一种用于激活前列腺癌特异性免疫反应的试剂盒的制作方法
[0041] 如上述方法分离外周血单核细胞，在贴壁培养皿中短暂培养，分离能够贴壁的细 胞。悬浮细胞按密度3.OXlOVml接种培养。每隔两天倍比添加含lOOOU/ml比-2的扩增 培养基。至培养第五天添加IFN-丫，第六天加入IL-Ia与CD3。
[0042] 将上述获得的抗原肤负载DCl与T细胞混合培养。每隔两天倍比添加含lOOOU/ml 的扩增培养基。混合培养开始后第四天，再次负载前列腺癌特异性抗原肤。将CTkTP试剂 盒中的肿瘤抗原肤粉剂离屯、后（300g，IOmin)，每管分别加入Iml的培养基，充分溶解混匀 后，添加到培养体系中。之后，继续培养至回输，T细胞体外培养时间不应超过20天。
[0043] 如图1所示，经过诱导，本发明试剂盒制备的DCl细胞与常规方案制备的成熟DC 细胞相比，CCR7,CD70,HLA-DR，CD83,CD86等DC细胞与免疫激活相关的标志物的多个表面 标志物成阳性。通过图3也可W看出，本发明制备而得的细胞产物IL12p70表达量大大高 于目前常用的方案，本发明诱导的DCl细胞所分泌的IL-12几乎是常规方案制备的成熟DC 细胞分泌量的10倍。检测试验中，体外诱导实验显示经本试剂盒制备的DCl诱导之后，活 化的T细胞即IFN丫表达阳性的T细胞显著性升高（图5)。
[0044] 本发明试剂盒（细胞培养上清为T细胞培养上清）诱导的DCl细胞的临床应用：
[0045] 应用上述描述的方法，本发明针对前列腺癌病人采用了DCl介导免疫疗法进行治 疗方法简述如下：符合入选标准的患者（III或IV级）在进行化疗之前，取外周血150ml， 按上述的方法进行制备DClW及肿瘤抗原特异性的CTL细胞。
[0046]第屯天在病人的淋己结注射抗原负载的5-10 X IO6个DCl细胞（重悬于Iml生理 盐水），培养第十六，十屯，十八天每天收集IO9个DC与T细胞共培养产物，在生理盐水中重 悬之后，静脉回输。目前已完成5例，正在随访观察中，尚未发现明显的并发症，证实本方法 安全可靠。
[0047]本发明的一种用于激活前列腺癌特异性免疫反应的试剂盒，相对于现有技术具有 如下优点：
[0048]首先，本发明提供了一组用于前列腺癌免疫治疗的特异性抗原多肤组合，该组合 包含了多种前列腺癌细胞的特异性表达抗原的肤段。运些肤段包括了HLA-A2与A3呈递的 序列区域，覆盖了80% W上的已报道的前列腺癌细胞特异性抗原。因此，我们提供了一种新 的前列腺癌特异性抗原多肤组合，有利于激活罹患前列腺癌病人的针对肿瘤细胞的获得性 免疫反应。
[0049]其次，本发明还提供了一种利用本发明的试剂盒体外制备成熟DCl细胞，用于负 载前列腺癌细胞特异性抗原组合的方法。与常用诱导方案相比，利用本发明试剂盒所制备 的产物中拥有成熟表型的DC细胞含量显著性提高（如CD80, CD86, CD4化等表面抗原高表 达）；经过SCD4化刺激之后，DCl细胞IL12P70表达量大大高于通用方案制备细胞的表达 量。由此可见，本发明提供了一个更有效成熟DCl细胞制备方案，所得细胞产物可W用于前 列腺癌细胞特异性抗原负载。
[0050] 最后，本发明提供了一种用于前列腺癌治疗的DCl负载抗原肤的临床应用方案。DCl细胞负载前列腺癌特异性抗原之后，一部分细胞回输至患者体内，另一部分用于体外肿 瘤抗原特异性的诱导细胞毒性T细胞（CTL)，通过体内/体外，主动诱导/被动诱导相结合 的方式激活前列腺癌患者特异性的免疫反应。
[0051]W上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限 制于W上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和 替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和 修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【主权项】
1. 一种用于激活前列腺癌特异性免疫反应的试剂盒，其特征在于，包括有RPMI-1640 培养基、细胞培养上清、GM-CSF、IL-4、INFy以及前列腺癌特异性抗原多肽组合；其中，所 述细胞培养上清为NK细胞与K562细胞共培养上清或者T细胞培养上清；所述前列腺癌特 异性抗原多肽组合为序列如SEQIDNo. 1，SEQIDNo. 2,SEQIDNo. 3,SEQIDNo. 4,SEQ IDNo. 5,SEQIDNo. 6,SEQIDNo. 7,SEQIDNo. 8,SEQIDNo. 9,SEQIDNo. 10,SEQID No. 11及SEQIDNo. 12的多肽组合。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述NK细胞与K562细胞共培养上清通 过将K562细胞与NK细胞按1:2至1:10比例共培养并加入IFNa，24小时后收集培养基上 清而获得。3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述T细胞培养上清的制备过程中，首 先分离外周血单核细胞，淋巴细胞分离液分理单个核细胞，用CD8磁珠分选出CD8+T细胞 后，接种至培养基中，加入⑶3⑶28Beads，24h后加入等量培养基，48h后收集T细胞培养上 清。4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，利用试剂盒激活前列腺癌病人肿瘤特 异性免疫反应包括以下步骤： 步骤一，分离病人外周血中的单核细胞，细胞短暂贴壁培养之后，移除悬浮细胞，加入 诱导剂GM-CSF和IL-4培养两天，培养第3天，第5天更换一半量的培养基，并加入前列腺 癌特异性抗原多肽组合，获得负载有前列腺癌特异性抗原多肽组合的成熟DC细胞； 步骤二，将所述步骤一中制得的成熟DC细胞用INFy以及所述的NK细胞与K562细胞 共培养上清进一步培养诱导两天，使所述的成熟DC细胞分化为DCl细胞； 步骤三，利用步骤二所获得的DCl细胞进行体内主动诱导和/或体外被动诱导。5. 根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述NK细胞来源于人类脐带血。6. 根据权利要求1或3所述的试剂盒，其特征在于，所述T细胞培养上清为利用自体或 异体T细胞获得。7. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述步骤三中的体内主动诱导过程为 将所述步骤二所获得的DCl细胞回输到病人体内。8. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述步骤三中的体外被动诱导过程为 将所述步骤二所获得的DCl细胞与T细胞混合培养，并再次负载前列腺癌特异性抗原多肽， 然后收集细胞，回输到病人体内。9. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括有GGT551培养基、DMEM/F12培 养基。
【专利摘要】本发明提供了一种用于激活前列腺癌特异性免疫反应的试剂盒，包括有RPMI-1640培养基、细胞培养上清、GM-CSF、IL-4、INFγ以及前列腺癌特异性抗原多肽组合；所述细胞培养上清为NK细胞与K562细胞共培养上清或者T细胞培养上清；所述前列腺癌特异性抗原多肽组合为SSX-2-A2、PIWIL2-A2、PAP-A2、PSA-A2、PSA-A3、hTERT-A2、hTERT-A3、Survivin-A2、Survivin-A3、PSCA-A2、COX-2-A2/3及MTA1-A2抗原多肽；本发明的试剂盒可以高效地以主动诱导/被动诱导相结合的方式激活前列腺癌病人特异性的免疫反应。
【IPC分类】A61P35/00, A61K39/00, C12N5/0784, C12N5/0783
【公开号】CN105219718
【申请号】CN201510684998
【发明人】李伟, 叶圣勤, 汪鑫, 瞿苏
【申请人】上海隆耀生物科技有限公司
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年10月20日
文档序号 :
【 9466807 】
技术研发人员：李伟,叶圣勤,汪鑫,瞿苏
技术所有人：上海隆耀生物科技有限公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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