靶向、通过功能互补克隆、利用可用的可选择标记等的其它细节可见，例如Peberdy编，(1991)《真菌的应用分子遗传学》 (AppliedMolecular Genetics of Fungi).剑桥大学出版社，英国；《多形汉森酵母生物学禾口应用》(Hansenula Polymorpha :Biology and Applications),第一版，W~V公司；Higgins 和Cregg.《毕赤酵母方案(分子生物学方法)》(Pichia Protocols (Methods in Molecular Biology))，第一版.休玛娜出版社新泽西州(1998)；和其中引用的参考文献。在优选的实施方式中，在甲基营养巴斯德毕赤酵母中表达载体多肽变体和/或靶多肽变体，例如本文它处详述的那些。可通过以下三个基础步骤在巴斯德毕赤酵母中表达大多数外来基因将编码载体或靶多肽的基因插入表达载体；将该表达载体引入巴斯德毕赤酵母基因组；和分析产生外来基因所表达的载体或靶多肽的推定表达菌株，该方法在上文描述。幸运的是，巴斯德毕赤酵母的分子遗传操作的技术，例如DNA-介导的转化、基因靶向、基因替代和通过功能互补克隆类似于酿酒酵母所述的那些。然而，与酿酒酵母相反，质粒在巴斯德毕赤酵母中不稳定，编码感兴趣蛋白质的表达构建物通过同源重组整合入巴斯德毕赤酵母基因组。巴斯德毕赤酵母的分子遗传操作方案详述于，例如Cregg等， (1985) “巴斯德毕赤酵母作为转化的宿主系统(Pichia pastoris as a host system for transformations.)”Molec Cell Biol 5 :3376_3385 ;Lin_Cereghino 等，“在巴斯德毕赤酵母中表达夕卜来基因(Expression of foreign genes in the yeast Pichia pastoris.) ” 《遗传工程改造原理和方法》(Genetic Engineering Principles and Methods)，第23卷， 第1版，Jane K. Setlow编，斯普林格公司，纽约(2005) ；Higgins和Cregg.《毕赤酵母方案 (分子生物学方法)》(Pichia Protocols (Methods in Molecular Biology))，第一版.休玛娜出版社新泽西州(1998) ；Lin-Cereghino等，(2000) “在甲基营养巴斯德毕赤酵母中表达异源蛋白质(Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris.)”FEMS Microbiol Rev 24 :45_66，和其中引用的参考文献。有各种巴斯德毕赤酵母宿主菌株和表达载体可用。实际上，所有巴斯德毕赤酵母表达菌株衍生自伊利诺斯州皮奥里亚市北区研究实验室(Northern Regional Research Laboratories, Peoria, IL)的NRRL-Y 111430。大多数表达菌株具有能选择包含合适互补标记的表达载体的一个或多个营养缺陷型标记。宿主菌株因A0X1、A0X2或二者中有缺陷而具有不同的甲醇代谢能力。事实上，在AOXl和/或A0X2中有突变的菌株可能是比野生型菌株更好的外来蛋白质生产者(Cregg等.(1987)“在甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中乙型肝炎抗原的高水平表达和有效装配(High level expression and efficient assembly of hepatitis B antigen in the methylotrophic yeast, Pichia pastoris. )"Bio/ Technology 5 :479_485 ;Chiruvolu等，(1997) “采用分批补料发酵在巴斯德毕赤酵母的 Ilfl^BI^PSM^tt^Z^^MilSS (Recombinant protein production in an alcohol oxidase-defective strain of Pichia pastoris in fed-batch fermentation. )Enzyme Microb Technol 21:277-283)。然而，aoxf菌株甚至保留了高水平地诱导从AOXl启动子表达外来蛋白的能力。宿主菌株，包括某些重组蛋白表达可能更有利的蛋白酶缺陷型宿主菌株的更详细信息见，例如Brierley等，(1998) “重组胰岛素样生长因子_1 (IGF-I)的分泌(Secretion of recombinant insulin-like growth factor-1 (IGF-I).) "Methods Mol Biol 103 :149-177 ;White等，(1995) “大规模表达、纯化和鉴定血栓调节蛋白的小片段第六结构域和甲硫氨酸388的作用(Large-scale expression, purification, and characterization of small fragments of thrombomodulin :the roles of the sixth domain and of methionine 388.) "Protein Eng 8:1177-1187。大多数巴斯德毕赤酵母表达载体设计成大肠杆菌/巴斯德毕赤酵母穿梭载体，该载体含有复制起点以便维持在大肠杆菌中以及在一种或两种生物体中起作用的可选择标记，例如在巴斯德毕赤酵母中可选择的ARG4、HIS4、ADEl、URA3、TRPl和某些抗生素，例如 Zeocin 和Geneticin 和/或可在大肠杆菌中选择的许多抗生素耐受标记中的任一种。 表达载体通常包含5’ AOXl启动子序列和用于转录终止的A0X1-衍生序列，二者之间有多克隆位点。虽然AOXl启动子已成功用于表达多种外来蛋白，但仍有可能不适用该启动子的情况，例如就生产食品而言。该表达系统中AOXl启动子之外的备选启动子是巴斯德毕赤酵母A0X2、ICLU GAP、FLDl和YPTl启动子。包含任何上述启动子的通用表达载体图谱和可能的载体组分清单还可见，例如Lin-Cereghino等，“在巴斯德毕赤酵母中表达外来基因 (Expression of foreign genes in the yeast Pichia pastoris.)，，〈〈遗传工禾呈改造原理禾口方法》(Genetic Engineering Principles and Methods),第 23 卷，第 1 版，Jane K. Setlow 编，斯普林格公司，纽约(2005)；和Lin-Cereghino等，(2000) “在甲基营养巴斯德毕赤酵母中表达异源蛋白质(Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast
32Pichia pastoris.) ” FEMS Microbiol Rev 24:45-66。此外，许多载体的 DNA 序列可见英杰公司网站(www. invitrogen. com)，各自可从英杰公司单独购得和在巴斯德毕赤酵母表达试剂盒中购得。通用分子克降方法和技术参考文献中描述了很多分离、克隆和扩增核酸的方法以便准备，例如将感兴趣基因，例如编码载体多肽变体或靶多肽变体的基因克隆入上述表达构建物，这些方法可用于本发明以便，例如在甲基营养酵母菌，如巴斯德毕赤酵母中提供感兴趣基因并表达。这些技术的进一步细节可见=Berger和Kimmel，《分子克隆技术指南一酶学方法》(Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology)第 152 卷，学术出版社公司，圣迭戈，加利福尼亚州(Berger) ；Sambrook等，《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第 3 版)，1_3 卷，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，2000 ( “Sambrook")； 《核酸方法学手册》(The Nucleic Acid Protocols Handbook) Ralph Rapley (编)(2000) 冷泉港，休玛娜出版社公司(Rapley)；《最新分子生物学方法》(Current Protocols in Molecular Biology), F. Μ. Ausubel 等编，《最新方法》(Current Protocols)，格林出版合伙公司(Greene Publishing Associates, Inc.)和约翰韦利父子公司(John Wiley & Sons, Inc.)的合作企业(增补2007) (“ Ausubel"))；《PCR方法，方法和应用指南》(PCR Protocols A Guide to Methods and Applications) (Innis等编)学术出版公司·圣迭戈，加利福尼亚州(1990) (Innis) ；Chen 等(编)《PCR 克隆方法》(PCR Cloning Protocols)，第 2 版 (《分子生物学方法》(Methods in Molecular Biology)，第192卷)休玛娜出版社；Vil joen 等(2005)《分子诊断PCR手册》(Molecular Diagnostic PCR Handbook)斯普林格公司； Demidov和 Broude(编)(2005)《DNA 扩增当代技术和应用》(DNA Amplification =Current Technologies and Applications)地平线生物科学公司(Horizon Bioscience)，怀蒙特汉姆(Wymondham)，英国。其它有用的参考文献，例如，用于细胞分离和培养，例如，用于随后的核酸分离，包括Freshney (1994)《动物细胞培养，基本技术手册》(Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique)，第 3 版，W_L 公司，纽约及其中引用的文献；Payne 等(1992)《植物细胞和组织在液体系统中的培养》(Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems)约翰韦利父子公司纽约，纽约州；Gamborg和Phillips (编)(1995)《植物细胞、组织和器官培养》(Plant Cell, Tissue and Organ Culture)；《基础方法斯普林格实验室手册〉〉(Fundamental Methods Springer Lab Manual), S-V 公司(Springer-Verlag) (伯林、海德堡、纽约)以及Atlas和Parks (编)《微生物培养基手册》(The Handbook of Microbiological Media) (1993) CRC 出版社(CRC Press)，伯克莱屯，佛罗里达州。可商品化购得许多试剂盒用于从细胞纯化质粒或其它相关核酸(参见，例如，法玛西亚生物技术公司(Pharmacia Biotech)的EasyPr印 和FlexiPr印 ；斯特拉塔基因公司(Stratagene)的 StrataClean ；恰根公司(Qiagen)的 QIApi^p )。任何分离的和 / 或纯化的核酸都可以进一步操作以制备其它核酸，用于转染细胞、掺入相关载体以感染生物体以便表达等。典型的克隆载体包含转录和翻译终止子、转录和翻译起始序列、以及用于调节特定靶核酸表达的启动子。载体任选包含基因表达盒，其含有至少一个独立终止子序列、使表达盒在真核细胞或原核细胞或者二者中复制的序列(例如，穿梭载体)以及用于原核和真核系统的选择标记。参见Sambrook，Ausubel和Berger。另外，基本上任何核酸都可以从任何商业来源定制或订购，例如阿拉巴马州亨茨维尔的操纵子技术公司(Operon Technologies Inc.，Huntsville，AL) 0应该知道，虽然本文详述了构建包含化学反应性非天然氨基酸的载体和/或靶多肽变体的特定方法，例如利用甲基营养酵母菌中正交翻译系统，但它们无需视作限制性的。 可利用，例如大肠杆菌、酿酒酵母、哺乳动物细胞等中的正交翻译系统构建包含第一反应性氨基酸的载体多肽变体和/或包含第二反应性氨基酸的靶多肽变体。此外，构建具有非天然氨基酸的载体和/或靶多肽的其它，例如非正交方法也包括在本文的许多实施方式中。 下文进一步详述此类方法。将非天然氨基酸盲接掺入载体多肽和/或靶多肽的非IH交方法如上所述，在本发明的不同实施方式中，可通过直接掺入方法，例如正交翻译系统构建载体多肽和靶多肽或载体多肽和靶多肽变体(各自包含反应性非天然氨基酸，当与另一个中的非天然氨基酸反应时，形成稳定的载体多肽-靶多肽偶联物)。由于正交系统能高产率地产生正确折叠和翻译后修饰并含位点特异性掺入的非天然氨基酸的多肽，这代表了优选的实施方式。然而，还可采用其它策略将非天然氨基酸直接掺入多肽链以便将第一和第二非天然氨基酸分别引入载体多肽变体和/或靶多肽变体。应该知道，在本文的典型实施方式中，非天然氨基酸在多肽构建期间掺入载体和/或靶多肽，而不通过翻译后化学衍生加入。例如，在一级构建期间将非天然氨基酸掺入，例如载体和/或靶多肽的一种通用体外生物合成方法利用无义或移码抑制型tRNA，其用所需非天然氨基酸作化学酰化， 然后加入能支持蛋白质生物合成的提取物中，该提取物包含含有所需琥珀无义突变的基因。该方法已用于将超过100种非天然氨基酸位点特异性地掺入任何大小的各种蛋白质，可用于本文产生包含非天然氨基酸的载体和/或靶多肽变体。参见，例如Cornish 等.(1995) “用扩展的遗传密码探究蛋白质结构和功能”(Probing Protein Structure and Function with an Expanded Genetic Code)Angew Chem Int Ed Engl 34 :621_633 ；Noren 等.(1989) “将非天然蛋白质位点特异性掺入蛋白质的通用方法(A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins) ” Science 244:182-188;和Bain等.(1989) “将非天然氨基酸生物合成性位点特异性地掺入多肽 (Biosynthetic site-specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide.) " JACS 111 :8013_8014。在其它实施方式中，非天然氨基酸可经化学合成直接掺入较小的载体和/或靶多肽(60-100个氨基酸)。固相肽合成是广泛用于化学合成含非天然氨基酸的肽和小蛋白的方法(参见如Merrifield(1963)《固相肽合成I，四肽合成》(Solid Phase Peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrap印tide) JACS 85 :2149_2154)，可改进该方法以产生包含非天然氨基酸的载体和/或靶多肽，其可反应以产生稳定的偶联物。该技术通常包括两阶段第一阶段固相肽合成(SPPS)包括在聚合支持物上通过反复的偶联-去保护循环，用受保护的氨基酸衍生物组装肽链。固相连接肽的游离N末端胺可与一个N-保护的氨基酸单位，例如非天然氨基酸偶联。然后将该单位去保护，暴露下一氨基酸可连接的新N-末端胺。虽然通常是通过分步方法合成肽，但可在各偶联步骤结束时通过过滤除去和洗去肽-固体支持物基质的所有可溶性试剂。在SPPS第二阶段，将肽从支持物上切割，并移除侧链保护基团以产生肽，如包含一个或多个非天然氨基酸的载体或靶多肽。 固相肽合成主要采用两种形式Fmoc (Carpino等，(1972)《9-芴甲氧酰氨基保护基团》 (9-Fluorenylmethoxycarhonyl amino-protecting group)J Org Chem 37 :3404_3409)， 其中使用了碱不稳定的α-氨基保护基，以及t-Boc，其中使用了酸不稳定的α-氨基保护基。各方法涉及不同的树脂和氨基酸侧链保护以及后续切割/去保护步骤。肽合成的其它细节可参见以下出版物和其中引用的参考文献Crick等.(1961) “蛋白质的遗传密石马的通用性质(General nature of the genetic code for proteins.)，，Nature 192 :1227-1232 ；Hofmann等· (1966) “多肽的研究.XXXVI.吡唑-咪唑替代对S-肽片段的 S-蛋白活化效力的影响 1_3(Studies on Polypeptides. XXXVI. The Effect of Pyrazole-Imidazole Replacements on the S—Protein Activating Potency of an S-Peptide Fragment1—3.)” JACS 88 :5914_5919 ;Kaiser 等.(1989) “包括酶在内的生物活性月太禾口蛋白质的合成方法(Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins including enzymes.)，，Acc Chem Res 22 :47_54 ;Nakatsuka 等·(1987)“半合成酶巯基枯草杆菌蛋白酶催化的肽区段合成(Peptide segment synthesis catalyzed by the semisynthetic enzyme thiolsubtilisin.)” JACS 109 :3808_3810 ；Schnolzer 等.(1992) “通过接合未保护的合成肽主链-工程改造HIV蛋白酶来构建蛋白质(Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides backbone-engineered HIV protease.)"Science 5054 221~225 ；Chaiken φ . (1981) 合成妝禾口蛋白质(Semisynthetic peptides and proteins. )，，CRC Crit Rev Biochem 11 255-301 ；0fford(1987) “通过化学方法工程改造蛋白质？(Protein engineering by chemical means ？ ) "Protein Eng 1 :151-157 ；和 Jackson 等.“设计肽连接酶以便全合成含非天然催化残基的核糖核酸酶A (A designed peptide ligase for total synthesis of ribonuclease A with unnatural catalytic residues. )，，Science 5184:243-247。可用于偶联载体多肽和靶多肽变体的化学偶联反应目前用于化学偶联靶多肽变体(例如，治疗性小肽变体)与载体多肽变体的方法包括利用非特异性试剂，例如戊二醛或碳二亚胺活化的N-羟基琥珀酰亚胺酯，和防止载体多肽_载体多肽或靶多肽_靶多肽偶联物形成的高特异性异双功能交联剂。然而，此类试剂仅可用于化学修饰有限数量的氨基酸残基(例如，包含胺、酮、硫醇、巯基或羧基的氨基酸)。利用这些交联剂将载体多肽偶联于靶多肽可扰乱载体多肽、靶多肽或得到的载体-靶多肽偶联物的构象，因而降低偶联物的稳定性、生物学活性、药代动力学活性等。利用此类交联剂常导致载体多肽-靶多肽复合物的异质群体产生，这些异质群体难以分离，从而降低生产效率并使质量控制复杂。相反，本发明偶联物是在正交偶联反应，例如下述任一化学连接反应中通过掺入载体多肽变体的第一非天然氨基酸(例如，利用甲基营养酵母菌细胞中的正交翻译系统) 与掺入靶多肽变体的第二非天然氨基酸反应而产生。这些反应可根据合适的反应条件在体外或体内进行。由于仅有载体和靶多肽变体上存在的非天然氨基酸参与连接反应，本发明方法能可靠地用于高效产生充分确定的载体多肽_靶多肽偶联物的均质群体(例如，包含相同的化学计量和确定的连接位点)。由于各种化学反应性第一和第二非天然氨基酸可任选分别掺入载体和靶多肽变体，载体_靶多肽偶联物的产生不仅限于进行具体化学连接反应的那些条件，例如靶多肽变体、载体多肽变体或得到的载体-靶偶联物可能不稳定的条件。此外，现有技术有利地将非天然氨基酸掺入多肽的任何氨基酸位置。因此，载体和靶多肽中的第一和第二化学反应性非天然氨基酸位置的选择可分别任选根据，例如载体和靶多肽变体中非天然氨基酸位置的选择任选根据，例如置于该位置是否会改变，如载体多肽、靶多肽或所得载体-靶多肽偶联物的构象、生物学活性、药理学活性、稳定性、生物利用度或其它特性。在下文详述的一个示范性但非限制性实例中，掺入HSA的对-乙酰基苯丙氨酸可通过肟连接与掺入ABT-510的ε-(2_(氨基氧基)乙酰基)_L_赖氨酸反应以产生血清半衰期延长的HSA-ABT-510偶联物。应该知道以下实施例中说明的不是本发明唯一的实施方式。从本文描述应该知道各种化学连接反应可用于偶联包含第一反应性非天然氨基酸的载体多肽与包含第二反应性非天然氨基酸的靶多肽，其中所述偶联使第一和第二非天然氨基酸反应。在本发明的各种实施方式中，第一和第二非天然氨基酸任选通过以下反应中的一个或多个反应亲电-亲核反应、肟连接、酮与亲核试剂反应、醛与亲核试剂反应、羰基和亲核试剂之间的反应、磺酰基和亲核试剂之间的反应、酯化反应、位阻酯基和亲核试剂之间的反应、硫酯基团和亲核试剂之间的反应、稳定的亚胺基和亲核试剂之间的反应、环氧基团和亲核试剂之间的反应、氮丙啶基团和亲核试剂之间的反应、亲电试剂和脂族胺或芳族胺之间的反应、亲电试剂和酰胼之间的反应、亲电试剂和碳酰胼之间的反应、亲电试剂和氨基脲之间的反应、亲电试剂和氨基硫脲之间的反应、亲电试剂和羰基酰胼之间的反应、亲电试剂和硫代羰基酰胼之间的反应、亲电试剂和磺酰基酰胼之间的反应、亲电试剂和卡巴胼之间的反应、亲电试剂和硫卡巴胼之间的反应、亲电试剂和羟胺之间的反应、亲核试剂或亲核试剂，例如羟基或二醇和硼酸或酯之间的反应、过渡金属催化的反应、钯催化的反应、铜催化的杂原子烷化反应、环加成反应、1，3环加成反应、2，3环加成反应、炔-叠氮化物反应、狄尔斯-阿德尔反应或铃木偶联反应。下文进一步详述了这些反应中的一些。肟连接首先在未保护多肽的化学选择性连接中采用肟连接以图产生结构受控的分子量大于IOkD的合成大分子(Rose (1994)“同源人工蛋白质的便利合成(Facile Synthesis of Homogenous Artifcial Proteins.) ” JACS 116:30-33)。在第一步中，制备携带酸基的纯化多肽和携带氨基氧基的第二纯化多肽。在第二步中，该两种多肽在非常温和的条件下通过形成肟键而自发性地自我装配。室温下，得到的肟在PH 2-7的水中稳定。如以下实施例所述，通过在pH < 5，ABT-510变体中ε-(2_(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸残基的氨基氧基与HSA变体中对-乙酰基苯丙氨酸残基的酮基反应产生 HSA-ABT-510偶联物。氨基氧基与酮基经历选择性肟连接以便将ε_(2_(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸共价连接于对_乙酰基苯丙氨酸，因而将HSA共价偶联于ABT-510。1，3-偶极环加成反应1，3-偶极环加成也称为“克里克(click)”化学反应，其是1，3-偶极和亲偶极试剂，例如取代的烯烃以形成5-元环。1，3_偶极环加成的一个有用实例是叠氮化物_炔烃胡氏环加成(Azide-Alkyne Huisgen Cycloaddition)，例如叠氮化物和末端或内部炔烃之间的1，3_偶极环加成得到1，2，3_三唑。该铜(I)-催化的反应是温和而极其有效的，无需保护基团，在许多情况中无需纯化(Rostovtsev等.(2002) “分步胡氏环加成过程铜 (I)-催化的叠氮化物和末端炔烃的区域选择性连接(A Stepwise Huisgen Cycloaddition Process :Copper(I)-Catalyzed Regioselective Ligation of Azides and Terminal Alkynes) ”Angew Chem Int Ed 41:2596-2599)。由于该反应涉及环加成而非亲核取代， 蛋白质修饰的选择性极高。向反应混合物中加入催化量的Cu(I)盐，该反应可在室温， 水性条件下进行，区域选择性优秀(1，4 > 1，5)。参见，例如Tornoe等.(2002) “固相上的肽三唑区域特异性铜(i)_催化末端炔烃与叠氮化物的1，3_偶极环加成得到[1，2， 3]-三唑(Peptidotriazoles on solid phase [1, 2, 3]_triazoles by regiospecif ic copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides.) ”T Org Chem 67 :3057_3064 ；和 Rostovtsev等.(2002)“分步胡氏环加成过程铜 (I)-催化的叠氮化物和末端炔烃的区域选择性连接”Angew Chem Int Ed 41:2596-2599。 叠氮化物和炔官能团对生物学分子和水性环境具有较大惰性，从而能在偶联，例如载体多肽与靶多肽时采用叠氮化物-炔烃胡氏环加成。三唑与自然界发现的常见酰胺部分具有相似性，但与酰胺不同，其对切割不敏感。此外，三唑几乎不能氧化或还原。铃木偶联反应包含表面暴露的含芳基碘的非天然氨基酸的靶多肽变体(或载体多肽变体) 可通过钯催化的铃木偶联共价连接于包含表面暴露的硼非天然氨基酸残基，例如对_硼苯丙氨酸、间_硼苯丙氨酸或邻_硼苯丙氨酸的载体多肽变体(或靶多肽变体)。为描述该化学反应，参见，例如Miyaura和Suzuki (1995) “有机硼化合物的钯-催化交叉偶联反应(Palladium-Catalyzed Cross-Coupling Reactions of Organoboron Compounds) ”Chemical Reviews 95 2457 和 Suzuki (1999) “有机硼衍生物与有机亲电试剂的交叉偶联反应的最新进展，1995-1998 (Recent advances in the cross-coupling reactions of organoboron derivatives with organic electrophiles, 1995-1998) ”.Tournal of OrRanometallic Chemistry 576:147。芳基碘是在有机金属化学中有各种应用的反应性基团，包括硅烷化、氨基羰基化、Heck芳基化、乙烯化、与芳基乙炔交叉偶联和许多其它应用。在铃木偶联反应中利用非天然氨基酸的其它细节见2008年10 月30日提交的美国专利申请号12/262，025，名为“遗传编码的硼酸氨基酸(A Genetically Encoded Boronate Amino Acid) ”和 2008 年 10 月 30 提交的国际申请 PCT/US2008/081868， 名为“遗传编码的硼酸氨基酸(A Genetically Encoded Boronate Amino Acid)”。铜_催化的杂原子烷基化反应包含非天然氨基酸残基的靶多肽变体或载体多肽变体可参与铜催化的杂原子烷化反应(Chan等.(2003) “铜促进C—N和C—0键与苯基和吡啶基硼酸交叉
偶联(Copper promoted C---N and C---0 bond cross-coupling with phenyl and
pyridylboronates). "Tetrahedron Letters 44:3863)。不对称还原(Huang φ (2000)“衍生自L-a-氨基酸的手性氧氮杂硼啉酮催化苯乙酮与硼烷的不对称还原(Asymmetric reduction of acetophenone with borane catalyzed by chiral oxazaborolidinone derived from L-a-amino acids). ，，Synthetic Communications 30 :2423)、 狄尔 斯-阿德尔反应(Ishihara和Yamamoto (1999) “芳基硼化合物在有机合成转化中作为酸催化剂(Arylboron Compounds as Acid Catalysts in Organic SyntheticTransformations). "European Journal of Organic Chemistry 3 :527-538)以及各禾中其
它转化，其中所述非天然氨基酸包含硼酸基团。还可利用载体或靶多肽变体表面上存在的硼非天然氨基酸残基与包含醇基团、二醇基团、氨基-醇或含二胺部分的相应靶或载体多肽变体上的非天然氨基酸残基形成可逆硼酯。例如，硼酸与二醇形成可逆共价复合物。该化学反应的早期描述可参见Lorand和Edwards (1959) “苯硼酸离子的多元醇复合物和结构(Polyol Complexes and Structure of the Benzeneboronate Ion). " Journal of Organic Chemistry 24 769-774。还可与氨基醇(Springsteen等.^)01) “硼酸的光度传感器的开发(The Development of Photometric Sensors for Boronic Acids) ·，，Bioorganic Chemistry 四259-270)、氨基酸(Mohler和Czarnik (1994) “芳基硼酸的α-氨基酸螯合络合 (Alpha-Amino Acid Chelative Complexation by an Arylboronic Acid). [CA119 (17) 181171a 中引用文件的勘误].” JACS 116 :2233 ；Mohler 和 Czarnik(1993) “芳基硼酸的 α _ 氨基酸螯合络合(Alpha-Amino Acid Chelative Complexation by an Arylboronic Acid)” JACS 115 :7037-7038)、醇盐(Cammidge 和 Cr6py (2004) “采用不对称铃木反应合成手t生联二蔡(Synthesis of chiral binaphthalenes using the asymmetric Suzuki reaction). "Tetrahedron 60:4377—4386)禾口径 月亏酸(hydroxamic acid) (Lamande 等.(1980) “带有硼原子和超价磷原子的组合物的结构和酸性(Structure et acidite de composes a atome de bore et de phosphore hypercoordonnes)，，Journal of Organometallic Chemistry 329 :1-29)形成可逆复合物。在化学连接反应中利用硼氨基酸的其它细节可见2008年10月30日提交的美国专利申请号12Λ62，025，名为“遗传编码的硼酸氨基酸”;2008年10月30提交的国际申请PCT/US2008/081868，名为“遗传编码的硼酸氨基酸”；和其中引用的参考文献。「2+31环加成反应在某些实施方式中，包含第一非天然氨基酸的载体多肽变体可通过[2+3]环加成偶联于包含第二非天然氨基酸的靶多肽变体。在一个实施方式中，所述第一非天然氨基酸包含炔基或叠氮基部分，所述第二非天然氨基酸包含叠氮基或炔基部分。例如，所述第一非天然氨基酸包含炔基部分(例如，在非天然氨基酸对-炔丙基氧基苯丙氨酸)，所述第二非天然氨基酸包含叠氮基部分。在另一实例中，所述第一非天然氨基酸包含叠氮基部分(例如，在非天然氨基酸对-叠氮基-L-苯丙氨酸中)，所述第二非天然氨基酸包含炔基部分。 在[2+3]环加成反应中利用非天然氨基酸描述于2004年4月4日提交的美国专利申请号 10/拟6，919，名为“非天然反应性氨基酸遗传密码添加(Unnatural Reactive Amino Acid Genetic Code Additions)”。亲电-亲核反应在一些实施方式中，掺入载体多肽变体(或靶多肽变体)的非天然氨基酸中存在的一个反应性基团是亲电部分，掺入靶多肽变体(或载体多肽变体)的第二非天然氨基酸中存在的反应性基团是亲核部分。本领域技术人员已知与亲核部分反应形成共价键的合适亲电部分。此类亲电部分包括但不限于例如，羰基、巯基、醛基、酮基、位阻酯基、硫酯基、稳定的亚胺基、环氧基团、氮丙啶基团等。亲核和亲电试剂之间的反应产物通常包含原始存在于，例如亲核部分中的原子。
38在一些实施方式中，根据所用的亲核部分和与亲核部分反应的亲电部分(例如，醛、酮等)， 亲电试剂是与亲核部分(反应)的醛或酮，包括反应产物，例如肟、酰胺、腙、还原的腙、碳腙 (carbohydrazone)、 ^代碳月宗(thiocarbohydrazone)、石黄酉先基月宗(sufonylhydrazone)、M 基脲、氨基硫脲或类似的官能团。与羧酸的连接通常称为碳酰胼或羟肟酸。与磺酸连接通常称为磺基酰胼或N-磺酰基羟胺。随后可通过化学还原稳定得到的连接键。本领域技术人员已知可与醛和酮反应形成共价键的合适亲核部分。此类亲核部分包括但不限于脂族胺或芳族胺，例如乙二胺。在其它实施方式中，非天然氨基酸可包含反应性基团，例如-NR1-NH2 (酰胼)、-NR1 (C = 0) NR2NH2 (氨基脲)、-NR1 (C = S) NR2NH2 (氨基硫脲)、-(C = 0) NR1NH2 (羰基酰胼)、-(C =幻NR1NH2 (硫代羰基酰胼)、-(SO2) NR1NH2 (磺酰基酰胼)、-N#NR2 (C = 0) NR3NH2 (卡巴胼)、-NR1NR2 (C = S) NR3NH2 (硫代卡巴胼)、或-O-NH2 (羟胺)，其中R1、! 2和R3各自独立为H或具有1-6个碳的烷基，优选H。在本发明的一方面，反应性基团是酰胼、羟胺、碳酰胼或磺酰基酰胼。本发明还可采用其它反应性化学反应，包括但不限于施陶丁格连接(Maudinger ligation)和烯烃复分解化学反应(参见，例如Mahal等.(1997) “通过寡糖生物合成工程改造细胞表面的化学反应性(Engineering Chemical Reactivity on Cell Surfaces Through Oligosaccharide Biosynthesis). "Science 276:1125-1128)。许多其它偶联化学反应也适用，可根据待掺入载体和靶多肽的非天然氨基酸而采用。本领域技术人员熟知此类反应，进一步的细节描述于，例如Dawson等.(1994) “通过天然化学连接合成蛋白质(Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation) ·，，Science 266:776-779; Lemieux等.(1998) “蛋白质、寡糖和细胞的化学选择性连接反应(Chemoselective ligation reactions with proteins,oligosaccharides and cells). "TIBS 16:506-513; Knipe，Chris.〈〈有机反应机制，2004》(Organic Reaction Mechanisms, 2004.)纽约Wiley， 2004 ；等等。药物组合物及其给药 本发明的载体多肽-靶多肽偶联物任选用于治疗应用，例如与合适的药物载体组合。此类组合物包含，例如治疗有效量的偶联物和药学上可接受的载体或赋形剂。此类载体或赋形剂包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇和/或它们的组合。将制剂制备成适合给药方式。给予蛋白质的方法通常是本领域熟知的，可应用于本发明偶联物的给予。可根据本领域熟知的方法，任选在一种或多种合适的体外和/或体内疾病动物模型中检验包含一种或多种本发明载体多肽-靶多肽偶联物的治疗性组合物以确认效力、组织代谢和/或预测剂量。具体地说，首先可通过(比较)本文非天然(蛋白)与未偶联靶蛋白的活性、稳定性或其它合适的手段(例如，比较载体多肽-靶多肽偶联物，如HSA-TSP-I 偶联物(或HSA-ABT-510偶联物)与未偶联于HSA且不含任何非天然氨基酸的TSP(或 ABT-510))来测定剂量，即，采用相关试验。通过常规用于使分子最终接触血液或组织细胞的任何途径给药。可采用任何合适方式给予本发明的载体-肽/靶多肽偶联物，任选与一种或多种药学上可接受的载体一起。 就本发明而言，有将此类偶联物给予患者的合适方法可用，虽然可利用多种途径给予具体的组合物，但某一特定途径提供的作用或反应常能比另一途径更快捷和有效。
药学上可接受的载体部分由所给予的具体组合物以及给予该组合物所采用的具体方法决定。因此，本发明药物组合物有各种合适的制剂。本领域熟知药学上可接受的载体和赋形剂，可通过熟知的方法将一种或多种本发明偶联物配制成药物组合物(参见，例如《雷明顿药学科学和实践》(Remington :The Science and Practice of Pharmacy), 第 21 版，A. R. Gennaro 编·，马克出版公司(Mack Publishing Company) (2005)；《肽和蛋白质的药物制剂开发》(Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins)，S. Frokjaer 和 L. Hovgaard 编.，Taylor & Francis (2000)；和《药物赋形剂手册》(Handbook of Pharmaceutical Excipients)，第 3 版，A. Kibbe 编·，药学出版社 (Pharmaceutical Press) (2000))。可通过各种途径给予本发明的载体多肽-靶多肽偶联物，包括但不限于口服、静脉内、腹膜内、肌肉内、经皮、皮下、局部、舌下或直肠方式。还可经脂质体给予载体多肽-靶多肽偶联物。本领域技术人员通常知晓此类给药途径和适当的制剂。还可将单独的或与其它合适组分组合的本发明偶联物制成气溶胶制剂(即，它们可“喷雾”)以便经吸入给药。可将气溶胶制剂置于加压的可接受推进剂中，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气，等等。适合胃肠外，例如通过关节内(关节中)、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内和皮下途径给药的制剂包括水性和非水性、等渗无菌注射液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使得制剂与所需受者的血液等渗的溶质，还包括水性和非水性无菌悬液，其可含有悬浮剂、 增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。包装核酸的制剂可存在于单剂量或多剂量的密封容器中，例如安瓿和小瓶。胃肠外给药和静脉内给药是优选的给药方法。具体地说，早已用于载体多肽-靶多肽偶联物治疗剂的给药途径以及目前使用的制剂为本发明偶联物提供优选的给药途径和制剂。就本发明而言，根据具体应用，给予患者的剂量足以在一段时间内在患者中实现有益的治疗反应，或者，例如抑制病原体的感染、降低或阻止疾病状态的症状，或其它合适的活性。剂量取决于具体组合物/制剂的效力和所用载体多肽-靶多肽偶联物的活性、稳定性或血清半衰期和患者的情况以及待治疗患者的体重或表面积。剂量的大小还取决于特定患者中给予具体组合物/制剂相伴的任何不利副作用是否存在、其性质和程度，等等。确定待给予组合物/制剂的疾病(例如，癌症、遗传疾病、糖尿病、AIDS等)治疗或预防有效量时，医师评估循环血浆水平、制剂毒性、疾病的进展和/或抗非天然氨基酸多肽抗体的产生，如果相关的话。给予，例如70公斤患者的剂量范围通常与目前采用的治疗性蛋白质的剂量相等， 并为相关载体多肽-靶多肽偶联物的改变活性或血清半衰期作调整。本发明的组合物/制剂可通过任何已知的常规治疗补充治疗条件，包括给予抗体、给予疫苗、给予细胞毒性剂、 天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸类似物、生物学应答修饰剂等。对于给药，本发明偶联物制剂的给药速度由相关制剂的LD-50和/或观察到在各种浓度下(例如适用于患者的体重和总体健康)载体多肽-靶多肽偶联物的任何副作用决定。可通过一次剂量或分份剂量实现给药。制备可给予组合物的通用方法是本领域技术人员已知的，详述于，例如《雷明顿药学科学和实践》，第21版，A. R. Gennaro编.，马克出版
40公司0005)。如果输注包含本发明一种或多种偶联物的制剂的患者产生发热、寒颤或肌肉疼痛，他/她接受合适剂量的阿司匹林、布洛芬、对乙酰氨基酚或其它镇痛/退烧药物。经历输注反应，例如发热、肌肉疼痛和寒颤的患者在将来的输注之前30分钟用阿司匹林、对乙酰氨基酚，或者，例如苯海拉明预先给药。哌替啶用于对退热药和抗组胺不快速起反应的更严重寒颤和肌肉疼痛。根据反应的严重程度减缓或停止治疗。各种对象受益于本发明提供的载体多肽-靶多肽偶联物所提供的治疗性治疗和/ 或预防性治疗。可给予人和此类动物，包括但不限于家畜，如牛、猪、山羊、绵羊、鸡和/或其它一般农业动物包含本文所述偶联物的组合物和制剂。一般的家养宠物，如猫、狗、鹦鹉、 长尾鹦鹉也受益于给予治疗性或预防性载体多肽-靶多肽偶联物。关于生物医学测试和兽医治疗中应用动物模型和动物对象的更多细节见，例如 Ng，Chow和Ogden编《在生物医学研究中使用动物研究者入门》⑴sing Animal Models in Biomedical Research :A Primer for the Investigator)，第一版，新加坡，世界科学出版公司，2008 (Singapore =World Scientific Publishing Company, 2008) ；Conn编《生物医学研究模型原始资料》(Sourcebook of Models for Biomedical Research.)斯普林格出版公司，新泽西州托托瓦(Totowa，NJ Springer)，2008 ；Woodhead编，《生物医学研究中的非哺乳动物模型(第一卷)》(Nonmammalian Animal Models for Biomedical Research (Vol 1))，纽约科学出版社，1990 (New York =Academic Press，1990)。还参见Adams等，《兽医药 里学禾口治疗，第7V片反》(Veterinary Pharmacology and Therapeutics. Eighth Edition)，美国韦理-布莱克维尔(USA =Wiley-Blackwell)，2001 ；Kahn和Line编·《默克兽医手册 第九版》(Merck Veterinary Manual. Ninth Edition)，美国默克(USA =Merck), 2005 ;R 其所引文献。本发明提供的载体多肽-靶多肽偶联物不仅可给予以治疗对象，如人中的疾病状态，还可以进行疗效测试，以及代谢测试，毒理学测试和具体测试以确定载体肽-靶多肽偶联物对生殖功能的影响或胚胎毒性，或确定其致癌潜能。进行这些观察性研究能将本发明偶联物给予各种动物对象。本领域技术人员非常熟悉多种医学测试和测量，从而有助于选择给予包含本发明偶联物的组合物/制剂的动物对象。此类动物对象包括但不限于；如哺乳动物，如山羊、绵羊、骆驼、牛、猪、兔、马、仓鼠、非人灵长类(猴，包括猕猴、狒狒、旧大陆猴和黑猩猩)、豚鼠、大鼠、小鼠和/或猫。鸟类，如家禽(鸡、火鸡)、澳洲鹦鹉、鹦鹉目的鸟和笼养鸟和/或鸟舍鸟，以及鸟类胚胎，也可用于本发明提供的载体多肽-靶多肽偶联物的研究和开发，生产，质控或安全性测试。鱼类，如斑马鱼、新月鱼和剑尾鱼；两栖类，包括如青蛙、蝾螈；和爬行类(蛇，蜥蜴和龟)也可以用于各种测试以确定本文所述组合物和/或其给药方法的安全性，有效剂量和/或毒理学特性。参见，例如Barry等0()0 ，《爬行动物、两栖动物、鱼类和头足类生物医学研究的应用的信息资源》information Resources for Reptiles,Amphibians,Fish, and Cephalopods Used in Biomedical Research)，美国农业部国家农业图书馆动物福利信息中心(United States Department of Agriculture National Agricultural Library Animal Welfare Information Center),及其所弓|文献。试剂盒和厂商文件
试剂盒也是本发明的一个特征。例如，试剂盒可任选装有本发明提供的任一或多种载体多肽-靶多肽偶联物。或者，试剂盒可装有合成包含第一化学反应性非天然氨基酸的载体多肽变体和/或包含第二化学反应性非天然氨基酸的靶多肽变体，例如治疗性小肽的试剂。此类试剂可包括，例如反应性非天然氨基酸，包含适合产生含非天然氨基酸的载体多肽和/或靶多肽变体的正交翻译系统组分的宿主细胞，例如甲基营养酵母菌细胞，进行连接反应以产生本发明偶联物的溶液，产生包含一种或多种本发明偶联物的治疗制剂的试剂，培养基，等等。本发明试剂盒可装有其它组分，例如指导以下应用的使用说明书，构建表达包含非天然氨基酸的载体多肽和/或靶多肽的甲基营养酵母菌株，进行化学连接反应以产生载体多肽-靶多肽偶联物，等等。试剂盒可装有容纳试剂盒组分的容器，实施本文的任何方法或任何方法组合的使用说明材料，利用试剂盒提供的细胞(例如，甲基营养酵母细胞)产生在所选氨基酸位置包含化学反应性非天然氨基酸的感兴趣载体和/或靶多肽的使用说明书。
实施例提供以下实施例是为说明而非限制本发明。应理解，本文所述的实施方式只是为了说明，本领域技术人员应了解据此作出的各种改进或改变，它们包括在本申请的构思和范围以及所附权利要求书的范围内。扩展甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母的遗传库为增加含非天然氨基酸的蛋白质诱变的应用，在甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中开发了重组表达系统。将以前在酿酒酵母中开发的非天然氨基酸特异性氨酰基-tRNA合成酶/抑制型tRNAfeaRS/tRNA-)配对插入真核转录控制元件之间并稳定地掺入巴斯德毕赤酵母基因组。大肠杆菌酪氨酰-和亮氨酰_RS/tRNA。UA配对均显示在巴斯德毕赤酵母中正交，二者用于对琥珀密码子起反应而高产率和保真度地掺入8种非天然氨基酸。一个实例显示包含酮氨基酸(对-乙酰基苯丙氨酸)(图6b，结构1)的重组人血清白蛋白突变体可在该系统内有效表达，并通过肟连接选择性偶联于含ε- -(氨基氧基)乙酰基)_L-赖氨酸残基的治疗性肽模拟物。此外，通过调控aaRS水平系统性优化甲基营养酵母菌中的非天然氨基酸表达，从而在摇瓶中表达突变型人血清白蛋白超过150mg/L，比酿酒酵母中报道的高一个数量级。该方法应能高产率地产生含非天然氨基酸的复杂蛋白质，其表达在现有系统中不现实。最近开发的方法能在原核和真核生物中遗传编码具有新特性的各种非天然氨基酸(包括荧光团、金属离子螯合剂、光束缚和光交联基团、NMR、结晶和顶探针及翻译后修饰的氨基酸)(Xie*khultz(2006) “蛋白质的化学工具包一扩展的遗传密码(A chemical toolkit for proteins—an expanded genetic code). " Nat Rev Mol Cell Biol 7: 775-782 ;Chin 等.Q003) “扩展的真核遗传密码(An expanded eukaryotic genetic code).，，Science 301 :964-967 ；Wang 等· (2006) “扩展遗传密码(Expanding the genetic code). "Annu Rev Biophys Biomol Struct ；35 :225-249)。通过开发正交氨酰基-tRNA合成酶/抑制型tRNA(aaRS/tRNA。UA)配对实现这点，该配对设计成对无义或移框密码子起反应而选择性插入所需非天然氨基酸。迄今为止，该方法已用于将超过40种非天然氨基酸加入大肠杆菌、酿酒酵母和几种哺乳动物细胞谱系的遗传库(Chin等.(2003)“扩展的真核遗传密码”Science 301 :964-967 ；Wang 等.Q006) “扩展遗传密码”Annu Rev Biophys Biomol Struct 35 :225-249 ;Liu等.Q007) “在哺乳动物细胞中将非天然氨基酸遗传掺入的蛋白质(Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in mammalian cells). "Nat Methods 4 :239-244)。通过将正交aaRS/tRNACUA配对及不同tRNA身份元件移植入宿主生物体来实现这些系统的正交性，从而宿主氨酰化机器与植入的aaRS/tRNA配对之间不发生交叉氨酰化(但仍维持翻译功能)。在目前的系统中，已经证明在大肠杆菌中利用衍生自詹氏甲烷球菌酪氨酰_RS/tRNAeuA配对的aaRS/tRNAeuA配对(Wang等.Q001) “产 IE tRNA ^ fflffl Tj (A general approach for the generation of orthogonal tRNAs). ”Chem Biol 8 :883-890)和在酿酒酵母(Chin等.(2003)“扩展的真核遗传密码(An expanded eukaryotic genetic code). ”Science 301 :964-967 ；Chin 等.(2003) “扩展的貞核i^l专密石马白勺进展(Progress toward an expanded eukaryotic genetic code. ) "Chem Biol 10 :511-519)或哺乳动物细胞(Liu等.(2007)“在哺乳动物细胞中将非天然氨基酸遗传掺入的蛋白质."Nat Methods 4:239-244)中的大肠杆菌酪氨酰-或亮氨酰-RS/tRNACUA 配对最成功。然后采用定向进化改变正交aaRS的特异性，从而其能识别感兴趣的非天然氨基酸而非内源性氨基酸。 为将该方法应用于产生细菌宿主中不易表达的大量蛋白质，需要成本低、可扩展并能产生复杂的、翻译后修饰蛋白质的重组系统。一种此类宿主是巴斯德毕赤酵母， 其能产生哺乳动物蛋白，而其产率与大肠杆菌的相当(Cereghino等.Q000) “甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中的异源蛋白质表达(Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris). " FEMS Microbiol Rev 24:45-66)。治疗性蛋白，例如肿瘤坏死因子(TNF)、破伤风毒素片段C(TTC)和人血清白蛋白(HSA) 在高密度发酵中的表达水平> IOg Γ1 (Shekhar (2008) “毕赤酵母的能力印度生物技术工业让非常规的酵母菌工作(Pichia power Jndia' s biotech industry puts unconventional yeast to work). " Chem Biol 15 :201-202 ；Clare φ . (1991) 多个串联整合基因的巴斯德毕赤酵母菌株中高水平表达破伤风毒素片段C(High-level expression of tetanus toxin fragment C in Pichia pastoris strains containing multiple tandem integrations of the gene).，，Biotechnology (纽约)9 :455-460 ； Ohya等.000 “通过反复分批补料发酵在甲基营养酵母巴斯德毕赤酵母中优化人血清白蛋白产生(Optimization of human serum albumin production in methylotrophic yeast Pichia pastoris by repeated fed-batch fermentation). "Biotechnol Bioeng 90 :876-887 ;Sreekrishna等.(1989) “在甲基营养酵母巴斯德毕赤酵母中合成的重组人肿瘤坏死因子的高水平表达、纯化和表征(High-level expression，purification， and characterization of recombinant human tumor necrosis factor synthesized in the methylotrophic yeast Pichia pastoris) ·，，Biochemistry 28:4117-4125)。巴斯德毕赤酵母以此类产率产生蛋白质的能力归因于其醇氧化酶1启动子(ρωχι)，其是已知最高度调节和最强的启动子(Cos等.Q006) “不同启动子下在甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中异源蛋白质产生的操控策略、监测和控制综述(Operational strategies, monitoring and control of heterologous protein production in the methylotrophic yeast Pichia pastoris under different promoters -.a review). " Microb Cell Fact5:17)。此外，巴斯德毕赤酵母缺乏可污染大肠杆菌中表达的治疗性蛋白的内毒素，还不会像酿酒酵母那样产生抗原性al，3聚糖连接键(Cregg等.(199 “在巴斯德毕赤酵母中表达夕卜来基因的最新进展(Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris). ”Biotechnology (纽约)11 :905-910)。另外，现在能调节巴斯德毕赤酵母中的糖基化模式，包括控制唾液酸化(Li等.Q006) “在糖基工程改造巴斯德毕赤酵母中优化人源化 IgG (Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris). ” Nat Biotechnol 24 :210-215) 0出于这些原因，我们开发了在巴斯德毕赤酵母中遗传编码非天然氨基酸的方法。我们在此报道了八种非天然氨基酸位点特异性地引入在该宿主中高产率和保真度地表达的重组人血清白蛋白(rHSA)。材料用于进行本文所述实验的DNA引物(例如，表1和下文所列那些)购自加利福尼亚州圣迭戈的整合DNA技术公司(Integrated DNA Technology, San Diego, CA)。用于制备下述构建物的限制性酶购自马萨诸塞州贝弗利的新英格兰实验室(New England Biolabs, Beverly, ΜΑ) 。 pPIC3.5ki^# ( ^Sie JAL http://tools, invitrogen. com/content/sfs/ manuals/ppic3. 5kpao_man.pdf)和酵母菌感受态、转化方案和培养基处方购自加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司anvitrogen，Carload，CA)。多拷贝毕赤酵母表达试剂盒F型手册(Invitrogen Life,Τ. ,Vol. K1750-01,Edn. F 85(英杰生命技术公司(Invitrogen Life Technologies)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州 92008 ；2005))见 http//tools, invitrogen. com/content/sfs/manuals/pichmulti_man. pdf。DNA在大肠杆菌DH10B (英杰公司)中扩增或者利用钼Pfx(英杰公司)通过PCR扩增。rHSA基因(登录号BC034023)获自马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院的哺乳动物基因保藏所(Mammalian Gene Collection,National Institutes of Health, Bethesda, MD)。DNA测序确认所有DNA构建物(诺华研究基金会基因组研究院(Genomics Institute of the Novartis Research Foundation),拉霍亚，力口利福尼亚州)。双重营养缺陷型巴斯德毕赤酵母菌株，GS200(his4，arg4)和pBLARG载体由加利福尼亚州克莱尔蒙特科克研究院的詹姆斯克莱格实验室(James Cregg laboratory at the Keck Graduate Institute,Claremont,CA)馈赠。利用纽约州罗切斯特费氏科学公司 (Fisher Scientific, Rochester, NY)的2和Imm电穿孔小杯对加利福尼亚州赫拉克勒斯 BR公司(Bio-Rad，Hercules，CA)的GenePulser Xcell进行巴斯德毕赤酵母和大肠杆菌的转化。用于蛋白质分析的Tris-甘氨酸(4-20% ) SDS-PAGE凝胶购自英杰公司。通过英杰公司的Purelink miRNA分离试剂盒或得克萨斯州奥斯汀安比昂公司(Ambion，Austin，TX) 的Ribo-纯-酵母试剂盒随附的技术方案和试剂收集RNA。利用加利福尼亚州圣何塞Adobe 公司(Adobe，San Jose, CA)的Photoshop CS2测定所有反应性凝胶条带密度。设计两种基因盒表达系统由于自主复制质粒在巴斯德毕赤酵母中相对不稳定(Higgins等.(1998)“巴斯德毕赤酵母介绍(Introduction to Pichia pastoris.) ”Methods Mol Biol 103:1-15)，设计了一种系统，其中感兴趣的靶基因(例如，rHSA)和aaRS/tRNAeuA配对在两个不同质粒的盒中编码并稳定整合入基因组。图1提供用于构建巴斯德毕赤酵母中琥珀型抑制的盒的载体。白色箭头标明各质粒的可选择标记物。黑色箭头标明复制起点。竖直条纹箭头标明启动子和转录终止元件。双重营养缺陷型巴斯德毕赤酵母菌株GS200(arg4，his4)用作蛋白质表达的宿主菌株，感兴趣的基因，例如HSA掺入商品化购得的pPIC3. 5k质粒(HIS4，GenK) (图 la) (Invitrogen Life, Τ.，Vol. K1750_01，Edn. F 85 (英杰生命技术公司，卡尔斯巴德， 加利福尼亚州92008 ；2005))。rHSA因其在产生增强短命治疗性多肽的血清半衰期的融合蛋白或肽生物偶联物中的应用而用作模型蛋白(Kim等.Q003) “胰高血糖素-样肽1-白蛋白偶联物的开发和表征体内活化胰高血糖素-样肽1受体的能力(Development and characterization of a glucagon-1ike peptide 1-albumin conjugate :the ability to activate the glucagon-like peptide 1 receptor in vivo) ·，，Diabetes 52 :751-759 ；Huang 等.Q008) “巴斯德毕赤酵母中表达的新型艾赛那肽-4人血清白蛋白融合蛋白的制备禾口表征(Preparation and characterization of a novel exendin-4 human serum albumin fusion protein expressed in Pichia pastoris) ·，，J Pept Sci 14:588-595; Chimng等.Q002) “利用重组人血清白蛋白的药学方案(Pharmaceutical strategies utilizing recombinant human serum albumin) ·，，Pharm Res 19:569-577)。rHSA 因为复杂的蛋白质二硫键而不能在大肠杆菌和酿酒酵母中表达。然而，能在巴斯德毕赤酵母中进行此类翻译后修饰。此外，HSAWM氨基酸的哺乳动物“前-原(pre-pro)”前导序列(图Ie)与在巴斯德毕赤酵母中表达完全相容并能将成熟的蛋白质运送入培养基 (Kobayashi (2006) “重组人血清白蛋白开发综述(Summary of recombinant human serum albumin development). "Biologicals 34 =55-59) 前-原前导肽在运输期间切割以产生成熟的蛋白质(例如，rHSAE37X)。相对于SEQ ID NO :1，rHSA中第37个残基表示对琥珀密码子起反应而掺入的非天然氨基酸。首先制备编码能用于转化GS200的rHSAg^s和rHSAEOT(的序列组件。制备以下 PPIC3. ^(-rHSA(野生型rHSA)构建物野生型rHSA基因得自哺乳动物基因保藏所(NIH)， 基因登录号 BC034023。为与 pPIC3. 5k 线性化(Invitrogen Life,Τ. ,Vol. K1750-01,Edn. F 85(英杰生命技术公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州92008 ；2005))相容，通过改进的斯特拉塔基因公司快变诱变(Quik Change mutagenesis, Stratagene)方案(Zheng 等.Q004)“有效的一步位点定向和位点饱和诱变方案(An efficient one-step site-directed and site-saturation mutagenesis protocol) ·，，Nucleic Acids Res 32 :ell5),利用以下弓| 物(IDT)除去rHSA的BglII位点以产生rHSA野生型用于BglII781的-BglII 1F，5，_GAC AGA CCT TAC CAA AGT CCA CAC GGA ATG CTG CCA TG—3’ 和-BglII 1R，5，-GGT AAG GTC TGT CAC TAA CTT GGA AAC TTC TGC AAA CTC AGC TTT GGG-3，，和用于 BglII817 的 BglII 2F，5，-CAT GGA GAC CTG CTT GAA TGT GCT GAT GAC AGG GCG G-3，和-BglII 2R，5，-CAA GCA GGT CTC CAT GGC AGC ATT CCG TGT GGA C_3，。利用以下引物扩增 rHSA野生型HSA 正向，5，-ATC CGA GGA TCC AAA CGA TGA AGT GGG TAA CCT TTA TTT CCC TTC TTT TTC-3， 和 HSA 反向，5，-GCT AAC GAA TTC ATT ATA AGC CTA AGG CAG CTT GAC TTG CAG C—3，， 用EcoRI和BamHI (NEB)消化，连接入类似消化的pPIC3. 5k载体(英杰公司，载体图谱见 http//tools, invitrogen. com/content/sfs/manuals/ppic3. 5kpao man, pdf)以产生 PPIC3. 5k-rHSA野生a (或pPIC3. 5k_rHSAE37X，如下所述)。通过DNA测序验证构建物，在大肠杆菌DH10B (英杰公司)中扩增。通过PCR诱变产生Glu37TAG突变型rHSA(rHSAE37X)构建物。采用改进的快变诱变方案和以下引物用琥珀型密码子TAG替代Glu37密码子Glu37F，，5，-GAT TGC CTT TGC TCA GTA TCT TCA GCA GTG TCC ATT TTA GGA TCA T-3，和 Glu37 R，，5，-GTT TTT GCA AAT TCA GTT ACT TCA TTC ACT AAT TTT ACA TGA TCC TAA AAT GG-3，。Glu37 处于溶液可接近的螺旋中，如此应有助于肽与引入该位点的化学反应性非天然氨基酸(即，对-乙酰基苯丙氨酸，图6b，结构1)偶联，并确保较大基团的掺入对天然蛋白质结构和折叠的破坏尽量低。然后利用以下引物扩增rHSAE37X:HSA正向，5，-ATC CGA GGA TCC AAA CGA TGA AGT GGG TAA CCT TTA TTT CCC TTC TTT TTC-3，禾口 HSA 反向，5’ -GCT AAC GAA TTC ATT ATA AGC CTA AGG CAG CTT GAC TTG CAG C—3，，用 EcoRI 禾Π BamHI (NEB)消化并连接入类似消化的pPIC3. 5k载体，如以上HSAltta所述，从而将HSArara置于AOXl启动子和终止子的转录控制下。如上所述，通过DNA测序验证rHSAE37X构建物，pPIC3. 5k-rHSAE37Xo在5，A0X1启动子线性化pPIC3. 51^把4^7)(或？？比3. 5k_rHSA野生型能基因组整合一个或多个拷贝的转化盒；通常多个拷贝导致靶蛋白的总产率较高(Buckholz等.(1991)“商 mit^r^M^^^W^M^t (Yeast systems for the commercial production of heterologous proteins). "Biotechnology (N Y) 9 :1067-1072)。以此方式整合使得 AOXl 完整，从而保留酵母快速利用甲醇的能力(Mut+表型)。或者，可对AOXl基因任一侧作线性化进行基因替代，从而由 PPIC3. 5k 载体(Invitrogen Life, Τ. , Vol. Κ1750-01, Edn. F 85 (英杰生命技术公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州92008 ；2005))替代AOXl基因。缺乏AOXl的酵母利用甲醇依赖较弱的A0X2基因，它们的表型是Hiuts。由于通常利用Hiuts酵母进行rHSA表达(Kupcsulik等.(2005)“通过产生HSA的巴斯德毕赤酵母Mut^菌株的统计学和正常动力学模型描述来优化特定产物形成速率(Optimization of specific product formation rate by statistical and formal kinetic model descriptions of an HSA producing Pichia pastoris Mut (S) strain). " Chem Biochem Eng Q 19 :99-108), pPIC3. 5k HSAe37x 和pPIC3. 5k-rHSA野生s经线性化并用于替代AOXl基因以产生GS200_rHSAE37X或GS200_rHSA
(两种菌株均是HIS4，arg4, GenE, muts)。成功的转化体在缺乏组氨酸的极限培养基平板和含有最多0. 25mg/ml氨基糖苷类抗生素Geneticin 的富集培养基平板上正常生长。为用pPIC3. 5k HSAe37x 或 pPIC3. 5k_rHSA野生型序列组件转化 GS200，用 BglII (NEB) 线性化20 μ g pPIC3. 5k-rHSAE37X或pPIC3. 5k_rHSA野生a，通过乙醇沉淀浓缩至10 μ 1，在 2mm电穿孔小杯(费氏公司(Fisher))中加入80 μ 1新鲜的感受态GS200，用GenePulser hell (BR公司)以巴斯德毕赤酵母设置(2000ν，25μΡ，200Ω)作电穿孔。用Iml冷的IM 山梨醇回收细胞。将250 μ 1回收的细胞接种在补加了 ^ig Hir1L-精氨酸(arg)的再生右旋糖Bacto琼脂(RDB)平板(15cm)上，30°C温育。3天后，将菌落挑入含Iml酵母蛋白胨右旋糖(YPD)培养基的96孔2ml板块(Nunc)，生长过夜2 °C，300r. p. m.)。培养液作 1 1000稀释，将1-2 μ 1等份试样接种于含有0. 25mg ml—1 Geneticin (英杰公司)的 YPD琼脂板，30°C温育。4天后，GS200-rHSAE37X转化体G3显示生长良好，挑取并制成感受态。 还挑取显示生长良好的GSZOO-rHSAg^^克隆。为将正交aaRS/tRNACUA配对是否整合入基因组，改进以前为优化酿酒酵母中琥珀型抑制和重组过表达而开发的载体(Chen等.Q007) “在酿酒酵母中产生和分析含非天然氨基酸的突变型蛋白质的改进系统(An improved systemfor the generation and analysis of mutant proteins containing unnatural amino acids in Saccharomyces cerevisiae) · ” J Mol Biol 371 :112-122)(图 lb)。将以前在酿酒酵母中开发的对-乙酰基苯丙氨酸_(pApa，图6b，结构1)特异性氨酰基-tRNA合成酶(pApaRS) Ghang等.Q003) “蛋白质的体内位点特异性修饰的新方案(A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo) ·，，Biochemistry 42， 6735-6746)插入醇脱氢酶1启动子(Padhi)和含His6-标签的终止子(Tadhi)之间以检验其表达。为制备aaRS/tRNA·配对以供整合入巴斯德毕赤酵母基因组，用以下引物通过 PCR 扩增含有 pApaRS 的pPRl-PPG幻+35 //Μ- ΙΝΑ『υΑ载体(Chen 等.Q007) “在酿酒酵母中产生和分析含非天然氨基酸的突变型蛋白质的改进系统”J Mol Biol 371 =112-122), 从而排除了 TRP和2μ起点区，加入限制性位点KpnI和HindIII :pESC F, 5'-TAC CAC TAG AAG CTT GGA GAA AAT ACC GCA TCA GGA AAT TGT AAA CGT—3，和 pESC R，5，-GTG AGG GCA GGT ACC GTT CTG TAA AAA TGC AGC TCA GAT TCT TTG TTT G_3，，用 HindIII 和KpnI (NEB) 消化。用以下引物扩增PBLARG (加利福尼亚州克莱尔蒙特科克研究院的詹姆斯克莱格实验室馈赠)的ARG4编码区 41 4卩新，5，-六狀 TAT GGT ACC TGC CCT CAC GGT GGT TAC GGT-3， 和 ARG4 R 新，5’ -CAT TTC AAG CTT CTA GTG GTA GGA ATT CTG TAC CGG TTT AC-3，，用 KpnI和HindIII消化，连接入类似消化的pPRl-PpG/a+35T/P4-tRNA『UA PCR产物以产生重组真核ARG4载体，pREAV-PADH1-pApaRS。利用以下引物通过PCR扩增pREAV-P^-pApaRS， 从而排除了 PADH1_pApaRS-TADH1 区域，加入限制性位点 AscI 和 AflII :pESC-A0X-KET0 (酮)F， 5' -ATC GTA CTT AAG GAA AGC GTA CTC AAA CAG ACA ACC ATT TCC-3'禾P pESC-AOX-KETO R，5，-TTC TCA GGC GCG CCA TCG CCC TTC CCA ACA GTT GCG-3，。通过尺寸作图和测序验证构建物。将缺乏5’ CCA的相关大肠杆菌IRNA^a作为三串联重复插入磷酸甘油酸酯激酶
1启动子(Ppffil)之后。如前所述(Chen等.Q007) “在酿酒酵母中产生和分析含非天然氨基酸的突变型蛋白质的改进系统” J Mol Biol 371 :112-122)，为促进转录后加工，tRNA侧接酵母抑制型tRNA基因，SUP4的区域。真核下游加工加入tRNA功能所需的5’ CCA。精氨基琥珀酸裂合酶(ARG4)编码区替代起点和磷酸核糖基邻氨基苯甲酸异构酶(TRP)标记得到重组真核ARG4载体(pREAV-P-i-pApaRS) (图lc)。该盒的扩增仅在基因组掺入下可能，因为其缺乏复制的真核起点。采用上述方案，利用感受态G3(例如，感受态GS200-rHSAE37X转化体)作转化以产生GS200_rHSAE37X/ pREAV-P^rpApaRS,除了将回收的细胞接种在缺乏L-组氨酸和精氨酸的RDB平板上。3天后，将菌落挑入96孔2ml板块，如上所述再筛选对0.25mg mPGeneticin 的耐受性。以相同方式产生 GS200-rHSA 野生a /pREAVPadhi-pApaRS (HIS4, ARG4，GenE，muts)以分离菌落 F2。因此，在ARG4编码区线性化PREAV-Padhi-pApaRS，随后转化入GS200_HSAE37X和GS200-HSA野生型分别得到完全原养型巴斯德毕赤酵母GSZOO-HSA./pREAV-P·-pApaRS和GSZOO-HSAltta /pREAV-P^rpApaRS 菌株。(两种菌株均是 HIS4，ARG4, GenE, muts)。巴斯德毕赤酵母的琥珀型抑制所有蛋白质表达实验遵循多拷贝毕赤酵母表达试剂盒(Invitrogen Life,T.，Vol.K1750-01, Edn. F 85 (英杰生命技术公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州92008 ； 2005))中的 muts 方案。从含有 0. 25mg πιΓ1 Geneticin 的平板挑取 GS200_rHSAE37X/ pREAV-P^m-pApaRS 或 GS200-rHSA野麵/pREAV-PADH1-pApaRS 的 14 个克隆，在 IOml 缓冲甘油复合培养基(BMGY) (29. 2°C,300r. p. m.)中生长至接近饱和(OD600 ^ 12-18)。1500g(10 分钟)离心培养液，重悬在含2mM pApa氨基酸的2ml缓冲甲醇复合培养基(BMMY)(伊利诺斯州德斯·普雷恩城SC公司(SynChem, Des Plaines, IL))。继续生长6天，每24小时补充甲醇至0.5%。每M小时加入200 μ 1(10%培养体积)培养基或无菌水以弥补蒸发。每对小时取出50 μ 1培养基，通过3000g离心(5分钟)沉淀细胞。将25 μ 1澄清的培养基加入 12. 5 μ 1 SDS加样缓冲液，95°C加热1分钟，用SDS-PAGE凝胶(英杰公司)作电泳(150V 1 小时)。琥珀型抑制仅发生在用甲醇和pApa氨基酸(pApa AA)培养的含载体酵母中。在甲醇诱导条件下生长2-3天后，通过考马斯染色(40%甲醇，10%乙酸，50%水， 0.1% (w/v)考马斯亮蓝R250(SA公司(Sigma-Aldrich)))在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)凝胶上观察到从GS2OO-HSA野生a /pREAV-P^-pApaRS分离的克隆产生全长rHSAWT(66.5kDa)。6天后rHSA野生a的表达出现峰值。GS200-rHSA野生型/ pREAV-P^rpApaRS的克隆F2_wt显示表达最高，其用于进一步比较。相反，当用甲醇作为主要碳源并添加了 pApa氨基酸培养6天后，GS200-HSAE37X/pREAV-PADH1-pApaRS的克隆未能产生全长rHSAE37pApa。参见，例如图2b ；泳道2是GS200 ；泳道3是GS200_HSAE37X ；泳道4 是 GS200-pREAV-PAQX1-pApaRS ；泳道 5-7 是 GS200-HSAE37X/pREAV_PAQX1-pApaRS ；和泳道 8 是 GS200-HSA 野生型 /pREAV-P^Hi-pApaRS。通过基因组PCR验证所有构建物的基因组整合(图7 ；从一次转化选择4个克隆并标记为 1-4)。预计的 PCR 产物是 rHSA(1851bp)、pApaRS (1317bp)和 tRNA 盒(IlOObp)。 克隆2中缺乏pApaRA扩增可能是技术假象。图加的下部凝胶描述了为检验酿酒酵母 +pPRl-PPGK1-3SUP4-tRNA (泳道 1)和巴斯德毕赤酵母 +pREAV_PADH1-pApaRS (泳道 2)中 tRNACUA 表达而进行的northern印迹结果。对于阴性对照，泳道3和4是分别是缺乏载体的酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母菌株。图加的上部凝胶显示了内源性丝氨酸tRNA的northern印迹， 说明所有样品中相等的miRNA制备。简言之，如下所示进行northern印迹以验证tRNAeuA的转录在各自的表达条件下培养两个巴斯德毕赤酵母克隆，G3-2和GS200及两个酿酒酵母克隆， SCY4-pPRl-PPGK1+2SUP4-tRNA 和 SCY4，收获微小 RNA (miRNA)。将各样品的 2 μ g RNA 加载到两份6% Novex TBE-尿素凝胶(英杰公司)上，180V下电泳1小时。利用)(Cell surelock mini-cell (英杰公司)、0.切TBE缓冲液(英杰公司)和随附的方案将RNA转移至Biodyne B尼龙膜(帕尔生命科学公司(Pall Life Science))。膜与UV Stratalinker 2400 (加利福尼亚州拉霍亚斯特拉塔基因公司)自发交联。用伊利诺斯州洛克福特皮尔斯公司 (Pierce, Rockford, IL)的North2South化学发光杂交和检测试剂盒的方案和试剂进行杂交和检测。一条印迹与tRNASCT的特异性生物素化探针温育；tRNAser cere 1，5’-/5Biosg/ CAT TTC MG ACT GTC GCC TTA ACC ACT CGG CCA T_3，，tRNAser cere 2，5，-/5Biosg/GAA CCA GCG CGG GCA GAG CCC AAC ACA TTT CAA G_3，，tRNAser pich 1，5，-/5Biosg/CTG CAT CCT TCG CCT TAA CCA CTC GGC CAT CGT A_3，，tRNAser pich 2，5，-/5Biosg/ACA CGA GCAGGG TTC GAA CCT GCG CGG GCA GAG C-3’，第二条印迹与tRNAg^W特异性生物素化探针温育tRNA 5，biot，5，-/5Biosg/GGA AGG ATT CGA ACC TTC GAA GTC GAT GAC GG-3’ and tRNA 3，biot，5，_/5Biosg/TCT GCT CCC TTT GGC CGC TCG GGA ACC CCA CC-3，。探针在 55°C温育过夜，与链霉亲和素-辣根过氧化物酶(HRP)偶联物结合，用鲁米诺/增强剂-稳定的过氧化物溶液(皮尔斯公司)检测(图加)。通过条带密度测定tRNA相对量。通过 northern印迹分析，图2的结果表明巴斯德毕赤酵母+pREAV-Padhi-pApaRS中tRNAeuA的转录是酿酒酵母中同一盒的约1. 5倍(图2a)。虽然有这些结果，GS200-HSAE37X/pREAV-PAI)H1-pApaRS菌株中Hk6x-标签的蛋白质印迹未检测到PApaRS (图8)。一次转化检验4个不同的克隆。这些结果表明缺乏琥珀型抑制与pApaRS掺入水平低相关。(如本文它处所述进行蛋白质印迹)。为解决pApaRS表达低，修饰pREAV以便用强效Paqxi启动子驱动pApaRS表达，通过给PApaRS基因的5’端加入Kozak共有序列(ACCATGG)进一步增强pApaRS 表达(Kozak(1990) “下游二级结构有助于真核核糖体识别起始密码子(Downstream secondary structure facilitates recognition of initiator codons by eukaryotic ribosomes). "Proc Natl Acad Sci U S A 87 :8301-8305)。最终构建物pREAV_PAQX1-pApaRS 中，ADHl 终止子(Tadhi)也被 AOXl 终止子(Taqxi)替代(图 Id)。为产生 pREAV-PAQX1-pApaRS， 从pPIC3. 5k获得AOXl启动子和终止子序列。用以下引物扩增pApaRS =KETO-Koz-F, 5，-TTC TGA GAA TTC ACC ATG GCA AGC AGT AAC TTG ATT AAA CAA TTG C_3 IPKetoRS R 6xHis，5， -TAG GCT CGG CCG CTT AGT GGT GGT GGT GGT GGT GTT TCC AGC AAA TCA GAC AGT AAT TCT TTT TAC-3，，用 EcoRI 和 NotI (NEB)消化，连接入类似消化的 pPIC3. 5k 以产生 pPIC3. 5k-pApaRS。用以下引物从 pPIC3. 5k_pApaRS 扩增 Paqxi-pApaRS-TArai 编码区 pPIC-keto A0X5 F，5’-ATC GTA CTT MG AGA TCT AAC ATC CM AGA CGA MG GTT GAA TGA AAC-3’ 和 pPIC-keto AOXTT R，5，-TGC ACA GGC GCG CCA AGC TTG CAC AAA CGA ACT TCT CAC TTA ATC 17(-3，，用48(；1和4打11(陬8)消化，连接入类似消化的 pREAV-P^m-pApaRS PCR产物以产生pREAV-PAOT1-pApaRS。如上所述，通过尺寸作图和测序验证构建物。通过将pREAV-PA。xl-pApaRS 转化入 GS2OO 来构建 GS200-pREAV_PA。xl-pApaRS (his4, ARG4，GenE, muts)菌株，但接种在补充了 ^ig ml—1组氨酸的RDB平板上，不进一步筛选 Geneticin 耐受性。采用上述方案，用感受态G3 (例如，GS200_rHSAE37X)转化以产生 GS200-rHSAE37X/pREAV-PAoxl-pApaRS(HIS4, ARG4，GenE, muts)，除了将回收的细胞接种在缺乏L-组氨酸(His)和Arg的RDB平板上。该转化的克隆仅在甲醇和pApa氨基酸存在下产生全长rHSAE37pApa，其水平约为10-20%相同克隆含有rHSAStt3^甲醇诱导后2_3天，通过SDS-PAGE观察蛋白质，每M小时补充甲醇至0.5%，表达6天后达到峰值(图2b)。缺乏pREAV盒、pPIC3. 5k盒、甲醇补充或pApa氨基酸的酵母未能产生可由考马斯染色检测的蛋白质。没有PApa氨基酸存在下蛋白质不表达表明pApaRS/tRNA ^ja配对与内源性氨酰化元件之间不发生交叉氨酰化。胰蛋白酶消化物，LC-MS/MS证实pApa位点特异性地掺入 rHSAE37X(图2c)。pApa(图2c中以Ε*表示)掺入成熟rHSAE37pApa的残基37处。观察到的片段离子系列无疑支持这一取代。为表达足够的rHSAE37pApa蛋白以便进行LC-MS/MS分析，改进上述蛋白质表达分析条件。简言之，将IL BMGY接种于YPD配制的20ml饱和的G3-2培养液，培养至(约M小时，
4929. 2°C,300r. p.m.)至 OD600 12-18。以 1500g 离心培养液，重悬在补加了 10%BMMY*2mM pApa的200ml缓冲极限甲醇(BMM)。培养6天后(29. 2°C，300r. p. m.甲醇和体积补加)，以 3000g离心培养液，弃去细胞，将上清液流过马萨诸塞州比尔里卡密理博公司(Milipore， Billerica,MA)的0. 22 μ m滤器。4°C加入NH4SO4并缓慢搅拌至50%饱和(58. 2g)进行硫酸铵(NH4SO)沉淀上清液，20，OOOg离心20分钟，再加入NH4SO4至75%饱和(31. 8g)，20，OOOg 离心20分钟。第二次沉淀中含有rHSAE37pApa，将其重悬在FPLC缓冲液A(25mM Tris-HCl, 25mM氯化钠，ImM EDTA，Ix蛋白酶抑制剂混合物(瑞士巴塞尔的罗氏公司((Roche，Basel， CH)))，pH = 8. 5)中。利用 AKTA 纯化仪 FPLC (AB 公司(Amersham Biosciences)，皮斯卡塔韦，新泽西州)，MonoQ 5/5柱(GE保健公司(GE Healthcare))纯化(20-35%缓冲液B(缓冲液A+1M NaCl)洗脱)重新溶解的蛋白质。用SDS-PAGE凝胶分析诸馏分，合并，用30MWC0 透析盒(皮尔斯公司)以PBS透析，利用AKTA纯化仪FPLC，Superdex 20010/300GL (GE保健公司)纯化(14分钟后洗脱，PBS, 0. 5毫升/分钟)。SDS-PAGE凝胶分析诸馏分，合并， 用 Dynamax HPLC (蓝尼公司(Rainin)，奥克兰)，C8Vydac HPLC 柱(300mm，200 A，5 μ m，格雷丝公司(Grace))纯化(水配制的40-46% MeCN,0. 1% TFA洗脱)。SDS-PAGE凝胶分析诸馏分，含rHSAE37pApa&组分快速冷冻并冻干成白色粉末。以相似方式纯化F2-野生型(wt)
WrHSA野生型。还原条件下(IOmM TCEP，IM盐酸胍，IOOmM盐酸三乙醇胺，pH = 7. 8)，用胰蛋白酶消化纯化的rHSAE37X过夜，以便进行胰蛋白酶消化和纳米-RP LC-MS/MS。利用S印-Pak， C18(沃特斯公司(Waters)，米尔福德，马萨诸塞州)，通过反相固相提取来纯化消化物并冻干。冻干的肽与过氧甲酸(9份浓甲酸+1份30% H2O2)在冰上温育1小时将半胱氨酸氧化成磺基丙氨酸，将甲硫氨酸氧化成甲硫氨酸砜(Matthiesen等.Q004) “利用过氧甲酸氧化扩大胰蛋白酶肽的质量分布(Use of performic acid oxidation to expand the mass distribution of tryptic peptides). "Analytical chemistry 76,6848-6852)。力口入过量的巯基乙醇并用水作20倍稀释来猝灭反应。用装配了纽约州罗彻斯特热电公司的 LTQ Orbitrap 杂交质i普仪(LTQ Orbitrap hybrid mass spectrometer, ThermoElectron, Rochester, NY)的加利福尼亚州圣克拉拉安捷仑技术公司(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)的HPLC系统进行纳米-RP LC-MS/MS。将胰蛋白酶消化物以约2微升/分钟的流速加载到通气柱设置的预柱上(4cm, 100 μ m i.d. ,5ym, Monitor C18，伊利诺斯州芝力口哥柱工程公司(Column Engineering)) (Licklider等.Q002) “具有通气柱的纳米级毛细 iW^ffifeie" ΦΚΜ θ^ ^(Automation of nanoscale microcapillary liquid chromatography-tandem mass spectrometry with a vented column) ·，，Analytical chemistry 74 :3076-3083)。10分钟的加载/洗涤期间后，将预柱在线切换为分析柱(10cm， 75 μ m i.d. ,5ym C18)开始梯度洗脱。层析曲线是100 %溶剂A (0. 1 %水性乙酸)到 50 %溶剂B (乙腈配制的0. 1 %乙酸)，40分钟，约100纳升/分钟。按照前10方案(top IOscheme)进行数据依赖性MS/MS采集，其中质谱仪编程为首先记录高分辨率Orbitrap扫描(m/z500-2，000)，然后是10次数据-依赖性MS/MS扫描(相对碰撞能量=35% ;3Da分离窗)。利用MASCOT (矩阵科学公司(Matrixscience)，伦敦，英国)检索SwissProt 51.6 数据库的原始数据进行蛋白质鉴定，其中PApa作为变量修饰(variable modification) 0优化表达
为优化rHSAE37pApa表达，通过将pPIC3. 5k_rHSAE37X插入AOXl基因座的5，区 (这样保留了 AOXl 基因的完整性)来产生 GS200-rHSAE37X/pREAV-PAoxl-pApaRS (HIS4， ARG4，GenE)快速甲醇利用(Mut+)突变株。以此方式插入基因组可导致多聚化，从而产生Gen 耐受性标记和感兴趣基因的串联拷贝(Cereghino等.Q000) “甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中的异源蛋白质表达(Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris) ·，，FEMS Microbiol Rev 24:45-66)。为产生 GS200-rHSAE37X/pREAV-PAoxl-pApaRS (HIS4, ARG4, GenE, Mut+)，用 SacI 或 Sail (NEB)线性化 20 μ gpPIC3. 5k-rHSAE37X并转化入新鲜的感受态GS200，如前所述。用Iml冷的IM山梨醇回收细胞，接种在补加了 O.^ig ml—1精氨酸的RDB平板上。将菌落挑入含Iml YPD的^iil 96 孔板块，培养至饱和(29. 2 V，300r. p. m.)，作1 100稀释，将等份试样接种于含有0_3. Omg πιΓ1 Geneticin 的平板上。将在最高l.Omg πιΓ1 Geneticin 下存活的克隆1D12制成感受态，如前所述用pREAV-PA(m-pApaRS转化，接种在缺乏Arg和His的RDB平板上。将菌落挑入含Iml 96孔板块，培养至饱和，作1 100稀释，在Geneticin l.Omg ml—1平板上再筛选。 挑取14个存活的克隆，检验有pApa氨基酸和甲醇存在下的rHSAE37pApa表达。采用上述muts 方案。克隆K5显示蛋白质表达最高，将其在测试表达中与G3-2比较(图9)。用SDS-PAGE凝胶分析 GS200-rHSAE37X/pREAV-PAQX1-pApaRS (mut+)培养液(图 9，泳道 1)和 GS200_rHSAE37X/ pREAV-PA0X1-pApaRS(muts)培养液(图9，泳道2)的25 μ 1澄清培养液，作考马斯染色。得到的Κ5克隆显示耐受最高1. 0mg/ml的Geneticin ,而上述muts克隆G3-2在0. 25mg/ml Geneticin 以上死亡，这与多拷贝表达盒的掺入一致(Cereghino等.Q000) “甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中的异源蛋白质表达(Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris). 'T7EMS Microbiol Rev 24 :45-66 ；英杰生命技术公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州92008 ；2005)。分析有甲醇和pApa氨基酸存在下分离克隆的全长rHSAE37pApa表达显示产生的蛋白质是相应Hiuts同等物的约1. 5-2. 0倍(图9)。 通过条带密度测定蛋白质的相对量。为进一步增加rHSAE37pApa的产量，比较6个不同启动子(包括PAm)驱动pREAV载体中pApaRS转录的能力。检验转录物mRNA水平、pApaRS蛋白质水平和rHSAE37pApa总产量。 根据与甲醇诱导的相容性选择衍生自酵母菌，GTP结合蛋白I(YPTl) Gears等.(1998) “巴斯德毕赤酵母中组成型和调控基因表达的一套通用载体(A versatile set of vectors for constitutive and regulated gene expression in Pichia pastoris). "Yeast 14 :783-790 ;Segev等.(1988) “酵母菌GTP-结合YPTl蛋白和哺乳动物对等物与分泌机制相关(The yeast GTP-binding YPTl protein and a mammalian counterpart are associated with the secretion machinery). "Cell 52 :915-924)禾口甘油酸一3-憐酸脱氢酶(GAP) (Cos等.Q006) “甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中在不同启动子控制下异源蛋白产生的操作策略、监测和控制综述(Operational strategies, monitoring and control of heterologous protein production in the methylotrophic yeast Pichia pastoris under different promoters -.a review). "Microb Cell Fact 5 17 ；Waterham 等.(1997) “巴斯德毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的分离及其启动子的调节和使用(Isolation of the Pichia pastoris glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene and regulation and use of its promoter). "Gene 186 :37-44)的胃禾中启云力子；衍生自醇氧化酶II (A0X2) (Ohi等.(1994) “巴斯德毕赤酵母A0X2基因中甲醇调节的 JH禾口负)1质式作用7Π件(The positive and negative cis-acting elements for methanol regulation in the Pichia pastoris A0X2 gene). "Mol Gen Genet 243 :489-499) > ^ 醛脱氢酶I (FLDl) (Cos等.Q006) “甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中在不同启动子控制下异源蛋白产生的操作策略、监测和控制综述”Microb Cell Fact 5 :17)和异柠檬酸裂合酶I (ICLl) (Cos等.Q006) “甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中在不同启动子控制下异源蛋白产生的操作策略、监测和控制综述”Microb Cell Fact 5 :17)的三种甲醇诱导型启动子。利用截短的Ρωχ2，其通过删除两个阻遏结合序列之一而增强该启动子(Ohi 等.(1994) “巴斯德毕赤酵母Α0Χ2基因中甲醇调节的正和负顺式作用元件.”Mol Gen Genet 243:489-499)。在合成酶的过度产生对于酵母菌有毒性，或者隔离细胞能量使之不能产生rHSAE37X的情况中可利用较弱的Pypti和Pmp启动子Gears等.(1998) “巴斯德毕赤酵母中组成型和调控基因表达的一套通用载体.”kast 14 :783-790)。通过PCR扩增巴斯德毕赤酵母基因组DNA的所有启动子连同它们的5’非翻译区 (图10)。分别利用以下引物，通过PCR扩增基因组DNA(巴斯德毕赤酵母GS200)的Paqx2、 Ργρτι、Picli、Pfldi 和 Pgap :PA0X2 F，5，-GTA TCG CTT AAG TCC AAG ATA GGC TAT TTT TGT CGC ATA AAT TTT TGT C-3’ 和 ΡΑ0Χ2 R，5，-CGT TAG CCA TGG TTT TCT CAG TTG ATT TGT TTG TGG GGA TTT AGT AAG TCG-3，；PYPTl F,5' -GTA TCG CTT AAG CAT ATG ATG AGT CAC AAT CTG CTT CCA CAG ACG AG-3，和 PYPTl R，5，-CGT TAG CCA TGG GAC TGC TAT TAT CTC TGT GTG TAT GTG TGT ATT GGG C_3’ ；PICLl F，5’ -GTA TCG CTT AAG GAA TTC GGA CAA ATG TGC TGT TCC GGT AGC TTG—3，禾口 PICLl R，5’ -CGT TAG CCA TGG TCT TGA TAT ACT TGA TAC TGT GTT CTT TGA ATT GAA AG-3’ ；PFLDl F，5’ -GTA TCG CTT AAG GCA TGC AGG AAT CTC TGG CAC GGT GCT AAT GG-3，和 PFLDl R，5，-CGT TAG CCA TGG TGT GAA TAT CAA GAA TTG TAT GAA CAA GCA AAG TTG G_3’ ；PGAPl F，5，-GTA TCG CTT AAG GGA TCC TTT TTT GTA GAA ATG TCT TGG TGT CCT CGT C-3'禾P PGAPl R,5' -CGT TAG CCA TGG TGT GTT TTG ATA GTT GTT CAA TTG ATT GAA ATA GGG AC-3，。图10显示溴化乙锭染色的凝胶与Ikb+ 标准样侧接PCR产物。PCR产物的预计长度为:PA0X2 342bp, PYPTl 508bp, PICLl 683bp, PFLDl 597bp和PGAP 493bp。用Af III和NcoI (NEB)消化PCR扩增片段，并连接入类似消化的pREAV-PAQX1-pApaRS(通过琼脂糖凝胶纯化除去P_AQX2编码区后)以产生pREAV-P启动子-pApaRSo序列证实后，将各启动子克隆入pApaRS的pREAV载体5’(端)以替代PAQX1，并将其转化入以前产生的Mut+GS200-HSAE37X。终止子保留Taqxi。图3a提供pREAV-PPM。tCT-pApaRS 的线性图谱，说明启动子区域可变。PCR扩增基因组DNA的启动子(如结果示于图7的实验)。用AatII线性化质粒(如同以前描述的构建物pREAV-PAQX1-pApaRS)，转化入新鲜的感受态GS200-rHSAE37X(克隆IDl2)，接种于如前所述缺乏Arg和His的RDB平板以产生 GS200-rHSAE37X/pREAV-PPromoter-pApaRS (HIS4, ARG4, GenE, Mut+)。在 0· 75 和 1. Omg πιΓ1 下筛选存活克隆的Geneticin 耐受性。将对应于各启动子的48个克隆挑取入含BMGY的Iml 96 孔板块，培养至饱和(29. 2°C, 24小时，300r. p. m.)。1500g离心饱和培养液10分钟，将细胞重悬在 200 μ L BMMY+2mM pApa 氨基酸。6 天后( . 2°C，300r. p. m.，含补样)，3000g 离心澄清培养液10分钟，利用96孔点样工具将1-2 μ L澄清的培养液点样在0. 45微米硝酸纤维素膜(BR公司)。采用标准蛋白质印迹技术(Burnette (1981) “蛋白质印迹将蛋白质从十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶转移至未修饰的硝酸纤维素并用抗体和放射性碘标记白勺AM白白勺X身寸才目(Western blotting :electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate—polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A). "Anal Biochem 112 :195-203)，用HSA抗体[1A9]HRP偶联物(阿比康公司(Abeam))探测膜，用 ECL HRP化学发光检测试剂和方案(GE保健公司)检测。选择对应于各启动子的两个表达最高的克隆(A0X2 -M 禾Π Β7 ；YPTl =Dll 禾Π Β7 ；ICLl :Ε5 禾Π Η3 ；FLDl =Ell 禾Π F3 ；GAP :B7 禾Π BlO ；和AOXl :Ε3和Ε7)作平行测试表达(图3和4)。甲醇诱导6天后，通过northern和蛋白质印迹监测P-^^^-pApaRS表达水平并与 PA0X1-pApaRS比较(图北)。由于巴斯德毕赤酵母固有的表达差异，选择两个克隆作蛋白质印迹分析。用甲醇作为主要碳源培养PREAV-Pjazw-PAPaRS每次转化GS200_rHSAE37X的两个克隆6天，裂解，用SDS-PAGE凝胶分离(图北，上部凝胶)。考马斯染色凝胶以验证等量加载。通过蛋白质印迹分析裂解物的pApaRs-Hi^^图北，下部凝胶)。为进行蛋白质印迹，在测试表达条件下培养克隆A0X2 :A6和B7 ；YPTl =Dll和B7 ； ICLl :E5 禾口 H3 ；FLDl =Ell 禾口 F3 ；GAP :B7 禾口 BlO ；禾口 AOXl :E3 禾口 E7，沉淀(3000g, 10 分 中)， 用2ml ^astBuster(新泽西州吉布斯城的诺瓦金公司(Novagen，Gibbstown, NJ))+IOmM β-巯基乙醇和完全蛋白酶抑制剂混合片剂(罗氏)裂解。以20，OOOg澄清样品，将15μ1 裂解液在4-20% SDS-PAGE凝胶上电泳(1 15小时，150V)。利用转印迹SD半干转移室 (BR公司)，在iTobin转移缓冲液(24mM tris碱，192mM甘氨酸，20 %乙醇)(2小时，20V， IOOmAmp)中将蛋白质转移至0. 45微米硝酸纤维素膜(BR公司)。考马斯染色凝胶上残留的蛋白质(图北，上图)以确保等量加载。采用标准蛋白质印迹技术(Burnette (1981)“蛋白质印迹将蛋白质从十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶转移至未修饰的硝酸纤维素并用抗体和放射性碘标记的A蛋白的X射线照相检测· "Anal Biochem 112 :195-203)，用抗 His6x-HRP偶联抗体(SA公司)印迹膜，用ECL (GE保健公司)HRP化学发光检测试剂和方案检测(图北，下图)。通过条带密度测定相对表达率。在mRNA水平，Pfldi驱动pApaRS转录比PAm高4倍，产生的pApaRS蛋白多5倍。 PGAP> Pypti、Preu和均显示PApaRS表达低于Pfuu。与该结果一致的是，PFLD1-pApa的总琥珀型抑制最高，其中通过检测进入培养基的rHSAE37pApa表达(图4)。如图4所示，各启动子系统的两个克隆用甲醇作为主要碳源和PApa氨基酸独立培养6天。用变性SDS-PAGE凝胶对25 μ 1澄清的培养液作电泳，考马斯染色。通过条带密度和BSA对照计算rHSAStta (泳道 15)为351.6mg Γ1。根据密度，Pfldi (取泳道9和10的平均值)表达最多43%的蛋白质或 151. 2mg Γ1。最高产量是> l50mg/l或rHSA野生型的约43% (352mg/l)(图11)。图11是图 4的柱状图，显示rHSAE37pApa中琥珀型抑制与启动子驱动pApaRS产生的函数关系。根据图4 所示SDS-PAGE凝胶上考马斯条带密度测定蛋白质产量。如下所述定量测定图4中的rHSA Stta蛋白对25 μ 1 BSA标准品或测试蛋白质表达的未纯化THSAa^a培养液进行SDS-PAGE 凝胶电泳(参见图12)。泳道7是IflSAltts测试蛋白质表达培养液的1 1稀释液。对BSA 标准品条带密度(泳道2-5)作图，并作线性拟合。！"HSAltts条带( 泳道7和泳道8)的密度平均为83.33或351.55!^/!111。非天然蛋白质的产量(其它图中的rHSAE37X)测定为相同rHSAs生^样品的百分比。通过northern印迹分析在图北中产生最多蛋白质的克隆的pApaRSmRNA转录(图 3c,下部凝胶)。为进行northern印迹，在测试表达条件下培养表达最高的克隆A0X2，B7 ； YPTl，Dll ；ICL1,H3 ；FLDl，Ell ；GAP，B7 ；和 A0X1，E36 天。收集 3x IO8 个细胞(2. 5ml, OD600 =1.0)，通过RiboPure-酵母试剂盒(安变公司(Ambion))试剂和方法分离总RNA。将 13yg各RNA样品加载到2%甲醛凝胶0%琼脂糖，20mM MOPS，8mM乙酸钠，2. 2mM甲醛，pH =7. 0)上。加载前，将3体积的NorthernMax甲醛加载染料(安变公司)与1体积RNA混合，加热至65°C，15分钟，先在冰上冷却5分钟，再上样。对凝胶进行电泳(50V，2小时)，通过18S和^SrRNA的溴化乙啶染色证实等量加载和RNA完整性(图3c，上图)。通过标准印迹设备，在IOx SSC缓冲液(1.5M氯化钠，0. 15M柠檬酸钠pH = 7.0)中将RNA吸到Biodyne B尼龙膜(帕尔生命科学公司)上。用h SSC缓冲液清洗膜两次，干燥并用斯特拉塔基因公司的UV Stratalinker MOO自交联。采用皮尔斯公司的North2South化学发光杂交和检测试剂盒的方案和试剂进行杂交和检测。简言之，55°C，温育400-500 μ g生物素化探针过夜ketoRS3 生物素 5，/5Biosg/TGA GAC GCT GCT TAA CCG CTT C-3，和 ketoRS4 生物素 5，/5Biosg/TAA AGA AGT ATT CAG GAT CGG ACT G_3，，结合链霉亲和素-HRP 偶联物，用鲁米诺/增强剂-稳定的过氧化物溶液(皮尔斯公司)检测(图3c，下图)。通过条带密度测定mRNA相对滴度。肟连接于rHSAE37DADa为证明这种修饰的rHSA能用作生物活性肽的载体，在rHSAE37pApa的唯一酮侧链和抗血管生成性肽ABT-510之间进行肟连接(图5)。该连接反应的示意图见图fe。ABT-510 肽具有ε- -(氨基氧基)乙酰基)_L-赖氨酸作为第六残基。如下文进一步描述的， 37°C下温育75μΜ rHSAE37pApa (图5a，上部反应)与2.25mM肽过夜形成肟连接键。相同条件下用rHSA(图5a，下部反应)没有反应发生。该血小板反应蛋白(TSP-I)裂解素1型重复模拟物在人中显示强效的抗肿瘤活性，但通过静脉内给予时会被肾脏快速清除(Hoekstra等.Q005) “晚期癌症患者中血小板反应蛋白模拟血管生成抑制剂 ABT-510的I期安全、药代动力学和药效学研究(Phase I safety, pharmacokinetic, and pharmacodynamic study of the thrombospondin-l-mimetic angiogenesis inhibitor ABT-510 in patients with advanced cancer)·，，J Clin Oncol 23 :5188-5197 ；Yang 等.Q007) “联用血小板反应蛋白-1肽ABT-510与丙戊酸是成神经细胞瘤的有效抗血管生成策略(Thrombospondin-1 peptide ABT-510 combined with valproic acid is an effective anti-angiogenesis strategy in neuroblastoma). "Cancer Res 67 1716-1724 ；Reiher等.Q002) “血小板反应蛋白_1肽模拟物的全身性处理抑制肿瘤生长 (Inhibition of tumor growth by systemic treatment with thrombospondin-1 peptide mimetics). "Int J Cancer 98 :682-689)。合成以独特 ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)_L_ 赖氨酸UAA替代第6L-正缬氨酸残基的9氨基酸肽模拟物(安娜斯派克公司(Anaspec)，圣何塞,加利福尼亚州)。该肽的序列为Ac-Sar-Gly-Val-D-aloIle-Thr-Lys (Aoa)-Ile-Arg-P ro-NEt MW= 1097. 3Da)。根据TSP-I的已知结构-活性关系，在该位置进行修饰估计不会显著改变生物学活性(Haviv等.(2005)“血管生成和肿瘤生长的血小板反应蛋白-1模拟肽抑制剂药代动力学和生物学活性的设计、合成和优化(Thrombospondin-1 mimetic peptide
54inhibitors of angiogenesis and tumor growth :design, synthesis,and optimization of pharmacokinetics and biological activities). ”J Med Chem 48 :2838-2846)。为进行肟连接，将2. 25mM(0. 5mg)肽加入200 μ 1肟连接缓冲液(1. 5Μ氯化钠，500mM乙酸钠，pH =4.4)中的75 μ M rHSAE37pApa或rHSAgj生型(L0mg)，3rC温育过夜。pH<5时，氨基氧基与 PApa的酮基经历选择性肟连接从而将ABT-510肽共价连接于rHSAE37pApa的残基37 (图5a， 上部反应)。用 Dynamax HPLC (蓝尼公司)，C8 Vydac HPLC 柱(300mm，200 Α，5μπι，格雷丝公司)纯化(水配制的40-46%乙腈洗脱，0. 1% )反应体系。收集诸馏分，合并，通过考马斯染色SDS-PAGE凝胶分析。利用装有芥子酸基质的线性MALDI-T0F MS Biflex III (马萨诸塞州比尔里卡BD公司(Burker Daltonics))仪器进行基质辅助激光解吸电离(MALDI) 质谱法来检测完整蛋白质的质量和验证该肽衍生rHSAE37pApa的程度(图恥)。用该蛋白质处理前后！"HSAltts的质量改变可忽略，表明在相同条件下用氨基-氧基修饰的ABT-510肽处理IflSAltts (残基37处的谷氨酸)时，MALDI质谱法未观察到偶联。利用rHSA野生a +肽禾Π rHSAE37pApa+肽之间的质量差异由于E37pApa突变而低 60Da(905Da减去60Da = 845Da))测定连接效率(约77% )。以前的偶联方案利用苯胺催化剂进行有效连接(Dirksen等.(2006) “肟连接的亲核催化(Nucleophilic catalysis of oxime ligation). ”Angew Chem Int Ed Engl 45 :7581-7584 ;Dirksen 等· (2006) “腙形成和转移的亲核催化涉及动态共价化学反应(Nucleophilic catalysis of hydrazone formation and transimination !implications for dynamic covalent chemistry). "J Am Chem Soc 128 :15602-15603)；然而，在不利用苯胺而利用75 μ M rHSAE37pApa和三倍过量肽的过夜反应中，肟偶联于rHSAE37pApa的产率约为77%。将8种UAA加入遗传库为说明该新产生的重组表达系统的通用性，将酿酒酵母方法开发的非天然aaRS 插入PREAV-Pfuu。图6a提供含大肠杆菌酪氨酰-RS基因(aal )和酪氨酰抑制型tRNA盒 (tRNACUA)的优化PREAV-Pfldi载体的示意图。将对-苯甲酰苯丙氨酸(pBpa，光交联剂，图 6b，结构 3，Chin 等· (2003) “扩增的真核遗传密码(An expanded eukaryotic genetic code). "Science 301 :964-967)、对-叠氮基苯丙氨酸(piVzapa，光交联剂，化学反应性， 图6b，结构4，Deiters等.“将具有新型反应性的氨基酸加入酿酒酵母的遗传密码 (Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharomyces cerevisiae). "J Am Chem Soc 125 :11782-11783)、对-(炔丙基氧基)苯丙氨酸(pPpa， 化学反应性，图6b，结构5，Deiters等.Q003) “将具有新型反应性的氨基酸加入酿酒酵母的遗传密码” J Am Chem Soc 125 :11782-11783)、对-甲氧基苯丙氨酸(pMpa，结构/功能探针，图6b，结构6，Chin等.(2003) “扩增的真核遗传密码."Science 301:964-967) 和对-碘代苯丙氨酸(plpa，重原子，图6b，结构7，Chin等.Q003) “扩增的真核遗传密码· "Science 301 :964-967))的特异性aaRS均插入优化的pREAV-PFLD1载体中Pfldi之后 (图6a和6b)。为比较，野生型大肠杆菌酪氨酰-RS (wt，图6b，结构幻也插入新的表达载体。利用以下引物，通过PCR扩增酪氨酸(Wt)、pBpa、pAzapa、pPpa、pMp￡^npIpa的特异性非天然 aaRS =KETO-Koz-F 和 KetoRS R 6xHis (上述的)，用 NcoI 和 EagI (NEB)消化，连接入类似消化的pREAV-PFLD1-pApaRS (通过琼脂糖凝胶纯化除去pApaRS区域后)。序列验证后，将质粒转化入前述GS200-rHSAE37X克隆1D12以产生GS200-rHSAE37X/pREAV-PFII)1-(合成酶_) (HIS4，ARG4，GenK，Mut+)。每次转化选择12个克隆，通过前述96孔形式的斑点印迹筛选。选择每次的最佳生产克隆(tyr，A9 ；pBpa,B7 ；pAzapa C9 ；pPpa，D6 ；pMpa，E6 ；和 plpa， F6)，并在上述rHSA表达实验中与FLDl (即，具有pREAV-PFU)1-pApaRS的菌株)Ell比较以测定在有(+)和没有(_)非天然氨基酸1，3-7及其相应aaRS存在下它们抑制rHSAE37X* 37位的琥珀型突变的能力，其中X指定为非天然氨基酸。这些实验的结果见图6c。25μ1 未纯化的澄清培养液作SDS-PAGE凝胶电泳，用考马斯染色。泳道2是用野生型(wt)酪氨酰-RS的rHSAE37Y表达。泳道15是rHSA野生型的表达。pApa和pAzapa突变体的抑制率相似 (rHSA野生型产率的40-45% )；除plpa外，所有其它突变体表达>20 %的rHSAg^a产率(图 6c)。通过条带密度测定相对蛋白质产量。没有相关氨基酸存在下未观察到蛋白质表达，证明该新系统的高度正交性。最近，制备了第二正交大肠杆菌亮氨酰-衍生RS/tRNA。UA配对(称为LeuRS的 aaRS)以便在酿酒酵母中将其它非天然氨基酸掺入蛋白质(Lemke等.Q007) “遗传编码的光束缚氨基酸控制蛋白质磷酸化(Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid)·，，Nat Chem Biol 3 :769-772 ; Summerer 等·(2006) “遗传编码的荧光氨基酸(A genetically encoded fluorescent amino acid). "Proc Natl Acad Sci U S A 103 :9785-9789)。为在新巴斯德毕赤酵母表达系统中容纳衍生自该正交配对的非天然LeuRS，修饰PREAV-Pfldi质粒的tRNA区域。如前所述，切除 Ppgki下游已有的tRNA:盒，替换以对应于缺乏5’CCA并由SUP4区段隔开的tRNA^^三串联重复的编码区，从而产生pREAVlw-PFU)1。将4，5-二甲氧基-2-硝基苄基丝氨酸(DMNB-S， 光束缚丝氨酸，图6e，结构8，Lemke等.Q007) “遗传编码的光束缚氨基酸控制蛋白质磷酸化· "Nat Chem Biol 3 :769-772)和2-氨基-3-(5-( 二甲基氨基)萘-1磺酰胺)丙酸 (丹酰基丙氨酸，丹酰基荧光团，图6e，结构9，SUmmerer等.Q006) “遗传编码的荧光氨基酸.”Proc Natl Acad Sci U S A 103:9785-9789)的特异性 LeuRS 突变体插入 PFU)1 后产生 pREAVleu-PFU)1-LeuRS (图 6d 禾口 6f)。图6d提供含大肠杆菌亮氨酰-RS基因和亮氨酰抑制型tRNA序列组件 (1 eu-tRNA(CUA))的优化 pREAVleu_PFLD1 载体的示意图。为产生 pREAVleu_PFLD1，合成(DNA 2.0，门洛帕克，加利福尼亚州)对应于缺乏5’ CCA并由SUP4区段隔开的tRNA思三串联重复的片段，并利用以下引物作PCR扩增Leu tRNA F, 5' -AAG GAA GCT AGC CTC TTT TTC AAT TGT ATA TGT G-3'和 Leu tRNA R,5' -CGT ACA CGC GTC TGT ACA GAA AAA AAA GAA AAA TTT G_3，。用 NheI 和 MluI (NEB)消化得到的 643bp 产物，连接入类似消化的pREAV-PFU)1-pApaRS (通过琼脂糖凝胶纯化除去酪氨酰tRNA后)以产生 pREAVleu-PFLD1-pApaRS0利用以下引物扩增DMNB-S和丹酰基非天然氨基酸的特异性aaRS LeuRS F，5，-ATT CAC ACC ATG GAA GAG CAA TAC CGC CCG GAA GAG-3 IPLeuRS R，5，-TTA ATT CGC GGC CGC TTA GCC MC GAC CAG ATT GAG GAG TTT ACC TG-3，，用NcoI和NotI(NEB) 消化，连接入类似消化的pREAVleu-PFU)1-pApaRS (通过琼脂糖凝胶纯化除去pApaRS编码区后)以产生PREAVleu-Pmn-DMNB-S或PREAV1w-Pfldi-丹酰基(图6d)。序列证实后，将质粒转化入GS200-rHSAE37X(克隆1D12)并以所述的96孔斑点印迹形式筛选。克隆A :A5 (DMNB-S) 和B :G12(丹酰基)鉴定为缓冲液极限甲醇(BMM)培养基中诱导后，在测试表达条件下生长 3天的成功生产克隆。为进行比较，!·把々野生型在8匪￥中表达3天(图6f)。图6f提供为检验有(+)和没有(_)非天然氨基酸存在下rHSAE3ra的表达所进行的实验结果。用SDS-PAGE 凝胶分析25 μ 1未纯化的澄清培养液中的各蛋白质表达，作考马斯染色。泳道4也是3天
B rHSA 野生型最近证明DMNB-S的特异性LeuRS突变体接受DMNB-S的半胱氨酸类似物 (DMNB-C)，该类似物因易于合成而用于这些实验。虽然没有相关氨基酸存在下产生少量的全长蛋白质(对于DMNB-S，背景是35% rHSAE37DMNB_s，对于丹酰基是6% rHSAE37ffgt s)，胰蛋白酶消化物的LC-MS/MS证实有相应非天然氨基酸存在下该系统的高保真度 (图13)。如图13所示，图6f的泳道2的rHSAE37__c蛋白进行胰蛋白酶消化，然后进行上述LC-MS/MS，除了消化物中胰凝乳蛋白酶替代胰蛋白酶。上幅色谱图(黑色)显示对.45-60.05分钟之间冗-1^肩5运行的总离子计数(TIC)。第三和第四色谱图分别是2+和3+荷电物质的离子提取，对应于胰凝乳蛋白酶肽，)(DHVKLVNEVTEF，其中X(rHSA 的第37位残基)是DMNB-C(峰下总面积，“MA” = 224582204)。第五和第六色谱图分别是2+和3+荷电物质的离子提取，对应于胰凝乳蛋白酶肽，)(DHVKLVNEVTEF，其中X是亮氨酸的异亮氨酸(峰下总面积“MA” = 20029397)。如下所示进行计算E37DMNB_C百分比=224582204/(224582204+20029397) *100 = 91. 8 % 和 E37L 百分比=20029397/ (224582204+20029397)^100 = 8. 2%。未检测到可察觉量的对应于X处其它天然氨基酸掺入的离子种类。实际上，存在氨酰化抑制型tRNA常抑制无义密码子的非特异性连读。表达3天后，rHSAE37__c的抑制率是rHSAgj生型产率的约37%，rHSAE37ffgt基的抑制率是rHSA野生型产率的 23%。在酿酒酵母中优化含有非天然氨基酸蛋白质表达的早先尝试在模型系统中获得的最高产量是8-15mg/l，比本发明开发的巴斯德毕赤酵母中显示的产量低多于一个的数量级。Wang实验室的工作最近证明酵母菌中无义介导mRNA降解(NMD)途径的敲减可将蛋白质表达最高增加2倍(Wang和Wang(2008) “酵母菌中非天然氨基酸有效掺入的新方法(New methods enabling efficient incorporation of unnatural amino acids in yeast). ” J Am Chem Soc 130 :6066-6067)。联用衍生自 SNR52 的启动子来驱动 tRNAcua 转录，它们能达到的突变型蛋白质产量比以前在酿酒酵母中产生的(约为15mg/l)高300-倍 (Wang和Wang (2008) “酵母菌中非天然氨基酸有效掺入的新方法.” J Am Chem Soc 130 6066-6067)。因此，敲除NMD途径的UPFl基因和利用SNR52-tRNACUA启动子系统还可增加巴斯德毕赤酵母中的产量。此外，Kobayashi实验室的工作证明，当以分批补料发酵而非标准摇瓶表达时，巴斯德毕赤酵母的rHSAg^s产量要高多于一个数量级(> IOg Γ1) (Ohya(2005) “通过反复分批补料发酵优化甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中的人血清白蛋白产生(Optimization of human serum albumin production in methylotrophic yeast Pichia pastoris by repeated fed-batch fermentation). "Biotechnol Bioeng 90 :876-887)。总之，我们将生物合成掺入非天然氨基酸的方法拓展至甲基营养酵母菌。两种 aaRS/tRNACUA配对显示在巴斯德毕赤酵母中是正交的，它们用于对rHSAE37X的残基37处的琥珀密码子起反应而表达含8种不同非天然氨基酸的突变型蛋白。突变型蛋白在摇瓶中的表达水平高，保真度优秀。这些结果提示该表达系统适用于许多其它非天然氨基酸及目前在酿酒酵母中开发的合成酶，不限于本文讨论的非天然氨基酸或aaRS/tRNA。UA配对。该新系统的高产量和保真度使其能获得有用量的具有独特生物学和药学特性的治疗性蛋白质。 例如，可采用化学方法，如肟连接或铜催化1，3-环化加成反应(克里克化学反应)位点特异性地PEG化或交联蛋白质，可掺入金属离子结合氨基酸以结合放射性同位素，可分别从例如HSA或靶向蛋白等载体蛋白制备肽、毒素或SiRNA偶联物，所述靶向蛋白例如抗体。此外，在体外抗血管生成试验中检验了前述rHSAE37pApa-ABT-510偶联物。拓展rHSA_E37pApa用作内源性、非-免疫原性运载体的尝试目前应用于其它快速清除的肽，包括胰高血糖素-样肽 1模拟物(GLP-I)和甲状旁腺激素(PTH)肽。尽管已经出于清楚和理解的目的在某种程度上详细地描述了本发明，但是本领域技术人员通过阅读本说明书可清楚地了解，可在不背离本发明真实范围的情况下对形式和细节作出各种改变。例如，上述所有技术和设备都可用于各种组合。如同各出版物、专利、专利申请和/或本文引用的其它文献专门表明出于所有目的通过引用纳入本文的程度一样， 本申请中提到的所有出版物、专利、专利申请和/或文献都通过引用全文纳入本文。成孰HSA^MiS酸序歹Il (不句,括信号序歹Il或IiTflt序歹II) SEQ ID NO!DAHKS TEFAKTCVADESAENCDKSL DDNPNLPRLVRPEVDVMCTA ECCQAADKAACLLPKLDELR EFAEVSKLVTDLTKVHTECC SHCIAEVENDEMPADLPSLA LRLAKTYETTLEKCCAAADP LLVRYTKKVPQVSTPTLVEV TPVSDRVTKCCTESLVNRRP TALVELVKHKPKATKEQLKA VMDDFAAFVE KCCKADDKET CFAEEGKKLV AASQAALGL成熟TSP-I的氨基酸序列(不包括信号序列)SEQ ID NO 2NR IPESG⑶NSV FDIFELTGAA RKGSGRRLVK GPDPSSPAFR IEDANLIPPVPDDKFQDLVD AVRAEKGFLL LASLRQMKKT RGTLLALERK DHSGQVFSVV SNGKAGTLDLSLTVQGKQHV VSVEEALLAT GQffKSITLFV QEDRAQLYID CEKMENAELD VPIQSVFTRD
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权利要求
1.一种制备共价偶联的载体多肽-靶多肽偶联物的方法，该方法包括在载体多肽合成或翻译期间将第一非天然氨基酸残基掺入该载体多肽；在靶多肽合成或翻译期间将第二非天然氨基酸残基掺入该靶多肽；和使该第一和第二非天然氨基酸残基反应以产生所述共价偶联的载体多肽-靶多肽偶联物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在翻译期间将所述第一非天然氨基酸掺入所述载体多肽包括(a)提供翻译系统，其包含(i)所述第一非天然氨基酸，(ii)正交tRNA-合成酶(O-RS)，(iii)被所述O-RS用所述第一非天然氨基酸特异性氨酰化的正交tRNA(O-tRNA)，和(iv)编码所述载体肽的核酸，其中所述核酸包含所述0-tRNA识别的选择者密码子；和(b)翻译所述核酸，藉此在翻译期间将所述第一非天然氨基酸掺入所述载体多肽。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载体或靶多肽在甲基营养酵母菌细胞中产生。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载体或靶多肽在假丝酵母(Candida)细胞、汉逊酵母(Hansenula)细胞、毕赤酵母(Pichia)细胞或球拟酵母菌(Torulopsis)细胞中产生。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载体多肽与人血清白蛋白(HSA)同源。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载体多肽是以下物质或与以下物质同源抗体，HER2抗体和0KT3抗体，抗体片段，Fab, Fe, scFv，白蛋白，血清白蛋白，牛血清白蛋白，卵白蛋白，C-反应性蛋白，伴白蛋白，乳清蛋白，匙孔贼血蓝蛋白(KLH)，离子载体蛋白，酰基载体蛋白，信号转导衔接蛋白，雄激素结合蛋白，钙结合蛋白，钙调蛋白结合蛋白， 血浆铜蓝蛋白，胆固醇酯转移蛋白，f_盒蛋白，脂肪酸_结合蛋白，卵泡抑素，卵泡抑素_相关蛋白，GTP-结合蛋白，胰岛素样生长因子结合蛋白，铁-结合蛋白，潜在TGF-β结合蛋白， 光_收集蛋白复合物，淋巴细胞抗原，膜转运蛋白，神经垂体素运载蛋白，周质结合蛋白，磷酸_结合蛋白，磷脂酰乙醇胺结合蛋白，磷脂转移蛋白，视黄醇_结合蛋白，RNA-结合蛋白， S-期激酶-相关蛋白，性激素_结合球蛋白，甲状腺素_结合蛋白，钴胺素传递蛋白，皮质激素传递蛋白，运铁蛋白_结合蛋白或维生素D-结合蛋白。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶多肽是以下物质或与以下物质同源 TSP-1、ABT-510、胰高血糖素样肽-I(GLP-I)、甲状旁腺激素(PTH)、核糖体灭活蛋白(RIP)、 血管抑素、艾赛那肽-4、脱辅基蛋白、心房钠尿因子、心房利纳多肽、心房肽、C-X-C趋化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro_a、gro_b、gro_c、IP-10、GCP-2、NAP-4、PF4、MIG、降钙素、 c-kit配体、细胞因子、CC趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1 α、单核细胞炎性蛋白-1 β、RANTES, 1309、R83915、 R91733、Τ58847、D31065、Τ64262、CD40配体、补体抑制剂、细胞因子、上皮嗜中性粒细胞活化肽 _78、GR0a、MGSA、GRO0 ,GROy ,MIPl-α、ΜΙΡ1_β、MCP_1、上皮嗜中性粒细胞活化肽、 促红细胞生成素(EPO)、剥落毒素、成纤维细胞生长因子(TOF)、FGF21、G-CSF、促性腺激素、 生长因子、水蛭素、LFA-1、人胰岛素、人胰岛素样生长因子(hIGF)、hIGF-I、hIGF-II、人干扰素、IFN- α、IFN- β、IFN- γ、白介素、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、 IL-10、IL-11、IL-12、角质形成细胞生长因子(KGF)、白血病抑制因子、神经生长因子、PDGF、 肽激素、多效生长因子、热原性外毒素Α、热原性外毒素B、热原性外毒素C、松弛素、促生长素抑制素、超氧化物歧化酶、胸腺素α 1、人肿瘤坏死因子(hTNF)、人肿瘤坏死因子α、人肿瘤坏死因子β、Ras, Tat、炎性分子、信号转导分子、牛胰蛋白酶抑制剂(BPTI)或BP320抗原。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述第一非天然氨基酸掺入所述载体多肽产生包含所述第一非天然氨基酸的HSA变体。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述第一非天然氨基酸是对-乙酰基苯丙氨酸。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述第一非天然氨基酸掺入所述HSA变体的氨基酸37位，其中氨基酸位置的编号根据SEQ ID NO 1的。
11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述第一非天然氨基酸在翻译期间掺入所述HSA变体。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述第二非天然氨基酸掺入所述靶多肽产生包含所述第二非天然氨基酸的TSP-I变体。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述第二非天然氨基酸掺入所述靶多肽产生包含所述第二非天然氨基酸的ABT-510变体。
14.如权利要求12或13所述的方法，其特征在于，所述第二非天然氨基酸是 ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸掺入所述TSP-I变体的氨基酸6位，其中氨基酸位置的编号是依照SEQ ID NO 2的。
16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸掺入所述TSP-I变体的氨基酸1位，其中氨基酸位置的编号是依照SEQ ID NO 2的。
17.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸在合成期间掺入所述TSP-I变体。
18.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸掺入所述ΑΒΤ-510变体的氨基酸6位，其中氨基酸位置的编号是依照SEQ ID Ν0:3的。
19.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸掺入所述ΑΒΤ-510变体的氨基酸1位，其中氨基酸位置的编号是依照SEQ ID Ν0:3的。
20.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸在合成期间掺入所述ΑΒΤ-510变体。
21.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载体多肽是HSA变体，其中所述第一非天然氨基酸是对-乙酰基苯丙氨酸，其中所述对乙酰基苯丙氨酸在翻译期间掺入所述HSA 变体的氨基酸37位，其中所述HSA变体中氨基酸位置的编号依照SEQ ID Ν0:1，其中所述靶多肽是TSP-I变体，其中所述第二非天然氨基酸是ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸，其中所述ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸在合成期间掺入所述TSP-I变体的氨基酸6位，其中所述TSP-I变体中氨基酸位置的编号依照SEQ ID NO :2，其中所述对-乙酰基苯丙氨酸和ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸通过肟连接反应以产生HSA-TSP-I偶联物。
22.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载体多肽是HSA变体，其中所述第一非天然氨基酸是对-乙酰基苯丙氨酸，其中所述对乙酰基苯丙氨酸在翻译期间掺入所述HSA 变体的氨基酸37位，其中所述HSA变体中氨基酸位置的编号依照SEQ ID N0:1，其中所述靶多肽是ABT-510变体，其中所述第二非天然氨基酸是ε-(2_(氨基氧基)乙酰基)_L_赖氨酸，其中所述ε_(2-(氨基氧基)乙酰基)_L-赖氨酸在合成期间掺入所述ΑΒΤ-510变体的氨基酸6位，其中所述ABT-510变体中氨基酸位置的编号依照SEQ ID N0:3，其中所述对-乙酰基苯丙氨酸和ε_(2-(氨基氧基)乙酰基)-L_赖氨酸通过肟连接反应以产生 HSA-ABT-510 偶联物。
23.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一和第二非天然氨基酸通过一种或多种以下机制反应亲电_亲核反应、酮与亲核试剂反应、肟连接、醛与亲核试剂反应、羰基和亲核试剂之间的反应、磺酰基和亲核试剂之间的反应、酯化反应、位阻酯基和亲核试剂之间的反应、硫酯基团和亲核试剂之间的反应、稳定的亚胺基和亲核试剂之间的反应、环氧基团和亲核试剂之间的反应、氮丙啶基团和亲核试剂之间的反应、亲电试剂和脂族胺或芳族胺之间的反应、亲电试剂和酰胼之间的反应、亲电试剂和碳酰胼之间的反应、亲电试剂和氨基脲之间的反应、亲电试剂和氨基硫脲之间的反应、亲电试剂和羰基酰胼之间的反应、亲电试剂和硫代羰基酰胼之间的反应、亲电试剂和磺酰基酰胼之间的反应、亲电试剂和卡巴胼之间的反应、亲电试剂和硫卡巴胼之间的反应、亲电试剂和羟胺之间的反应、亲核试剂或亲核试剂，例如羟基或二醇和硼酸或酯之间的反应、过渡金属催化的反应、钯催化的反应、铜催化的杂原子烷化反应、环加成反应、1，3环加成反应、2，3环加成反应、炔-叠氮化物反应、 狄尔斯_阿德尔反应或铃木偶联反应。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述反应的效率大于50%、大于70 %或大于 90%。
25.一种通过权利要求1所述方法产生的载体多肽_靶多肽偶联物。
26.如权利要求25所述的载体多肽-靶多肽偶联物，其特征在于，所述载体多肽是包含至少一个所述第一非天然氨基酸的HSA变体，且所述靶多肽是包含所述第二非天然氨基酸的TSP-I变体。
27.如权利要求25所述的载体多肽-靶多肽偶联物，其特征在于，所述载体多肽是包含至少一个所述第一非天然氨基酸的HSA变体，所述靶多肽是包含所述第二非天然氨基酸的 ABT-510 变体。
28.如权利要求26或27所述的载体多肽_靶多肽偶联物，其特征在于，所述第一非天然氨基酸是对_乙酰基苯丙氨酸。
29.如权利要求28所述的载体多肽-靶多肽偶联物，其特征在于，所述第一氨基酸掺入所述HSA变体的氨基酸37位，其中氨基酸位置的编号根据SEQ ID NO :1的。
30.如权利要求29所述的载体多肽_靶多肽偶联物，其特征在于，所述第一氨基酸在翻译期间掺入所述HSA变体。
31.如权利要求26或27所述的载体多肽_靶多肽偶联物，其特征在于，所述第二氨基酸是ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸。
32.如权利要求31所述的载体多肽-靶多肽偶联物，其特征在于，所述ε-(2_(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸掺入所述TSP-I变体的氨基酸6位，其中氨基酸位置的编号是依照 SEQ ID NO 2 的。
33.如权利要求31所述的载体多肽-靶多肽偶联物，其特征在于，所述ε-(2_(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸掺入所述TSP-I变体的氨基酸1位，其中氨基酸位置的编号是依照 SEQ ID NO 2 的。
34.如权利要求32或33所述的载体多肽_靶多肽偶联物，其特征在于，所述第二非天然氨基酸在合成期间掺入所述TSP-I变体。
35.如权利要求31所述的载体多肽-靶多肽偶联物，其特征在于，所述ε-(2_(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸掺入所述ΑΒΤ-510变体的氨基酸6位，其中氨基酸位置的编号是依照 SEQ ID NO :3 的。
36.如权利要求31所述的载体多肽-靶多肽偶联物，其特征在于，所述ε-(2_(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸掺入所述ΑΒΤ-510变体的氨基酸1位，其中氨基酸位置的编号是依照 SEQ ID NO :3 的。
37.如权利要求35或36所述的载体多肽_靶多肽偶联物，其特征在于，所述第二非天然氨基酸在合成期间掺入所述TSP-I变体。
38.如权利要求26所述的载体多肽_靶多肽偶联物，其特征在于，所述载体多肽是在氨基酸37位包含对乙酰基苯丙氨酸的HSA变体，其中所述靶多肽是在氨基酸6位包含 ε -(2_(氨基氧基)乙酰基)-L_赖氨酸的TSP-I变体，其中所述对_乙酰基苯丙氨酸和 ε _(2-(氨基氧基)乙酰基)_L-赖氨酸通过肟连接反应以产生所述载体多肽-靶多肽偶联物。
39.如权利要求26所述的载体多肽-靶多肽偶联物，其特征在于，所述载体多肽是在氨基酸37位包含对乙酰基苯丙氨酸的HSA变体，其中所述靶多肽是在氨基酸6位包含 ε -(2_(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸的ΑΒΤ-510变体，其中所述对-乙酰基苯丙氨酸和 ε _(2-(氨基氧基)乙酰基)_L-赖氨酸通过肟连接反应以产生所述载体多肽-靶多肽偶联物。
40.如权利要求25所述的载体多肽_靶多肽偶联物，其特征在于，所述载体多肽_靶多肽偶联物的血清半衰期长于所述靶多肽。
41.一种载体多肽-靶多肽偶联物，其包含包含第一非天然氨基酸残基的载体多肽结构域；和包含第二非天然氨基酸残基的靶多肽结构域，其中所述载体多肽结构域和靶多肽结构域通过所述第一和第二非天然氨基酸残基偶联在一起。
42.如权利要求41所述的载体多肽-靶多肽偶联物，其特征在于，所述载体多肽结构域包含抗体、抗体片段、白蛋白、血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、C-反应性蛋白、伴白蛋白、乳清蛋白、匙孔贼血蓝蛋白(KLH)、离子载体蛋白、酰基载体蛋白、信号转导衔接蛋白、 雄激素结合蛋白、钙结合蛋白、钙调蛋白结合蛋白、血浆铜蓝蛋白、胆固醇酯转移蛋白、f_盒蛋白、脂肪酸-结合蛋白、卵泡抑素、卵泡抑素-相关蛋白、GTP-结合蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白、铁-结合蛋白、潜在TGF-β结合蛋白、光-收集蛋白复合物、淋巴细胞抗原、膜转运蛋白、神经垂体素运载蛋白、周质结合蛋白、磷酸_结合蛋白、磷脂酰乙醇胺结合蛋白、 磷脂转移蛋白、视黄醇_结合蛋白、RNA-结合蛋白、S-期激酶-相关蛋白、性激素-结合球蛋白、甲状腺素-结合蛋白、钴胺素传递蛋白、皮质激素传递蛋白、运铁蛋白-结合蛋白或维生素D-结合蛋白。
43.如权利要求41所述的载体多肽-靶多肽偶联物，其特征在于，所述靶多肽结构域包含以下一种或多种TSP-1、ABT-510、胰高血糖素样肽-1 (GLP-I)、甲状旁腺激素(PTH)、核糖体灭活蛋白(RIP)、血管抑素、艾赛那肽_4、脱辅基蛋白、心房钠尿因子、心房利钠多肽、 心房肽、C-X-C 趋化因子、了39765、嫩？-2丄嫩-7841~0-&41~0-13 41~0-(；、1卩-10、6。卩-2、嫩？-4、 PF4、MIG、降钙素、c-kit配体、细胞因子、CC趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1 α、单核细胞炎性蛋白-1 β、RANTES、 I309、R83915、R91733、T58847、D31065、T64262、CD40 配体、补体抑制剂、细胞因子、上皮嗜中性粒细胞活化肽-78、GRO α、MGSA、GRO β、GRO γ、MIPl-α、 MIPl-β、MCP-1、上皮嗜中性粒细胞活化肽、促红细胞生成素(EPO)、剥落毒素、成纤维细胞生长因子(FGF)、FGF21、G-CSF、 促性腺激素、生长因子、水蛭素、LFA-1、人胰岛素、人胰岛素样生长因子(hIGF)、hIGF-I、 hIGF-II、人干扰素、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、白介素、IL-U IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、 IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12、角质形成细胞生长因子(KGF)、白血病抑制因子、 神经生长因子、PDGF、肽激素、多效生长因子、热原性外毒素Α、热原性外毒素B、热原性外毒素C、松弛素、促生长素抑制素、超氧化物歧化酶、胸腺素α 、人肿瘤坏死因子(hTNF)、人肿瘤坏死因子α、人肿瘤坏死因子β、Ras、Tat、炎性分子、信号转导分子、牛胰蛋白酶抑制剂 (BPTI)或 BP320 抗原。
44.如权利要求41所述的载体多肽-靶多肽偶联物，其特征在于，所述载体多肽结构域包含HSA，其中所述第一非天然氨基酸残基是对乙酰基苯丙氨酸，其中所述靶多肽结构域包含TSP-1，其中所述第二非天然氨基酸残基是ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸。
45.如权利要求41所述的载体多肽-靶多肽偶联物，其特征在于，所述载体多肽结构域包含HSA，其中所述第一非天然氨基酸残基是对乙酰基苯丙氨酸，其中所述靶多肽结构域包含ABT-510，其中所述第二非天然氨基酸残基是ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)_L_赖氨酸。
46.如权利要求41所述的载体多肽_靶多肽偶联物，其特征在于，所述第一和第二非天然氨基酸通过一种或多种以下机制共价偶联亲电-亲核反应、酮与亲核试剂反应、肟连接、醛与亲核试剂反应、羰基和亲核试剂之间的反应、磺酰基和亲核试剂之间的反应、酯化反应、位阻酯基和亲核试剂之间的反应、硫酯基团和亲核试剂之间的反应、稳定的亚胺基和亲核试剂之间的反应、环氧基团和亲核试剂之间的反应、氮丙啶基团和亲核试剂之间的反应、亲电试剂和脂族胺或芳族胺之间的反应、亲电试剂和酰胼之间的反应、亲电试剂和碳酰胼之间的反应、亲电试剂和氨基脲之间的反应、亲电试剂和氨基硫脲之间的反应、亲电试剂和羰基酰胼之间的反应、亲电试剂和硫代羰基酰胼之间的反应、亲电试剂和磺酰基酰胼之间的反应、亲电试剂和卡巴胼之间的反应、亲电试剂和硫卡巴胼之间的反应、亲电试剂和羟胺之间的反应、亲核试剂或亲核试剂，例如羟基或二醇和硼酸或酯之间的反应、过渡金属催化的反应、钯催化的反应、铜催化的杂原子烷化反应、环加成反应、1，3环加成反应、2，3环加成反应、炔_叠氮化物反应、狄尔斯_阿德尔反应或铃木偶联反应。
47.一种细胞，其包含权利要求31所述的载体多肽_靶多肽偶联物。
48.如权利要求47所述的细胞，其特征在于，所述载体多肽-靶多肽偶联物的载体多肽结构域包含含有所述第一非天然氨基酸的HSA变体。
49.如权利要求48所述的细胞，其特征在于，所述第一非天然氨基酸是对_乙酰基苯丙氨酸。
50.如权利要求47所述的细胞，其特征在于，所述载体多肽-靶多肽偶联物的靶多肽结构域包含含有所述第二非天然氨基酸的TSP-I变体。
51.如权利要求47所述的细胞，其特征在于，所述载体多肽-靶多肽偶联物的靶多肽结构域包含含有所述第二非天然氨基酸的ABT-510变体。
52.如权利要求5 0或51所述的细胞，其特征在于，所述第二非天然氨基酸是 ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸。
全文摘要
提供制备载体多肽的方法，该方法包括将第一非天然氨基酸掺入载体多肽变体，将第二非天然氨基酸掺入靶多肽变体，使该第一和第二非天然氨基酸反应以产生偶联物。还提供了采用所提供方法产生的偶联物。此外，还提供了甲基营养酵母菌中的正交翻译系统和利用这些系统产生包含非天然氨基酸的载体和靶多肽变体的方法。
文档编号C12N5/10GK102307905SQ200980156791
公开日2012年1月4日 申请日期2009年12月9日 优先权日2008年12月10日
发明者P·G·舒尔茨, T·杨 申请人:斯克利普斯研究院
文档序号 :
【 581621 】
技术研发人员：Ｔ·杨
技术所有人：斯克利普斯研究院
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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