赤魟尾刺亲环素a基因的克隆、表达及生物活性的制作方法
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本发明涉及赤魟尾刺亲环素A(亲环素A)基因的克隆、表达及生物活性。更具体说，本发明涉及从赤魟尾刺cDNA表达文库总质粒出发，利用PCR方法筛选克隆出CypA全长基因，利用基因工程的方法，在高效大肠杆菌表达系统中表达并纯化出具有生物活性的赤魟尾刺亲环素A蛋白，通过重组赤魟亲环素A蛋白的肽基脯氨酸顺反异构酶活性鉴定和与环胞菌素A(CsA)结合亲和力等功能的研究，确证其活性，作为药靶用来筛选能与之高亲和力结合的小分子化合物和传统中药组分等，为新的抗艾滋病毒药物和免疫抑制剂的筛选奠定基础。
Cyp家族包括多种成员，其中CypA是含量最多，最主要的一种，约占细胞总蛋白的0.1％，其链长为165个氨基酸残基，分子量为18kDa。CypA是于1984年由Fischer和他的研究伙伴最先发现的，同年，Handschumacher等人又发现其与免疫抑制反应药物CsA的结合作用，即作为CsA受体的特性。而这种免疫抑制反应的结合作用是CsA/CypA复合物通过抑制Ca2+依赖性磷酸酶，即神经钙蛋白(Calcineurin，CN)来调控的。另外，亲环素在许多组织中可广泛表达，尤其在脑组织和神经细胞中的浓度最高，它作为肽脯氨酰顺反异构酶PPIase，在神经元蛋白成熟和折叠中起重要作用，其主要表现在在蛋白折叠过程中加快限速性异构化的进程。亲环素还可以根据不同的靶细胞，表现为至少7种异构体，从而体现多种不同的功能。在包括酵母和哺乳动物等多种细胞中，亲环素可以影响一种锌指转录因子YY1并且同时调控其功能活性，而此时亲环素A的肽脯氨酰顺反异构酶活性可以以离子依赖性方式被锌离子的结合所抑制，但是CypA-Zn2+复合物亦可识别并结合DNA序列并可能涉及到转录过程的调节。亲环素同样还可以作为一种类细胞因子，这一研究表明CypA可以调节CsA的神经毒性(neurotoxicity)，还可以在调控神经元功能上起到很重要的作用；Hovland等人的研究还发现，作为一种已知的神经毒素，CsA在神经细胞内表现出了对CypA水平调节的作用。已有实验采用鼠的成神经细胞瘤(NB)进行研究，结果表明，单一的CsA就足以在未分化的NB细胞中导致其形态差异而引起CypA水平的提高(通过immunostaining检测)。
另外，另一方面的实验亦表明，通过RO20-1724以及PEG的作用可提高cAMP的水平并导致细胞的形态差异，但未发现可提高CypA的水平，而在不论是RO20-1724还是PEG所介导分化的NB细胞中CsA均起到了这种作用。由此可知，CsA在未分化或是cAMP介导分化的NB细胞中均起着调节其自身的结合蛋白(CypA)的水平的作用。并且，CsA通过与Cyp的结合抑制了CN磷酸酶的活性，从而调节着核转运以及NFAT转录因子的活性。故而，了解在神经细胞中CypA水平的调节是相当重要的。
亲环素有着多种的生物学功能。其主要有(1)参与蛋白质的折叠、装配和运输肽脯氨酰顺反异构是蛋白质折叠的限速步骤，此异构过程可自主进行，也可由PPIase催化进行。Cyp是PPIase家族之一，体外实验显示出即使很小浓度的Cyp亦可促进各种蛋白质的折叠，其中CsA与Cyp结合后可抑制其PPIase的活性，从而减慢蛋白的折叠，但是就其机理而言尚不明确，可能是由于PPIase可减弱C-N的双键特征，使键能减小易于扭转而导致加速异构所造成的；此外，Cyp还具有分子伴侣的作用，可减弱不完全折叠多肽的聚集。大量的体外实验已经证明了Cyp参与蛋白质折叠的作用，与此相比，体内实验对于Cyp在此方面的作用还需进一步的确证。
(2)参与免疫抑制Cyp与CsA结合的复合体与神经钙蛋白(Calcineurin，CN)结合，抑制CN的活性来阻断其脱磷酸，从而抑制NFAT向核内转位，抑制NFAT与fos和jun(NFAT核内成分)结合，并抑制形成的Cyp-CsA-CN复合体与DNA结合。因此基因激活受到抑制，产生了免疫抑制。在没有CsA的情况下，Cyp可与其天然配体结合抑制CN的活性，对集体免疫系统起调节的作用，而保持相对平衡。
(3)参与细胞凋亡细胞凋亡是染色质DNA片段化的表现，NUC18作为一种主要的核酸内切酶催化着这一过程，研究表明，CypA与NUC18有着及其相似的氨基酸序列，抗体之间亦有交叉反应性。由此，重组Cyp在变性与天然状态均有这一内切酶活性，可降解单双链DNA、超螺旋DNA以及RNA，当然这一特性与其所具有的PPIase活性无关。此外，研究发现，Cyp的浓度及其核酸酶活性在凋亡过程中不发生变化，因此可推测这一过程中Cyp所表现的核酸酶活性是被激化的。但是具体的激活机制尚不明确。
(4)发挥细胞因子的功能研究者在类风湿关节炎患者的关节液中发现了CypA，并且未发现关节液中细胞未有明显的破坏，由此可以推知，CypA是由细胞分泌的，而并不是细胞破坏释放的。实验证明，牛和人重组CypA对于嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的作用呈现被趋化的现象(CsA可抑制这一作用)，从而更确证了CypA作为细胞因子家族中又一成员所发挥的免疫调节及炎症反应等方面的作用。
(5)在多种疾病中的作用目前研究最多的是CypA在1型人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus 1，HIV1)感染中所起的作用。研究发现CypA特异掺入HIV-1病毒颗粒中，且为HIV-1感染复制所必需。CypA作用于Gag蛋白，引导Gag蛋白的正确折叠。而Gag蛋白则引导病毒颗粒的组装，在逆转录病毒感染早期发挥重要的作用。Gag蛋白中一富含脯氨酸的区域可与CypA结合。除去CypA的HIV-1病毒感染能力明显下降，由此证实了HIV-1的感染能力有赖于CypA的存在。CsA可阻断Gag蛋白与CypA的结合，将其加入HIV-1感染的细胞培养液中可使HIV-1的表达和感染力下降。所以，尽管CsA具有抑制免疫反应的作用，但在爱滋病的治疗应用尚仍存在一定的前景。
另外，研究又发现宿主细胞Cyp与利什曼原虫(L.major)的胞内复制有关。CypA的反义寡核苷酸在利什曼原虫感染前加入巨噬细胞培养液中可有效的抑制其胞内复制。此外，CypA与某些自身免疫疾病有一定的关系，其中包括，CypA存在于类风湿性关节炎患者的关节液中，对炎症的发生和发展有一定的促进作用。鉴于CypA基因在多种疾病中的作用机制的研究，提示着对这个CypA基因的深入研究在疾病的应用和新的免疫抑制剂的筛选方面有着诱人的前景。
序列分析表明赤魟亲环素A基因与人同源物的核苷酸序列相似性高达84％；蛋白质序列同源性亦达72％。
本发明提供一种如序列表中序列号码1所示核苷酸序列的DNA。
本发明提供一种如序列表中序列号码1所示氨基酸序列的蛋白质。
本发明提供一种重组载体，该重组载体包括上述一种核苷酸序列。
本发明提供一种含有上述重组载体的原核细菌。
在一种实施方式中，上述原核细菌是大肠杆菌。
在一种实施方式中，上述载体使是以硫氧环蛋白为融合伴体，中间插入6个His的亲和标记位点及蛋白酶3C识别位点的高效表达载体pTRX-cyp A。
在一种实施方式中，上述载体使所述DNA在大肠杆菌中以胞内可溶的形式表达，其表达量为40-60mg/L。
在一种实施方式中，上述重组载体的表达产物超音裂解液经过Ni2+-Chelating亲和柱层析，蛋白酶3C切割和凝胶过滤可得到纯度在95％以上的性质稳定的成熟蛋白，得率为5-8mg/L。
本发明还提供一种用作引物的DNA片段，该DNA片段由上述核苷酸序列的一部分序列组成。
本发明还提供一种含有上述蛋白的药物靶标。
在一种优选实施方式中，是将上述药物靶标通过所含蛋白的稳定的肽基脯氨酸顺反异构酶活性以及与环胞菌素A的结合亲和力，用于筛选抗爱滋病毒药物和免疫抑制剂。
本发明所选择的魟鱼属于赤魟(Dasytis akajei)，采购自广东省湛江水产品市场。赤魟尾刺cDNA文库的构建首先解剖分离到赤魟尾刺，提取总RNA；进行第一链合成，LD PCR cDNA扩增，酶切消化和柱回收cDNA构建表达文库；随机挑取小量文库克隆测序获得赤魟亲环素EST。然后用PCR的方法从赤魟尾刺表达文库总质粒中筛选克隆到亲环素A全长基因，根据所获得的亲环素EST 3’端和载体核苷酸序列，设计引物，PCR扩增得到目的条带，将目的条带连接到T-easy载体，并转化E.coli挑选重组克隆。
本发明通过对以上重组克隆进行序列测定，克隆获得赤魟亲环素A全长基因，并通过基因工程方法表达出重组蛋白。新基因编码167个氨基酸的成熟肽，等电点约为8.34，分子量约为18,021道尔顿，具有典型的亲环素A基因一级结构的特征。其酶活性位点-环孢菌素A结合位点高度保守，即具有构建CsA结合位点的13个残基(R55，F60，M61，Q63，G72，A101，N102，A103，Q111，F113，W121，L122和H126)中包括了结合必需的色氨酸和特征性的丰富苯丙氨酸，而其N-和C-端功能域则多变。
本发明通过一对引物的设计，将编码赤魟亲环素A的基因用PCR方法从T-easy载体上扩增出来，克隆到中间质粒BSK后转移至原核融合表达载体pTRX上，构建成表达质粒并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)(见图3)。此表达载体(pTRX-cyp3c)以T7为启动子，采用分子伴侣TRX为融合伴体，可帮助重组蛋白正确折叠，以可溶的形式表达，TRX的C端有柔链区和6×His结构，便于利用固定化金属配体亲和层析进行纯化。所设计的上游引物含有蛋白酶3C位点，以便外源蛋白单体的获得。通过对培养时间，诱导时间，温度等条件的摸索和优化，Cyp3c融合蛋白的表达量可达到60mg/L，并且基本上处于可溶状态。
本发明还摸索和优化了重组Cyp3c蛋白的纯化条件，表达产物的超声裂解液经Ni2+Chelating Sepharose亲和色谱层析，得到纯度较高的融合蛋白，融合蛋白经3C蛋白酶切割和进一步的G50凝胶柱层析，可得到纯度在95％以上的成熟重组赤魟尾刺亲环素A蛋白。
本发明获得的重组赤魟亲环素A蛋白是有生物活性的。
本发明获得的重组赤魟亲环素A蛋白具有肽基脯氨酸顺反异构酶(peptidyl-prolyl cis-trans isomerases，PPIase)活性。对重组赤魟亲环素A蛋白进行的活性实验，利用糜蛋白酶偶联法检测重组赤魟亲环素A蛋白的酶活，发现亲环素A蛋白具有肽基脯氨酸顺反异构酶催化活性(见FIG)。本发明利用分子生物学的方法，找到了1个赤魟亲环素A新基因，并采用融合表达系统生产出具有肽基脯氨酸顺反异构酶活性的重组赤魟亲环素A蛋白，作为药靶具有极高的应用前景及产业开发价值。
本发明的含有赤魟尾刺亲环素A蛋白成熟肽编码序列的表达质粒pTRX-Cyp3c(构建过程见图3)已经保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉，珞珈山，武汉大学校内)，保藏号M201039，保藏日2001年10月26日。
由该表达质粒载体经Kpn I/Not I双酶切，可得到540bp的片段，即为赤魟尾刺CyclophilinA成熟肽编码序列(其中包含蛋白酶3C识别位点)(酶切结果见图4)本发明的表达质粒载体的复制方法参照Sambrook(Sambrook，et al.1989，Molecular cloing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)方法，按CaCl2法在E.Coli.DH5α或BL21(DE3)菌株中转化质粒，用含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基转化细菌，碱法提取质粒。
图2赤魟尾刺亲环素A蛋白基因的PCR电泳结果。其中1.PCR目的条带；2.1kb DNA标记。
图3含赤魟尾刺亲环素A蛋白基因的重组质粒pPTRX-Cyp3c表达质粒构建图。
图4含赤魟尾刺亲环素A蛋白基因的BSK-Cyp3c中间质粒和pPTRX-Cyp3c表达质粒酶切鉴定图。其中，M1Kb DNA Ladder(Gibco)；lane 1pTRX-Cyp3c载体质粒KpnI，NotI双酶切产物；lane 2pTRX-Cyp3c载体质粒；lane 3BSK-Cyp3c载体质粒的KpnI，BamHI双酶切产物；lane 4BSK-Cyp3c载体质粒。
图5A和图5B为重组赤魟尾刺亲环素A蛋白诱导表达、纯化rCypA电泳图。
图5A为不同收菌时间，同一IPTG诱导浓度的蛋白表达，其中C未加IPTG诱导的总菌体；M蛋白质低分子标记(6条带分子量如图F中所示)；Lane 1，2，3，4诱导10小时(7+3)，IPTG诱导浓度依次为0.5mM、0.25mM、0.1mM、0.01mM；Lane 5，6，7，8诱导11小时(7+4)，IPTG诱导浓度依次为0.01mM、0.1mM、0.25mM、0.5Mm。、图5B为纯化rCypA的SDS-PAGE电泳图，其中M蛋白质低分子标记；1.未加IPTG诱导的pTRX-Cyp3c BL21(DE3)菌体；2.加0.1mM IPTG诱导的pTRX-Cyp3c BL21(DE3)菌体；3.纯化的赤魟rCyPA。
图6为重组赤魟尾刺亲环素A蛋白亲和层析图谱。BB液洗脱；CC液洗脱；DD液洗脱；EE液洗脱.
图7为重组赤魟尾刺亲环素A蛋白分子筛层析图谱，其中A第1峰；B第2峰；C第3峰。
图8为表示糜蛋白酶偶联法测定重组赤魟CyPA的PPIase活性的示意图。
实施例1赤魟尾刺总RNA的提取、文库构建和PCR克隆筛选总RNA的提取和cDNA合成解剖二条赤魟尾刺，采用异硫氰酸胍法提取触手总RNA，酚/氯仿抽提去除蛋白质.获得65μg尾刺总RNA，其A260/A280＝1.98，经1％甲醛变性胶电泳检测可见清晰的28s和18s两条带，比值＞2，以及mRNA smear(见
图1)，表明总RNA完整性良好。进行第一链合成，LD PCR cDNA扩增，酶切消化和柱回收cDNA，构建cDNA文库。
引物设计和PCR扩增根据文库少量克隆随机测序结果所获得的亲环素(CyP)EST 3’端和载体核苷酸序列，设计引物，T7引物5’-TAA TAC GAC TCACTA TA-3’；CyPA引物5’-TTG TTC CCA AAC AAT CAC-3’。每50μl PCR反应体积加入1μl文库总质粒作为模板，PCR扩增，电泳检测，发现在650bp附近出现预期的特异性扩增带(见图2)，回收此带。实施例2重组赤魟尾刺CypA基因序列的测定和分析将回收的电泳产物连接至T-easy载体，转化DH5 α大肠杆菌，挑选重组克隆测序。一共测定了12个克隆，Blast同源分析表明，其中有7个是亲环素A基因序列，这7个亲环素A基因长度都是656bp，编码1个长度为167个氨基酸的青环素蛋白，编号为Ch120。它与人同源物的核苷酸序列相似性高达84％；和已报导CyPA蛋白质序列同源性亦达72％但不完全相同。在赤魟中未见报道，是1个新的亲环素A蛋白。
利用工具软件DNAtools对其碱基序列(如上图)进行分析，并获得其最大读码框，在靠近5’端处出现起始密码子ATG，并且在ATG前还发现了一段特征性的岗崎片段(GCAGCGCC)，以及在紧跟ATG后出现一个限定性碱基G，由统计学的角度考虑以上两个条件，可以确认紧跟其后出现的ATG为CypA全长序列的起始密码子；序列分析还发现，在靠近3’端终止密码子处发现一个加尾信号(AATAAA)，并且在3’端处的确出现了polyA序列，由此亦可以确认此序列已经终结。故根据以上的多方面分析可以判断本实验所采用的CypA基因序列为全长序列。另外通过Clustalw分析软件可得如下比较结果Hom ------------------MVNPTVFFDIAVDGEPLGRVSFELFADKVPKTAENFRALSTGMus ------------------MVNPTVFFDITADDEPLGRVSFELFADKVPKTAENFRALSTGRat ------------------MVNPTVFFDITADGEPLGRVCFELFADKVPKTAENFRALSTGDro ------------------MSLPRVYFDIAAGGEKLGRIVMELRSDVVPKTAENFRALCTGch120 ----------------MANKKPRVFMDISIGGKPQGRITMELNADVVPKTAENFRALCTG*:: **: :** * ***********.**Hom EKGFG-------YKGSCFHRIIPGFMCQGGDFTRHNGTGGKSIYGEKFEDENFILKHTGPMus EKGFG-------YKGSSFHRIIPGFMCQGGDFTRHNGTGGRSIYGEKFEDENFILKHTGPRat EKGFG-------YKGSSFHRIIPGFMCQGGDFTRHNGTGGKSIYGEKFEDENFILKHTGPDro EKGYG-------YKGSPFHRVIPNFMCQGGDFTNQNGTGGRSIYGNKFPDENFELKHTGAch120 EKGFG-------YKGSTFHRIIPGFMCQGGDFTRHNGTGGKSIYGEKFKDENFQLKHTVP*** * :*** ***:** ** ******. :****.**** ** **** **** .
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由上分析结果可以看出，本实验采用的赤魟CypA基因与其他物种的同种基因具有较高的同源性，具有典型的亲环素A基因一级结构的特征。其酶活性位点-环孢菌素A结合位点高度保守，即具有构建CsA结合位点的13个残基(R55，F60，M61，Q63，G72，A101，N102，A103，Q111，F113，W121，L122和H126)中包括了结合必需的色氨酸和特征性的丰富苯丙氨酸，而其N-和C-端功能域则多变。
在PCR扩增反应中，用普通的Taq酶会出现约10-4的错配，由于目的片段不大，PCR的循环数不超过30个，降低了错误参入的概率，从实验结果来看，这个序列在多个克隆测序中重复出现，可排除错误参入，说明本实验PCR的结果有较高的可信度。实施例3重组赤魟尾刺亲环素A蛋白表达质粒的构建依据赤魟尾刺亲环素A基因的两端序列合成一对引物，在上游引物中引入KpnI酶切位点(GGTACC)、ATG起始密码子、以及一个Prescission Protease切割位点，下游引物中引入BamH I酶切位点(GGATCC)及终止密码子TTA，TCA。
上游引物(P1)5’-GGGGTACCCTGGAAGTTCTGTTCCAAGGTCCAATGKpn I Precision Protease siteGCCAACAAGAAGCCCA-3’下游引物(P2)5’-CGGGATCCTTATCAGGACAACTCCCCACAAT-3’BamH I以含亲环素A基因的pGEM-T easy质粒为模板，P1、P2为引物PCR扩增，得到特异扩增的单一条带，产物大小在550bp左右。PCR扩增产物先以Kpn I/BamHI双酶切后连接到BSK载体上构建成BSK-CyPA，再以Kpn I/Not I的酶切克隆到原核融合表达载体pPETTRX上。克隆载体和表达载体分别用Kpn I/BamH I和KpnI/Not I进行双酶切鉴定(酶切结果见图4)。克隆载体和表达载体中的外源基因经测序鉴定正确。所设计的上游引物中含Pre-scission蛋白酶切割位点，以便切除融合伴侣TRX。实施例4 重组赤魟尾刺亲环素A融合蛋白的表达将pTRX-亲环素A转化大肠杆菌BL21(DE3)。基因工程菌超声裂解上清液经SDS-PAGE电泳分析表明，菌体经诱导后有明显的特异表达产物带，分子量与用软件PROTEIN ANALYSIS预测的理论值32.4kD相符。
经过对培养时间，诱导浓度，温度等条件的摸索(见图5)菌体扩大培养不同时间后诱导表达比较)，基因工程菌的培养条件为接单菌落于50ml氨卞抗性LB培养基中，37℃，250rpm培养过夜，取过夜培养物20ml接种于2L的氨卞抗性LB培养基中，37℃，250rpm培养至OD600＝0.6(扩大培养约2h)，加入100mM IPTG和20％葡萄糖至终浓度分别为1mM和0.2％，25℃，250rpm诱导培养10h后离心收获菌体。经SDS-PAGE电泳分析分析表明，在此条件下赤魟尾刺Trx-亲环素A融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的20％以上，基本上处于可溶状态(见图5)。实施例5 重组赤魟尾刺亲环素A融合蛋白的纯化及成熟蛋白的获得将收获的总菌体用TE(pH8.0)洗涤，再用Tis(50mM，pH7.0)悬浮，超声处理后，裂解上清液经Ni2+Chelaing Sepharose亲和色谱层析一步纯化，经SDS-PAGE分析和薄层扫描分析表明融合蛋白的纯度达到约80％(图5B、6、7)。以1L基因工程菌培养物为材料，最终获得约60mg纯化的融合蛋白。
为了提高重组蛋白的得率和浓度，简化实验步骤，缩短对重组蛋白的处理时间，在用Ni2+亲和色谱层析纯化重组蛋白时，采用一步法进行了纯化。根据载体质粒pETTRX所表达的外源蛋白与Ni2+亲和柱的结合能力较强的特点，我们选用了较简化的洗脱条件50mMPB，500mMNaCl，pH7.0(A液)；50mMPB，500mMNaCl，pH6.0(B液)；150mM咪唑，50mMPB，500mMNaCl，pH6.0(C液)；300mM咪唑，50mMPB，500mMNaCl，pH6.0(D液)；500mM咪唑，50mMPB，500mMNaCl，pH6.0(E液)。重组CyPA蛋白在D液和E液被洗脱下来(图6)。从SDS-PAGE结果来判断分离效果最好的部分。
利用Folin-酚法测定重组CyPA的蛋白浓度，收获浓度在0.7mg/ml以上的洗脱液，加入Precision Protease进行切割，用SDS-PAGE检测酶切结果，可明显看到18kD附近代表成熟rCyPA的谱带(见图5B)。将反应液用Ni2+ChelatingSepharose亲和色谱层析柱纯化(条件同前)，收获含成熟rCyPA的穿流液，并用Sephadex G-50进一步纯化(洗脱液为PBS)，便得纯度在95％以上的成熟重组赤魟尾刺亲环素A(见图7)。实施例6 重组赤魟CyPA蛋白PPIase活性的测定重组CyPA的生物活性参照Fischer等人建立的糜蛋白酶偶联法，略加改进。反应体积2ml，含35mmol/L Hepes(PH8.0)、100μmol/L N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide(溶于66％DMSO水溶液中)、10μmol/L糜蛋白酶、rCyPA的浓度为25nmol/L。除糜蛋白酶外的所有成分混合后预置在15℃，糜蛋白酶加入后迅速混匀，UV-260分光光度计连续测定A390值，直到反应终止，绘制曲线图。其结果见图8。
序列表1.一般信息(i) 申请人北京博奥环宇生物技术有限公司(ii) 发明名称赤魟尾刺亲环素A基因的克隆、表达及生物活性(iii)序列数目2序列号1序列长度656bp序列类型碱基对链数双链拓 扑 学直链状序列种类DNA起源生物赤魟(Dasytis akajei)株名大肠菌BL21(DE3)序列特征表示特征的记号有正确的读码框决定位置起始、终止密码子决定特征的方法实验存在位置起始密码子存在于第83-85位，终止密码子576-578位GNGACTGCAT TGNCANNGNC TGACCAAGTC AGTATACGGC CTACCGCTCG CATTTCTCTC 60CGGCCTCAGA AGCT ATG CC AAC AAG AAG CCC AGG GTC TTT ATG GAC ATC 118Met Ala Asn Lys Lys Pro Arg Val Phe Met Asp IleTCC ATT GGG GGT AAA CCC CAG GGT CGC ATA ACG ATG GAG CTA AAC GCA GAT 169Ser Ile Gly Gly Lys Pro Gln Gly Arg Ile Thr Met Glu Leu Asn Ala AspGTT GTC CCA AAG ACT GCA GAA AAC TTC CGT GCA CTA TGC ACA GGC GAG AAG 220Val Val Pro Lys Thr Ala Glu Asn Phe Arg Ala Leu Cys Thr Gly Glu LysGGT TTC GGT TAC AAA GGC TCA ACG TTC CAC AGA ATC ATT CCT GGA TTC ATG 221Gly Phe Gly Tyr Lys Gly Ser Thr Phe His Arg Ile Ile Pro Gly Phe MetTGC CAG GGT GGT GAC TTC ACA AGG CAT AAC GGC ACT GGA GGC AAG TCC ATC 322Cys Gln Gly Gly Asp Phe Thr Asp His Asn Gly Thr Gly Gly Lys Ser IleTAT GGG GAG AAG TTT AAA GAT GAG AAT TTT CAG CTG AAG CAC ACA GTG CCA 373Tyr Gly Glu Lys Phe Lys Asp Glu Asn Phe Gln Leu Lys His Thr Val ProGGC ATC CTG TCC ATG GCC AAT GCT GGA CCA AAT ACA AAT GGT TCC CAG TTC 424Gly Ile Leu Ser Met Ala Asn Ala Gly Pro Asn Thr Asn Gly Ser Gln PheTTC ATA TGC ACC ACA ATA ACT AGT TGG TTG GAT GGG AAG CAT GTT GTG TTT 475Phe Ile Cys Thr Thr Ile Thr Ser Trp Leu Asp Gly Lys His Val Val PheGGA TCA GTG GTA GAA GGC ATG GAT GTG GTA ACG AAG ATG GAG AAG TGT GGC 526Gly Ser Val Val Glu Gly Met Asp Val Val Thr Lys Met Glu Lys Cys GlyGAC AAG TCT GGA AAA CCC AGT GCC ACG GTT GAG ATC ACT GAT TGT GGG GAG 577Asp Lys Ser Gly Lys Phe Ser Ala Thr Val Glu Ile Thr Asp Cys Gly GluTTG TCCTGAATTATTT GAATTTGCAA TTTTATGATT TA AGTGTGAT TGTTTGGGAA 639Leu Ser*CAACAAAAAAAAAAAAA
权利要求
1.一种如序列表中序列号码1所示核苷酸序列的DNA。
2.一种如序列表中序列号码1所示氨基酸序列的蛋白质。
3.一种重组载体，该重组载体包括如权利要求1所述的核苷酸序列。
4.一种含有如权利要求3所述的重组载体的原核细菌。
5.如权利要求4所述的原核细菌，其特征在于所述的原核细菌是大肠杆菌。
6.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于所述载体是以硫氧环蛋白为融合伴体，中间插入6个His的亲和标记位点及蛋白酶3C识别位点的高效表达载体pTRX-cyp A。
7.如权利要求3所述载体，其特征在于该载体使所述DNA在大肠杆菌中以胞内可溶的形式表达，其表达量为40-60mg/L。
8.如权利要求3所述重组载体，其特征在于由该重组载体的表达产物超音裂解液经过Ni2+-Chelating亲和柱层析，蛋白酶3C切割和凝胶过滤可得到纯度在95％以上的性质稳定的成熟蛋白，得率为8-10mg/L。
9.一种用作引物的DNA片段，其由权利要求1所述核苷酸序列的一部分序列组成。
10.一种含有如权利要求2所述蛋白的药物靶标。
11.如权利要求10所述药物靶标，通过所述蛋白的稳定的肽基脯氨酸顺反异构酶活性以及与环胞菌素A的结合亲和力，用于筛选抗爱滋病毒药物和免疫抑制剂。
全文摘要
本发明通过构建赤魟(Dasytis akajei)尾刺cDNA文库和DNA测序，并根据所获得的亲环素(CyP)EST 3’端和载体核苷酸序列，设计引物，用PCR的方法，首次从赤魟尾刺cDNA文库中筛选克隆到亲环素A全长基因。新基因长度为656bp，编码167个氨基酸的成熟肽，所表达的蛋白质等电点为8.34，分子量约为18,021道尔顿。将赤魟尾刺亲环素A基因克隆于硫氧还蛋白基因融合表达载体pTRX的trxA基因3’末端，构建符合读码框的融合基因，该融合蛋白在大肠杆菌中以胞内可溶的形式存在，表达量可达60mg/l。通过Ni－Chelating亲和色谱层析，蛋白酶3C切割和凝胶过滤，得到纯度在95％以上成熟的重组赤魟亲环素A蛋白，得率为10mg/l。该蛋白具有肽基脯氨酸顺反异构酶活性。
文档编号C12P19/34GK1428348SQ01136940
公开日2003年7月9日 申请日期2001年12月25日 优先权日2001年12月25日
发明者徐安龙, 涂洪斌, 熊茜 申请人:北京博奥环宇生物技术有限公司
文档序号 :
【 578181 】
技术研发人员：徐安龙,涂洪斌,熊茜
技术所有人：北京博奥环宇生物技术有限公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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