一种用于激活前列腺癌特异性免疫反应的试剂盒的制作方法
[0024] 最后，本发明提供了一种用于前列腺癌治疗的DCl负载抗原肤的临床应用方案。 DCl细胞负载肿瘤特异性抗原之后，一部分细胞回输至患者体内，另一部分用于体外肿瘤抗 原特异性的诱导细胞毒性T细胞（CTL)，通过体内/体外，主动诱导/被动诱导相结合的方 式激活前列腺癌病人特异性的免疫反应。
【附图说明】
[00巧]图1为利用本发明的试剂盒（细胞培养上清为NK细胞与K562细胞共培养上清） 制备的DCl细胞与常规方案制备的成熟DC细胞相比，CCR7,CD70,HLA-DR，CD83,CD86等DC 细胞与免疫激活相关的标志物表达量情况；
[0026] 图2为本发明的试剂盒（细胞培养上清为T细胞培养上清）制备的DCl细胞（10% 和40 %比例的T细胞培养上清）与常规方案制备的对照DC细胞相比，CD11C，CD70，HLA-DR， CD83,CD86等DC细胞与免疫激活相关的标志物表达量情况；
[0027] 图3为经过SCD40L激活之后，本发明试剂盒（细胞培养上清为NK细胞与K562细 胞共培养上清）制备的DCl细胞所分泌的IL-12与常规方案制备的成熟DC细胞分泌量之 对比；
[0028] 图4为经过SCD4化激活之后，本发明试剂盒（细胞培养上清为T细胞培养上清） 制备的DCl细胞（10%和40%比例的T细胞培养上清）所分泌的IL-12与常规方案制备的 成熟DC细胞分泌量之对比；
[0029] 图5为本发明试剂盒（细胞培养上清为NK细胞与K562细胞共培养上清）制备的 DCl细胞诱导T细胞之后，ELIspot试验中IFN丫分泌水平与常见方案制备的DC细胞诱导 之对比；
[0030] 图6为本发明试剂盒（细胞培养上清为T细胞培养上清）制备的DCl细胞（10% 和40%比例的T细胞上清）诱导T细胞之后，ELIspot试验中IFN丫分泌水平与常见方案 制备的DC细胞诱导之对比。
【具体实施方式】
[0031] 本发明提供了 一种用于激活前列腺癌特异性免疫反应的试剂盒，包括有 RPMI-1640培养基、细胞培养上清、GM-CSF、比-4、INF丫W及前列腺癌特异性抗原多肤组 合；其中，所述细胞培养上清为NK细胞与K562细胞共培养上清或者T细胞培养上清；所 述前列腺癌特异性抗原多肤组合包括SSX-2-A2、PIWIL2-A2、PAP-A2、PSA-A2、PSA-A3、 hTERT-A2、hTERT-A3、Survivin-A2、Survivin-A3、PSCA-A2、C0X-2-A2/3 及MTA1-A2 抗原 多肤，其多肤序列分别如SEQIDNo. 1，SEQIDNo. 2,SEQIDNo. 3,SEQIDNo. 4,SEQID No. 5,SEQIDNo. 6,SEQIDNo. 7,SEQIDNo. 8,SEQIDNo. 9,SEQIDNo. 10,沈QIDNo. 11 及沈QIDNo. 12所示。
[0032] 下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，W使更好的理解本发明， 但是下述实施例并不限制本发明范围。
[0033] 实施例一（细胞培养上清为T细胞培养上清）
[0034] 在利用本发明的试剂盒激活前列腺癌病人特异性免疫反应时，首先进行成人外周 血来源的一型极化树突状细胞的制备（typeIpolarizedden化iticcell,DC1)。外周血 单个核细胞分离参照根据化nuleit等（GeneTher. 2003 10(3))所述的方法。首先用通 过Ficoll-Hypaque密度梯度离屯、分离外周血单个核细胞，并收集血浆用于后续的培养。按 密度3.OXlOVml，将细胞接种至T75培养瓶中，并在GG巧51培养基中加入10%血浆，置于 37. (TC、饱和湿度、5%C〇2环境中培养。培养化后，洗去悬浮的淋己细胞，加入含GM-CSF和 IL-4 1000IU/mlW及10%血浆的DMEM/F12培养基。贴壁细胞培养第3天，第5天更换一 半量的培养基。培养第五天，更换含5 %血浆培养基并加入T细胞上清10%，并按照终浓度 加入加入IFNa，培养二十小时之后再加入20ug/ml的poly-I:C。如图2所示，经过6天的 诱导，制备产物显示出了明显的DC细胞的表型，流式细胞术检测结果显示CD83,CD86等与 免疫激活相关的标志物达到了 95%W上，说明制备产物中DC细胞纯度极高。通过图4也 可W看出，DCl细胞经过SCD4化刺激之后，高表达IL12,由本发明试剂盒制备的DC细胞表 达的IL12量大约是常规方案的10倍（10%T-DC)。检测试验中，第五天加入10%或40% T细胞上清诱导，获得的DCl细胞经过SCD4化激活的之后与T细胞共培养。ELIspot试验 (图6)显示IFNy表达阳性的T细胞的数量高于普通DC细胞诱导的数量。
[0035] 培养至第六天收集细胞即为DCl细胞。DCl细胞培养至第六天，将试剂盒中的各个 肿瘤抗原肤段粉剂离屯、后（300g，10min)，每支分别溶于200ulDMEM/F12培养基中（每个肤 2ug/ml)，充分混匀后加入到DCl中，解育化。收集的DCl细胞分为两份，每份至少IO6个细 胞，可W用于直接与肤混合回输病人体内，或用于体外诱导CTL细胞。DCl细胞体外诱导肿 瘤抗原特异性CTL细胞时，如上述方法分离外周血单核细胞，在贴壁培养皿中短暂培养，分 离能够贴壁的细胞。悬浮细胞按密度3.OXioVml接种培养。每隔两天倍比添加RPMI1640 培养基。至培养第五天和第六天，分别加入添加激活试剂IFN-丫、CD3和ILl-Q混合液各 1ml。将获得的抗原肤负载DCl与T细胞混合培养。每隔两天倍比添加RPMI1640培养基。 混合培养开始后第四天，再次负载前列腺癌特异性抗原肤。将试剂盒中的肿瘤抗原肤粉剂 离屯、后（300g，IOmin)，每管分别加入Iml的GG巧51培养基，充分溶解混匀后，添加到培养体 系中。之后，继续培养至回输，T细胞体外培养时间不应超过18天。
[0036] 本发明试剂盒（细胞培养上清为T细胞培养上清）诱导的DCl细胞的临床应用：
[0037] 应用上述描述的方法，本发明针对前列腺癌病人采用了DCl介导免疫疗法进行治 疗方法简述如下：符合入选标准的患者（III或IV级）在进行化疗之前，取外周血150ml， 按上述的方法进行制备DClW及肿瘤抗原特异性的CTL细胞。
[0038] 第六天在病人的淋己结注射抗原负载的5-10XIO6个DCl细胞（重悬于Iml生理 盐水），培养第十六，十屯，十八天每天收集IO9个DC与T细胞共培养产物，在生理盐水中重 悬之后，静脉回输。目前已完成6例，正在随访观察中，尚未发现明显的并发症，证实本方法 安全可靠。
[0039] 实施例二（细胞培养上清为NK细胞与K562细胞共培养上清）
[0040] 外周血单个核细胞分离参照根据化nuleit等（GeneTher. 2003 10(3))所述的 方法。首先用通过Ficoll-Hypaque密度梯度离屯、分离外周血单个核细胞，并收集血浆用 于后续的培养。加入比-2(2000U/ml)W及IL15(2ng/ml)。每两至S天倍比加入培养基， 并等量补加因子。至第十二天收集。诱导完成之后，NK细胞按l-3Xl〇Vml接种至培养基 RPMI1640 中，加入IFNa(lOOOUI/ml)并W0. 5-1. 5Xl〇5/ml密度接种K562 细胞（可替换 为K562-NK细胞）混合培养，收集激活24-48小时过程中的培养基上清，过滤之后-80度冻 存或直接用于DCl细胞的制备。外周血单个核细胞按密度3.OXlOVml，将细胞接种至T75 培养瓶中，并在含lOOOU/mlIL-2扩增培养基中加入10%血浆，置于37. 0°C、饱和湿度、5% 雌环境中培养。培养化后，洗去悬浮的淋己细胞，加入含GM-CSF和比-4lOOOU/mlW及 10%血浆的培养基。贴壁细胞培养第3天，第5天更换一半量的培养基。培养第六天，更换 含5 %血浆培养基并加入NK细胞上清10 %，并按照终浓度lOOOUI/ml加入IFN丫，培养二十
文档序号 :
【 9466807 】
技术研发人员：李伟,叶圣勤,汪鑫,瞿苏
技术所有人：上海隆耀生物科技有限公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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