一种检测猪达100kg体重日龄的分子标记及其应用的制作方法

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种检测猪达100kg体重日龄的分子标记及其应用。

背景技术：

猪为六畜之首，养猪业在世界尤其是中国国民经济中占有重要地位。猪肉在诸多肉类产品中的比重一直保持在三分之一左右，是人们比较喜爱的副食之一。人们的生活不断改善，传统的养殖技术已经不能满足人们对猪肉的需求量。随着现代育种技术的发展，猪的生产性能显著提高，猪的健康养殖和育肥就显得格外重要。

猪达100kg体重日龄是评估猪生长速度的重要指标，可以间接反映饲料利用率。大量数据表明猪达100kg体重日龄的缩短，生长速度越快，可以减少猪场的生产成本，猪场经济效应会明显提高。遗传力是数量性状的重要参数，根据遗传力的大小，可以预测遗传进展，个体育种值。因此，如何有效的提高猪生长速度，缩短达100kg体重日龄，并提前做出判断，是每个猪场经营者及育种学家追求的目标。

近十年来，分子生物技术的发展为猪的育种提供了一种基于dna变异的新型遗传标记。特别是分子标记辅助选择技术的出现，为显著改善猪的这些数量性状提供可能。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定猪达100kg体重日龄性状的方法。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定猪达100kg体重日龄性状的方法是检测猪个体的基因型是tt基因型还是cc基因型还是tc基因型，根据所述猪个体的基因型确定所述猪个体达100kg体重日龄大小：tt基因型的猪个体达100kg体重日龄多于cc基因型的猪个体，cc基因型的猪个体达100kg体重日龄多于tc基因型的猪个体；

所述cc基因型为bmp4基因第四内含子第267位脱氧核糖核苷酸为c的纯合体；

所述tc基因型为bmp4基因第四内含子第267位脱氧核糖核苷酸为t和c的杂合体；

所述tt基因型为bmp4基因第四内含子第267位脱氧核糖核苷酸为t的纯合体；

所述bmp4基因第四内含子的核苷酸序列如序列表中序列1所示。

上述方法中，所述检测猪个体的基因型是tt基因型还是cc基因型还是tc基因型的方法为如下a)或b)：

a)直接测序猪个体的bmp4基因；

b)测序含有猪bmp4基因第四内含子的第267位脱氧核糖核苷酸的pcr扩增产物；

所述pcr扩增产物所用的引物为如下1)或2)：

1)由序列表中序列2所示的单链dna分子和序列表中序列3所示的单链dna分子组成的引物对a；

2)由序列a所示的单链dna分子和序列b所示的单链dna分子组成的引物对b；

所述序列a为将序列2删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列2具有相同功能的核苷酸；

所述序列b为将序列3删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列3具有相同功能的核苷酸。

本发明的第二个目的是提供检测猪个体的bmp4基因第四内含子的第267位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质的新用途。

本发明提供了检测猪个体的bmp4基因第四内含子的第267位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质在鉴定或辅助鉴定猪个体达100kg体重日龄中的应用。

本发明还提供了检测猪个体的bmp4基因第四内含子的第267位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定猪个体达100kg体重日龄的产品中的应用。

本发明还提供了检测猪个体的bmp4基因第四内含子的第267位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质在猪育种中的应用。

本发明还提供了检测猪个体的bmp4基因第四内含子的第267位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质在制备猪育种的产品中的应用。

本发明还提供了检测猪个体的bmp4基因第四内含子的第267位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质在选育生长速度快和/或猪达100kg体重日龄短的种猪中的应用。

本发明还提供了检测猪个体的bmp4基因第四内含子的第267位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质在制备选育生长速度快和/或猪达100kg体重日龄短的种猪的产品中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定猪达100kg体重日龄性状的产品。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定猪达100kg体重日龄性状的产品为检测猪个体的bmp4基因第四内含子的第267位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质。

上述应用或上述产品中，所述检测猪个体的bmp4基因第四内含子的第267位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质为如下1)或2)或3)或4)：

1)由序列表中序列2所示的单链dna分子和序列表中序列3所示的单链dna分子组成的引物对a；

2)由序列a所示的单链dna分子和序列b所示的单链dna分子组成的引物对b；

所述序列a为将序列2删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列2具有相同功能的核苷酸；

所述序列b为将序列3删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列3具有相同功能的核苷酸；

3)含有1)所述引物对a或2)所述引物对b的pcr试剂；

4)含有1)所述引物对a或2)所述引物对b或3)所述pcr试剂的试剂盒。

本发明的第四个目的是提供一种选育生长速度快和/或猪达100kg体重日龄短的种猪的方法。

本发明提供的选育生长速度快和/或猪达100kg体重日龄短的种猪的方法包括选择tc基因型的猪进行育种；

所述tc基因型为bmp4基因第四内含子第267位脱氧核糖核苷酸为t和c的杂合体；

所述bmp4基因第四内含子的核苷酸序列如序列表中序列1所示。

上述应用或产品或方法中，所述猪bmp4基因第四内含子(序列1)的267位核苷酸也即为猪bmp4基因组(nc_010443.4)的第5992位核苷酸。

本发明发现了猪bmp4基因的第四内含子的t267c位点对猪达100kg体重日龄有显著影响，并基于该snp位点提供了一种鉴定或辅助鉴定猪达100kg体重日龄的方法：基因型为tt的猪个体达100kg体重日龄多于cc基因型的猪个体，cc基因型的猪个体达100kg体重日龄多于tc基因型猪个体。通过试验证明：本发明用bmp4基因的第四内含子的第267位单核苷酸多态性鉴定猪达100kg体重日龄的方法与猪达100kg体重日龄的实际测定结果一致，对选择优良猪种有重要意义。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的猪达100kg体重日龄为自猪出生日起至猪体重达到100kg的时间。

实施例1、一种辅助鉴定猪达100kg体重日龄的方法

一、猪bmp4基因的snp位点的筛选

1、猪耳组织样品dna的提取

分别采集来自河北猪场的32头长白猪的血液样品，样品采集后，保存于75％酒精中，并于-20℃保存。采用苯酚-氯仿抽提法提取血液样品的基因组dna，具体步骤 如下：

(1)耳组织样的准备：剪取大小适中的耳组织样，用生理盐水冲洗掉表面的杂质和血污，放于1.5ml离心管中，用眼科剪剪碎，并向其中加入500ul的组织裂解液(北京百泰科生物技术有限公司；产品编号：au19011)；

(2)根据所剪取的耳组织样的大小，向离心管中加入15～25ul的蛋白酶k(sigma-aldrich；产品编号：sre0005)；

(3)放于水浴摇床上，55℃消化过夜，确保耳组织样消化完全，得到消化彻底的耳组织；

(4)将上述消化彻底的耳组织样于室温放置，加入等体积的tris-饱和酚(江苏宝莱生物科技有限公司)，翻覆颠倒混匀5min；

(5)14000rpm/min离心10min，离心管中会出现分层现象，上层为含有核酸的水相，下层为含有其他杂质的有机相。

(6)利用微量移液器小心吸取上层含核酸的水相，放置于一个新的1.5ml离心管中(为了避免吸起下层的有机相，最好用去除尖头的蓝枪头)，弃下层有机相；

(7)重复步骤(4)～(6)；

(8)向含有水相的离心管中加入等体积的饱和酚：氯仿＝1：1，反复颠倒混匀5min，14000rpm/min离心10min，然后吸取上层液体，放于一个新的1.5ml离心管中；

(9)重复步骤(8)；

(10)向其中加入饱和酚：氯仿：异戊醇的体积比为25：24：1，翻覆颠倒混匀，14000rpm/min离心10min；

(11)吸除上层液体，加入2倍体积的无水乙醇(事先放于-20℃冰箱内预冷)沉淀dna，此时会在离心管内出现丝状或絮状dna沉淀；

(12)用黄色枪头小心的挑出丝状或絮状dna沉淀，放于一个新的1.5ml的ep管，向其中加入70％乙醇(-20℃预冷)500ul，洗涤dna沉淀，温和颠倒30s，弃70％乙醇；

(13)重复步骤(12)；

(14)将含有dna沉淀的离心管放于室温环境中，干燥20～30min；

(15)加入60～80ul的te缓冲液或双蒸水溶解dna沉淀(勿剧烈振荡或离心)，将其保存于-20℃冰箱内。

2、目的片段的扩增及测序

(1)pcr扩增

以步骤1获得的基因组dna为模板，采用上游引物:gggctcggaagaagaataagaa(序列2)和下游引物： gcaaccacatccctctactaccat(序列3)进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。

pcr扩增体系：10×lapcrbuffer2ul，10mmdntpmix1.6ul，上下游引物(10pmol/l)各1ul，lataqdna聚合酶(5u/ul)，基因组dna1ul，ddh2o13.2ul。

pcr反应程序：94℃预变性，5min；94℃变性，30s，58℃退火，30s，72℃延伸，30s，72℃延伸，10min。

(2)pcr产物的回收纯化

利用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)，回收纯化pcr产物，具体操作步骤按照该试剂盒所附带的说明书。

(3)连接反应

将上述纯化回收的pcr扩增产物与pmd18-t载体进行连接。连接反应体系为5μl：pcr回收产物2ul、pmd18-t载体0.5ul、solutioni2.5ul，4℃连接过夜，得到连接产物。

(4)转化

将连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞。具体操作步骤：从-80℃超低温冰箱内取1支dh5α感受态细胞(100μl)，迅速放于冰上，使其融化；将连接产物(体积5ul)加入感受态细胞中，用移液器轻轻反复吹打，使其混匀，放置于冰上，静置30min；放置于42℃水浴中，热击90s，然后立即冰浴2～3min；向其中加入600μl的液体lb培养基(不含氨苄青霉素)；放置于37℃恒温摇床中，以170～200r/min的转速培养1h，使细菌复苏。

(5)阳性克隆鉴定

用移液器吸取50～100μl经过复苏的菌液，均匀涂布于含有氨苄青霉素的琼脂平板上，待菌液完全被吸收后，放于37℃恒温培养箱内30min，使菌液完全被吸收，然后将琼脂平板倒置放于恒温培养箱内，37℃培养过夜。

根据琼脂平板上的菌落生长情况，进行挑菌。向1.5mlep管中加入1ml液体lb培养基，同时向每个ep管中加入2μl的氨苄青霉素，然后用10μl枪头挑取琼脂平板上的白色菌落(选择形状完整，呈圆点形的菌落)共20个，分别放于盛有1ml液体培养基的1.5mlep管中，放于37℃摇床内，以220r/min的转速扩大培养3～4h，待ep管内出现浑浊现象或者白色丝状沉淀时，采用上游引物:gggctcggaagaagaataagaa(序列2)和下游引物：gcaaccacatccctctactaccat(序列3)进行菌液pcr鉴定。

pcr反应体系如下：10×labuffer1ul，dntpmix(2.5mm)0.8ul，上下游引物(pmol/l)各0.5ul，la聚合酶0.1ul，菌液0.5ul，ddh2o6.6ul，总体系为10ul。

pcr反应结束后，吸取1μlpcr产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝 胶成像仪拍照，初步确定阳性克隆。

(6)测序验证

将经过pcr扩增初步鉴定为阳性克隆的菌液送交上海英潍捷基有限公司进行测序。

(7)snp位点(t267c位点)的获得

根据上述多个测序结果，利用dnaman软件进行比对，得到差异位点即为snp位点(t267c位点)，为猪bmp4基因第四内含子(序列1)的267位核苷酸，也即为猪bmp4基因组(nc_010443.4)的第5992位核苷酸。

在猪bmp4基因第四内含子(序列1)的t267c位点的碱基均为t的个体，该个体为纯合型个体，将该个体的基因型命名为纯合tt基因型；猪bmp4基因第四内含子(序列1)的t267c位点的碱基均为c的个体，该个体为纯合型个体，将该个体的基因型命名为纯合cc基因型；猪bmp4基因第四内含子(序列1)的t267c位点的碱基为t和c的个体，该个体为杂合型个体，将该个体的基因型命名为杂合tc基因型。

二、猪bmp4基因的t267c位点与猪达100kg体重日龄的相关性分析

为确定猪bmp4基因的t267c位点与猪达100kg体重日龄是否相关，以河北猪场的383头大白猪为实验材料，按照上述步骤一中的方法确定每个猪个体的基因型为tt基因型、cc基因型还是tc基因型，并根据猪的基因型确定猪达100kg体重日龄：tt基因型的猪个体达100kg体重日龄多于cc基因型的猪个体，cc基因型的猪个体达100kg体重日龄多于tc基因型的猪个体。

1、基因型

383头猪个体的基因型检测结果表明：5头猪的基因型为cc基因型，360头猪的基因型为tt基因型，18头猪的基因型为tc基因型。猪bmp4基因在检测猪群中的基因型频率及等位基因频率结果如表1所示：由表1可以看出：tt纯合型的基因型频率明显高于cc纯合型和tc杂合型，t等位基因为优势基因。

表1、猪bmp4基因在检测猪群中的基因型频率及等位基因频率

2、猪基因型与猪达100kg体重日龄的关联性分析

利用spss20.0软件对基因型和猪达100kg体重日龄进行统计分析，并做样本间多重比较。

结果如表2所示：snp(t267c)位点对猪达100kg体重日龄有显著影响，tt基 因型的猪达100kg体重日龄多于cc基因型的猪个体，cc基因型的猪达100kg体重日龄多于tc基因型的猪个体，且tt基因型的猪达100kg体重日龄显著多于tc基因型5.83天左右。所以在实际的猪育种中，tc基因型猪具有更快的生长速度。

表2、猪bmp4基因第四内含子的单核苷酸多态性与达100kg体重日龄关联性分析

备注:表中用不同小写字母表示差异显著(p<0.05)，相同字母表示差异不显著(p>0.05)，数值用最小二乘均值±标准误。

综上所述，可以通过确定猪bmp4基因第四内含子的t267c位点的核苷酸来确定猪个体为tt基因型还是tc基因型还是cc基因型，从而辅助鉴定猪达100kg体重日龄：tt基因型的猪达100kg体重日龄多于cc基因型的猪个体，cc基因型的猪达100kg体重日龄多于tc基因型的猪个体；

tt基因型为猪bmp4基因第四内含子第267位的核苷酸为t的纯合体；

cc基因型为猪bmp4基因第四内含子第267位的核苷酸为c的纯合体；

tc基因型为猪bmp4基因第四内含子第267位的核苷酸为c和t的杂合体。

bmp4基因第四内含子的核苷酸序列如序列表中序列1所示。