产生免疫调节细胞之方法、依该方法所制备之细胞及其应用
[0021] 第8图显示⑶14+单核细胞为HGF对T淋巴细胞功能之免疫调节作用所必须。 第8A&8B图：c-Met之表达，于T淋巴细胞株（Jurkat)、单核细胞株（U937)、及从外周血白 细胞所纯化之初级⑶14+细胞（B ;n = 7) ;MFI，荧光强度平均值。第8C图：外周血白细 胞（白色柱）或去除⑶14+细胞之外周血白细胞（黑色柱）单独培养或经抗-⑶3/28珠 粒刺激，经rhHGF处理或否；n = 15。经rhHGF处理之外周血白细胞之增殖程度，以对经 抗-⑶3/28-活化之外周血白细胞或去除⑶14+细胞之外周血白细胞之相对百分比呈现； a, p〈0. 01 ;b，p〈0. 05与以HGF处理之经抗-⑶3/28-活化之外周血白细胞相较。第8D图： ⑶4+T细胞之增殖，单独培养或经抗-⑶3/28珠粒刺激，经rhHGF处理之⑶14+细胞处理或 否，培养72小时（⑶14+与⑶4+T细胞之比例：1/10、1/5、1/2、1/1)。将经刺激之⑶4+T细胞 之增殖作用设定为100 %，其定义为以流式细胞仪分析经CFSE染色之⑶4+T细胞有>90 % 产生细胞分裂；a, p〈0. 05线性趋势。第8E图：与经rhHGF处理之⑶14+细胞共培养与否之 经抗-⑶3/28-活化之⑶4+T细胞之IFN-y、IL-4及IL-13之胞内生成。T细胞之总数设为 100%。除非另有说明，所有实验数据均来自3次独立实验之平均，并以平均值土SEM表示； #，p〈0. 05 ;*，p〈0. 001，除非另行说明，否则均与对照组比较。
[0022] 第9A图显示⑶14+细胞上表达之树突细胞（DC) -及巨噬细胞-相关之表面分子， 以rhHGF处理（灰色及斜线柱）、未以rhHGF处理（黑色柱），以流式细胞仪分析72小时培 养物。同位素对照组（白色柱）之MFI表达量设为1。所有实验数据均来自3次独立实验 之平均，并以平均值土SEM表示。第9B图显示外周血白细胞上之⑶14及⑶16之表达，以 rhHGF处理或否，以流式细胞仪分析，n = 8。
[0023] 第10图显示HGF系增加单核细胞中IL-10生成量。第10A图：Thl/2之细胞因 子图谱，CD14+细胞单独培养3日（白色柱）、与间充质干细胞共培养3日（黑色柱），以细 胞因子定量阵列检测（n = 1)。第10B图：⑶14+细胞之IL-10生成量，以rhHGF、MSC-CM、 siHGF-MSC-CM处理或否，以ELISA测量。第10C图：接受rmHGF注射之小鼠之骨髓及脾细 胞之产生IL-10之单核细胞群（IL10+⑶llb+细胞）。细胞总数设为100%。所有实验数据 均来自3次独立实验之平均，并以平均值土SEM表示；#，p〈0. 05 ;除非另行说明，否则均与 对照组比较。
[0024] 第11图显示⑶14+单核细胞经HGF诱导之IL-10生成系经由ERK1/2途径所调 控。第11A图：以RT-PCR于预定时间点检测经rhHGF处理之U937细胞之IL-10表达，并以 0-肌动蛋白作为内部对照组。第11B图：以蛋白质印迹法检测经rhHGF处理之U937细胞 之磷酸化之（P_) ERK1/2、p-STAT3、p-p38、及 p-AKT 之表达，并以 ERK1/2、STAT3、p38、AKT、 及a-微管蛋白作为内部对照组。第11C图：经rhHGF处理，并以ERK1/2抑制剂U0126、 P38MAPK抑制剂SB203580、或STAT3抑制剂cpdl88预处理之U937细胞之IL-10基因表达， 以RT-PCR检测。第11D图：以抑制剂U0126或SB203580预处理，并以rhHGF处理（黑色 柱）或未以rhHGF处理（白色柱）之U937细胞之IL-10蛋白质表达；n = 3 ;数据以平均值 土SEM表现；卞，p〈0. 01 ;*，p〈0. 001，与对照组相较。
[0025] 第12图显示HGF在⑶14+单核细胞中诱发IL-10生成之机制。
[0026] 发明详述
[0027] 本发明系提供一种产生免疫调节细胞之方法，包括：以肝细胞生长因子（HGF)处 理外周单个核细胞，以诱发该外周单个核细胞分化成免疫调节性白细胞。
[0028] 该肝细胞生长因子（HGF)可为重组蛋白质，亦可为天然蛋白质，例如由间充质干 细胞或其它细胞系所产生。于一实施例中，HGF来自间充质干细胞，HGF为一种来自间充质 干细胞之分泌蛋白质。于一实施例中，间充质干细胞来自哺乳动物，举例但非限制，例如： 人、猴、大鼠、小鼠、猪、兔、狗、猫等。
[0029] 于本发明之方法中，可藉由提供HGF或提供间充质干细胞与外周单个核细胞接触 而达成HGF疗法。于一实施例中，该外周单个核细胞可与间充质干细胞共同培养，间充质干 细胞产生HGF并将其分泌至环境。
[0030] 用于诱导之HGF之浓度可为，举例但非限制，例如每毫升培养基中为3-40纳克 (ng)。于一实施例中，HGF 之浓度可为 5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ ml、40ng/ml或介于上述任两数值之间。于一实施例中，以5_30ng/ml为佳，以10_30ng/ml 为较佳。
[0031] 于本发明中，该外周单个核细胞意指具有圆形细胞核之任何血液细胞。该外周单 个核细胞包括淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜碱性球、及树突细胞。该淋巴细胞由T细 胞、B细胞及天然杀伤淋巴细胞所组成。于一实施例中，该外周单个核细胞来自一哺乳动物。
[0032] HGF可诱导该外周单个核细胞分化成免疫调节性白细胞，例如骨髓衍生的抑制 细胞（myeloid-derived suppressor cell，以下有时简称MDSC或MDSC)、单核细胞等。 于一实施例中，该免疫调节性白细胞可抑制经活化之同种异体淋巴细胞（allogeneic lymphocyte)之增殖。
[0033] 该骨髓衍生的抑制细胞具有多种免疫调节功能，包含例如产生精氨酸酶、产生一 氧化氮合酶、诱导调节型T细胞等。于一实施例中，MDSC可表达细胞标记⑶lib及⑶33,且 不表达⑶14 ;亦即，该骨髓衍生的抑制细胞表现为⑶14_CD1 lb+⑶33+。于一实施例中，藉由 应用本发明之方法，MDSC之量可增加约1. 5至5倍。于一实施例中，在未经处理之外周单 个核细胞中存在微量MDSC，例如约1%，而经HGF处理后可扩增至约3%以上。于一实施例 中，MDSC可扩增成该外周单个核细胞之约3-10%，以约3-5 %为较佳。
[0034] 该单核细胞具有多种免疫调节功能，包含例如产生IL-10、产生抗炎性细胞因 子、调节免疫反应，使其倾向Th2优势型反应（Th2-dominant response)等。尤其是， 藉由应用本发明之方法，可诱导该单核细胞能够产生IL-10(亦即，IL10+)。于一实施 例中，经诱导之单核细胞亦可表达⑶14,而不表达⑶16;亦即，该经诱导之单核细胞表 现为CD14+CD16_IL10+。于一实施例中，藉由本发明之方法所产生的CD14+CD16_IL10+单 核细胞可占外周单个核细胞之约3%以上，而在未经处理之外周单个核细胞中则不存在 ⑶14+CD16_IL10+，仅有⑶14+CD16_IL10_单核细胞存在。于一较佳实施例中，以该外周单个核 细胞总量为基础计算，该⑶14+⑶16_IL10+单核细胞为约5%。
[0035] 本发明亦提供一种免疫调节细胞，系依据前述方法所制备。该免疫调节细胞 衍生自外周单个核细胞，藉由将该外周单个核细胞与间充质干细胞共同培养、及/或以 间充质干细胞分泌之HGF处理，藉此可诱导细胞分化作用。于一实施例中，该免疫调节 细胞为⑶14_CDllb+⑶33+骨髓衍生的抑制细胞。于另一实施例中，该免疫调节细胞为 ⑶14+CD161L10+单核细胞。
[0036] 本发明系提供一种可简单、直接且迅速地由外周单个核细胞产生免疫调节细胞之 方法。该方法可进一步应用于产生可临床应用于自体免疫疾病及器官移植之移植物排斥的 免疫调节细胞。
[0037] 本发明进一步提供一种治疗由异常免疫反应所致疾病之方法。该由异常免 疫反应所致疾病，例如：器官移植之移植物排斥、或自体免疫疾病，包括：系统性红斑 狼疮（system lupus erythematosus)、多发性硬化症（multiple sclerosis)、类风湿 性关节炎（rheumatoid arthritis)、1型糖尿病（typeldiabetes mellitus)、乳糜泻 (coeliac disease)、干燥综合征（Sjdgren'Ssyndrome)、桥本氏甲状腺炎（Hashimoto's thyroiditis)、葛瑞夫兹氏症（Graves' disease)、特发性血小板减少性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura)等。
[0038] 于此治疗方法中，对患有该疾病之患者施用HGF。该患者可为哺乳动物。于一实施 例中，所施用之HGF为蛋白质型式，以间充质干细胞分泌之HGF为佳，以人类来源之间充质 干细胞分泌之HGF为更佳。于另一实施例中，亦可提供一间充质干细胞，其
文档序号 :
【 8460339 】
技术研发人员：颜伶汝,刘柯俊,司徒惠康
技术所有人：财团法人卫生研究院
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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