绿壳蛋鸡啄羽相关基因检测用试剂盒及其实现方法
[0027] 1、PCR 扩增
[0028] 选择绿壳蛋鸡纯系为实验材料，根据rsl3640917附近序列设计引物，令扩增得到 的目的片段包含rsl3640917脱氧核糖核苷酸，引物序列如下：
[0029] U(上游引物）：5' - CACAATGACCACGACAACG - 3'（Seq ID No. 1)
[0030] D(下游引物）：5' - ATCTCACGGAACCCAAATG - 3'（Seq ID No. 2)
[0031] 以绿壳蛋鸡纯系基因组DNA为模板，使用引物U和D进行PCR扩增。
[0032] 扩增体系包括：鸡基因组0嫩501^、上、下游引物（10?111〇1/1)各0.3 4 1^、丁&9 Mix7. 5 μ L，并用CldH2O补充反应体系至15 μ L。
[0033] PCR反应条件为：95°C变性5min ;循环程序为95°C变性20s，60°C退火30s，72°C延 伸30s，共35个循环；最后72°C延伸lOmin。
[0034] 2、RFLP 分析
[0035] 使用限制性内切酶Acul，酶切步骤1中的PCR扩增产物。AcuI的酶切序列如下 (其中的箭头所指位置为酶切位点，N表示任何碱基）：
[0036] 5' - CTGAAG(N) 16 I - 3'
[0037] 3' - GACTTC(N) 14 丨-5'
[0038] 酶切反应体系包括：PCR反应混合物4yL、10X酶切缓冲液IyU内切酶 AcuI (10U/ μ L) 0· 4 μ L、ddH204. 6 μ L，反应体系总体积 10 μ L。
[0039] 恒温水浴37 °C孵育1小时。
[0040] 酶切产物进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳（电压8V/cm，时间30min)。使用凝胶成像系 统观察，结果如图1所示。
[0041] 由图可见，酶切产物呈现3种带型。部分样本显示两条电泳条带，序列长度分别为 106bp、295bp ;部分样本显不为一条电泳条带，序列长度为401bp ;剩下的样本显不为三条 电泳条带，序列长度分别为l〇6bp、295bp及401bp。
[0042] 3、克隆测序及序列分析
[0043] 根据PCR - RFLP分析结果，分别将显示不同电泳条带的样本的PCR扩增产物用 琼脂糖凝胶回收试剂盒（天根生化科技有限公司）回收纯化，回收的DNA片段连接载体 PMD-19T(宝生物工程（大连）有限公司）后，参照Cohen等的方法（Proc Natl AcadSci， 69:2110)，将连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，根据载体上的羧卞青霉素抗性标 记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的Τ7和SP6启动子 序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明不同样本的扩增片段长度均为401bp， 只存在一个脱氧核糖核苷酸的差异（C/T)。
[0044] 根据测序结果和PCR - RFLP结果，对基因型进行如下限定：
[0045] 若该位点的等位基因为C，其纯合体基因型为CC，PCR -RFLP检测为两条电泳条带， 序列长度分别为l〇6bp、295bp ;
[0046] 若该位点的等位基因为T，其纯合体基因型为TT，PCR -RFLP检测为一条电泳条带， 序列长度为401bp ;
[0047] 该位点杂合体基因型为CT，PCR - RFLP检测为三条电泳条带，序列长度分别为 106bp、295bp 及 401bp。
[0048] 4、绿壳蛋鸡啄羽行为检测试剂盒的制备
[0049] 绿壳蛋鸡啄羽行为等位基因检测试剂盒包括：一对引物，其中一个引物的核苷酸 序列是Seq ID No. 1，另一个引物的核苷酸序列是Seq ID No. 2;限制性核酸内切酶AcuI; 步骤1中PCR反应体系中的所有试剂和步骤2中酶切反应体系中的所有试剂。
[0050] 二、鸡只基因型与啄羽行为的关联分析
[0051] 利用绿壳蛋鸡啄羽行为检测试剂盒进行检测。以待检测鸡只的基因组DNA为模 板，按照步骤一中1进行PCR扩增，按照步骤一中2进行RFLP分析。检测鸡只的羽毛评分 情况，分析鸡只基因型与啄羽性状的关联性。
[0052] 鸡只基因型与啄羽性状的关联如表1所示。在所检测的122只鸡中，CC基因型26 只，CT基因型27只，TT基因型93只，TT型和CC型啄羽性状之间具有显著差异。
[0053] 以上结果证明了 rsl3640917C/T多态与鸡只啄羽性状密切关联，可以作为鸡只啄 羽性状筛选的分子标记。
[0054] 表lrsl3640917C/T位点基因型与啄羽性状的关联，分值越低，代表越容易产生啄 羽。
【主权项】
1. 一种绿壳蛋鸡啄羽相关基因检测用试剂盒，其特征在于，包括： 1) 用于PCR扩增以检测rsl3640917基因用的引物对，即上游引物U和下游引物D，其 中： U 如 Seq ID No. 1 所示，即：5' - CACAATGACCACGACAACG - 3' ； D 如 Seq ID No. 2 所示，即：5' - ATCTCACGGAACCCAAATG - 3' ； 2) 限制性核酸内切酶Acul，其序列为： 5' - CTGAAG(N) 16 丨-3' 以及 3' - GACTTC(N) 14 丨-5' 其中箭头所指位置为酶切位点，N表示任何碱基。2. -种根据权利要求1所述试剂盒的实现方法，其特征在于，对待测鸡只的包括 rs 13640917C/T突变在内的基因组DNA为模板，采用所述引物进行PCR扩增，再用限制性核 酸内切酶AcuI酶切所得的PCR扩增产物，电泳检测所得到的酶切产物并判断待测鸡只的 rsl3640917位的脱氧核糖核苷酸是野生型C或突变型T。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的判断具体为：当电泳显示为两条带， 即酶切产物为l〇6bp和295bp两个片段，表示所述待测鸡只的基因型为CC，是野生型纯合 体；当电泳显示为一条带，即酶切产物为401bp -个片段，表示所述待测鸡只的基因型为 TT，是突变型纯合体；当电泳显示为三条带，即酶切产物为106bp、295bp及401bp三个片段， 所述待测鸡只的基因型为CT，是杂合体。4. 根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的PCR扩增，其扩增体系包括：鸡基因 组DNA50ng、上、下游引物lOpmol/L各0. 3yL、Taq Mix7. 5yL，并用CldH2O补充反应体系至 15yL ;PCR反应条件为：95°C变性5min ;循环程序为95°C变性20s，60°C退火30s，72°C延伸 30s，共35个循环；最后72°C延伸lOmin。5. 根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的酶切，其反应体系包括：PCR反应混合 物4 y L、10 X酶切缓冲液I y L、内切酶AcuI IOU/ y L0. 4 y L、ddH204. 6 y L，反应体系总体积 10 y L ;通过恒温水浴37°C孵育1小时。6. 根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的电泳检测是指：对酶切产物进行 1. 5%琼脂糖凝胶电压8V/cm，时间30min的电泳，并通过凝胶成像系统观察结果。
【专利摘要】一种绿壳蛋鸡啄羽相关基因检测用试剂盒及其实现方法，通过对待测鸡只的包括rs13640917C/T突变在内的基因组DNA为模板，采用所述引物进行PCR扩增，再用限制性核酸内切酶AcuI酶切所得的PCR扩增产物，电泳检测所得到的酶切产物并判断待测鸡只的rs13640917位的脱氧核糖核苷酸是野生型C或突变型T。本发明能够快速确定待测鸡只为野生型纯合体、突变型纯合体还是杂合体。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104975097
【申请号】CN201510420030
【发明人】姚俊峰, 王晓亮, 杨长锁, 王敏
【申请人】上海市农业科学院
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年7月17日
文档序号 :
【 9258175 】
技术研发人员：姚俊峰,王晓亮,杨长锁,王敏
技术所有人：上海市农业科学院
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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