一种用于激活头颈部癌特异性免疫反应的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种增强抗癌免疫的试剂盒，尤其设及一种用于激活头颈部癌特异性 免疫反应的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 头颈部肿瘤包括源于除眼、脑、耳、甲状腺和食道外头颈部任何组织或器官的肿 瘤，应包括颈部肿瘤、耳鼻喉科肿瘤W及口腔颂面部肿瘤=大部分。颈部肿瘤在综合性医院 属于普通外科，比较常见的就是甲状腺肿瘤；耳鼻喉科肿瘤常见的有喉癌、副鼻窦癌等；口 腔颂面部肿瘤常见的为各种口腔癌，如舌癌、牙銀癌、颊癌等。因此，头颈部所发生的肿瘤， 其原发部位和病理类型之多，居全身肿瘤之首。超过90%的头颈部肿瘤为鱗状细胞癌。最 近10年全球头颈部鱗状细胞癌（SCCHN)的发病率明显上升，特别是在女性中。
[0003] 自进入二十一世纪W来，分子生物学与免疫学的长足进步为临床肿瘤治疗提供了 新的策略。通过分子生物学的手段已鉴定出大量的肿瘤细胞特异性的抗原，并通过生物信 息学的手段分析出其被免疫细胞识别的位点，运为重建患者的肿瘤特异性免疫反应带来的 可能。但是最近十年W来的一系列临床试验结果显示，W肿瘤特异性抗原肤为基础的肿瘤 疫苗的临床效果令人失望，其中一个重要的原因是抗原提呈过程的缺陷。
[0004] XiZhao等人用慢病毒感染的DC细胞使其持续性高表达外源性IL12,发现DC.IL12 细胞能够高效的诱导抗原特异性CTL细胞的产生，将DC.IL12与肿瘤抗原肤回输至小鼠体 内可显著性的缩小肿瘤肿块。感染空载病毒的DC细胞并不能有效的激发相应的免疫反应， 回输后对小鼠的肿瘤大小无显著性的影响。该研究提示了高表达IL12的DC细胞对于肿瘤 疫苗发挥其抗癌临床作用的重要性。 阳0化]DC细胞是哺乳类动物体内具有抗原提呈能力的一类细胞，其主要功能是摄取、加 工处理和递呈抗原，激活或调节适应性免疫应答。T细胞因此被激活而生成MHC-I类限制性 CD8阳性细胞毒性T细胞（切totoxicTIympho巧te，CTL)和MHC-II类限制性的CD4阳性的 一型T辅助细胞（typelThelper,Thl)。一型极化树突状细胞（Typel化IarizedDen^itic cell,DC1)是成熟DC细胞的一类亚群，具有强有力的免疫激活能力。DCl细胞的重要的特 征是高表达IL12P70W及免疫激活共刺激分子，可高效的激活抗原特异性的CD8+T细胞和 CD4+Thl细胞相关的免疫反应。Ro化ieB.Mailliard等证实了DCl体外诱导黑色素瘤抗原 特异性的CTL细胞的能力可达到正常的成熟DC细胞的40倍W上。A化ianaTLarregina 等人还发现DCl细胞诱导B16黑色素瘤抗原特异性CD4+辅助性T细胞，并且促进CD4+辅 助性T细胞对肿瘤组织的浸润。因此，高表达IL12的DCl细胞负载肿瘤特异性抗原肤可W 为增强抗原肤为基础的肿瘤治疗疗效提供了一种策略，但现有技术中还没有能够相应的、 成熟的并适用于激活头颈部癌病人特异性免疫反应的试剂盒。
【发明内容】
[0006] 本发明为解决现有技术中的上述问题提出一种试剂盒用于头颈部癌的临床治疗。 体外诱导肿瘤患者自体的DC细胞，获得富集DCl细胞的产物；DCl细胞负载肿瘤特异性肤 段组合，可W用于体外或体内的肿瘤抗原特异性的细胞毒性T细胞的诱导。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明所提供的技术措施为：
[0008] 本发明提供了 一种用于激活头颈部癌特异性免疫反应的试剂盒，包括有 RPMI-1640培养基、细胞培养上清、GM-CSF、比-4、INF丫W及头颈部癌特异性抗原多肤组 合；其中，所述细胞培养上清为NK细胞与K562细胞共培养上清或者T细胞培养上清；所述 头颈部癌特异性抗原多肤组合包括MAGE-A1-A2、MAGE-A1-A3、MAGE-A3-A2、MAGE-A4-A2/3、 CEA-A2、hTERT-A2、hTERT-A3、Survivin-A2 及Survivin-A3 抗原多肤，其多肤序列分别如 沈QIDNo. 1，沈QIDNo. 2,沈QIDNo. 3,沈QIDNo. 4,沈QIDNo. 5,沈QIDNo. 6,沈Q IDNo. 7,SEQIDNo. 8 及沈QIDNo. 9 所示。
[0009] 为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：
[0010] 优选地，NK细胞与K562细胞共培养上清通过将K562细胞与NK细胞按1:2至1:10 比例共培养并加入IFNa，24小时后收集培养基上清而获得。 W11] 优选地，所述T细胞培养上清的制备过程中，首先分离外周血单核细胞，淋己 细胞分离液分理单个核细胞，用CD8磁珠分选出CD8+T细胞后，接种至培养基中，加入 CD3CD28Beads，2地后加入等量培养基，4化后收集T细胞培养上清。
[0012] 优选地，利用试剂盒激活头颈部癌病人肿瘤特异性免疫反应包括W下步骤：
[0013] 步骤一，分离病人外周血中的单核细胞，细胞短暂贴壁培养之后，移除悬浮细胞， 加入诱导剂GM-CSF和IL-4培养两天，培养第3天，第5天更换一半量的培养基，并加入头 颈部癌特异性抗原多肤组合，获得负载有头颈部癌特异性抗原多肤组合的成熟DC细胞；
[0014] 步骤二，将所述步骤一中制得的成熟DC细胞用INF丫W及所述的NK细胞与K562 细胞共培养上清进一步培养诱导两天，使所述的成熟DC细胞分化为DCl细胞；
[0015] 步骤=，利用步骤二所获得的DCl细胞进行体内主动诱导和/或体外被动诱导。
[0016] 优选地，所述NK细胞来源于人类厮带血。
[0017] 优选地，所述T细胞培养上清为利用自体或异体T细胞获得。
[0018] 优选地，所述步骤=中的体内主动诱导过程为将所述步骤二所获得的DCl细胞回 输到病人体内。
[0019] 优选地，所述步骤=中的体外被动诱导过程为将所述步骤二所获得的DCl细胞与 T细胞混合培养，并再次负载头颈部癌特异性抗原多肤，然后收集细胞，回输到病人体内。
[0020] 优选地，试剂盒还可W包括GG巧51培养基、DMEM/F12培养基或DMEM培养基。
[0021] 本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，本发明的技术效果体现在W下几个 方面：
[0022] 首先，本发明提供了一组用于头颈部癌免疫治疗的特异性抗原多肤组合，该组合 包含了多种头颈部癌细胞的特异性表达抗原的肤段。运些肤段包括了HLA-A2与A3呈递的 序列区域，覆盖了 80%W上的已报道的头颈部癌细胞特异性抗原。因此，我们提供了一种新 的头颈部癌特异性抗原多肤组合，有利于激活罹患头颈部癌病人的针对肿瘤细胞的获得性 免疫反应。
[0023] 其次，本发明还提供了一种利用本发明的试剂盒，体外制备成熟DCl细胞，用于负 载头颈部癌细胞特异性抗原组合的方法。与常用诱导方案相比，利用本发明试剂盒所制备 的产物中拥有成熟表型的DC细胞含量显著性提高（如CD80,CD86,CD4化等表面抗原高表 达）；经过SCD4化刺激之后，DCl细胞IL12P70表达量大大高于通用方案制备细胞的表达 量。由此可见，本发明提供了一个更有效成熟DCl细胞制备方案，所得细胞产物可W用于头 颈部癌细胞特异性抗原负载。
[0024] 最后，本发明提供了一种用于头颈部癌治疗的DCl负载抗原肤的临床应用方案。 DCl细胞负载肿瘤特异性抗原之后，一部分细胞回输至患者体内，另一部分用于体外肿瘤抗 原特异性的诱导细胞毒性T细胞（CTL)，通过体内/体外，主动诱导/被动诱导相结合的方 式激活头颈部癌病人特异性的免疫反应。
【附图说
文档序号 :
【 9466805 】
技术研发人员：李伟,叶圣勤,汪鑫,瞿苏
技术所有人：上海隆耀生物科技有限公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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