产生免疫调节细胞之方法、依该方法所制备之细胞及其应用
[0094] 实施例2-⑵：对经活化⑶4+细胞之HGF-所调控之免疫调节作用，⑶14 +单核细 胞为必要
[0095] HGF为c-Met之配体，c-Met为一种酪氨酸激酶。根据前述HGF对经抗-⑶3/28-活 化之外周血白细胞具有抑制作用，但对经PHA-活化之外周血白细胞则否，显示HGF之免疫 调节作用系针对T细胞。然而，初级T细胞上并不表达c-Met (数据未显示于说明书中）， Jurkat细胞，即T细胞血癌细胞株亦无（第8A图）。曾有报导T细胞不表达c-Met，但单核 细胞表达少量c-Met ;单核细胞为⑶14+细胞，包括约10%之人类外周血白细胞，且已知人 类单核细胞性血癌细胞株U937与提供者之外周血白细胞而来之主要CD14+单核细胞均表 达c-Met (第8A及8B图）。
[0096] 上述结果显示，HGF对T细胞之效用可能需要单核细胞作为中间物。为了测试此 假设，将⑶14+细胞由外周血白细胞移除，接着添加rhHGF至经抗-⑶3/28-活化之外周血 白细胞。如第8C图所示，在CD14+细胞被移除的情况下，HGF对于经抗-CD3/28刺激之外 周血白细胞增殖之抑制作用系完全消失。
[0097] 将⑶14+-珠粒筛选之单核细胞以rhHGF处理，并与经抗-⑶3/28-刺激之⑶4+细 胞共培养。如第8D图所示，T细胞之增殖作用可被经HGF-处理之⑶14+细胞所抑制，且该 抑制作用会随作用细胞：标的细胞（⑶14+比⑶4+细胞）之比例增加而增加。然而，HGF之 剂量对于该单核细胞调控之抑制作用并无影响，与第7D图相同。经抗-CD3/28-活化之外 周血白细胞与经HGF-处理之CD14+单核细胞共培养系改变细胞因子图谱，从较高的Thl朝 向Th2环境（第8E图）。CD4+T细胞之胞内Thl(IFN-y)及胞内Th2(IL-4andIL-13)产物 之FACS分析显示，⑶4+T细胞与经HGF-处理之⑶14+细胞共培养会增加IL-4与IL-13之 生成；反之，IFN-y则减少。该等数据显示HGF直接与⑶14+单核细胞产生交互作用，进而 改变了 T细胞的免疫功能。
[0098] 实施例2- (3):HGF可显著诱发IL-10生成
[0099] 单核细胞为导向炎性环境之细胞浸润（cellular influx)之主要成分，可依据环 境刺激而分化成树突细胞或巨噬细胞，以提供促炎特性或抗炎特性。为了研宄HGF是否可 调控CD14+单核细胞之分化，分析其倾向分化为树突细胞系或巨噬细胞系而有表面标记表 达之改变。HGF处理后，无论是与树突细胞相关之标记⑶11b、⑶11c及HLA-DR、或与巨噬 细胞相关之标记⑶206之表达量均未改变（第9A图）。另外，并未测得DC-SIGN、⑶68及 ⑶73之表达。然而，⑶16-细胞之组分轻微增加（第9B图），且该⑶14+单核细胞之亚群已 报导过具有免疫调节性。
[0100] 于第10A图中，与间充质干细胞共培养之⑶14+细胞之细胞因子定量阵列分析显 示，促炎细胞因子（包括IFN-y及TNF-a)生成量显著降低，而抗炎细胞因子（IL-10)则显 著增加。此数据显示，间充质干细胞之免疫抑制效果可来自于降低IFN-y及增加IL-10之 生成。为了进一步确认HGF与单核细胞之IL-10生成增加之间的交互关系，将初级⑶14+细 胞与rhHGF共培养，并测量培养基所含IL-10之浓度。如第10B图所示，经HGF-处理之⑶14+ 细胞、以及经MSC-CM-处理之⑶14+细胞之选择培养基均具有高于基准线之高量IL-10生 成。
[0101] 将mHGF注射至野生型B6小鼠以进行上述效果之体内测试。如第10C图所示，HGF 诱发脾细胞中生成IL-10之单核细胞群之轻微增加，但在骨髓细胞或外周血中则否（数据 未显示）。据此，HGF系与⑶14+单核细胞生成IL-10相关。
[0102] 实施例2-(4) :HGF系经由ERK1/2磷酸化而诱发IL-10分泌
[0103] 进一步研宄HGF诱发单核细胞生成IL-10之机制。将单核细胞株U937以HGF处 理，并检测其于IL-10基因表达之改变。如第11A图所示，IL-10转录子之增加在rhHGF处 理6小时达到高峰，表示HGF与IL-10生成有直接关系。HGF启动许多胞内讯息传导途径及 其下游途径，PI3K/AKT、Ras/ERKl/2、p38/MAPKs、及STAT3亦与调控IL-10基因表达相关。 如第11B图所示，于U937细胞株以HGF处理后，ERK1/2、STAT3、及p38/MAPK之磷酸化增加， 但AKT则否。为了进一步研宄此三种途径，以HGF及特定抑制剂同时处理U937细胞株，抑 制剂包括：U0126 (p-ERKl/2 抑制剂）、SB203580 (p38/MAPK 抑制剂）、及 cpdl88 (pSTAT3 抑制 剂）。结果如第11C及11D图所示，于U0126及SB203580组中，IL-10基因表达以剂量依赖 性之方式减少，但仅有ERK1/2抑制剂在HGF处理后造成IL-10蛋白质生成显著降低。此结 果显示HGF-调控之单核细胞之IL-10生成系经由ERK1/2所调控。
[0104] 如第12图所示，HGF(尤其是间充质干细胞分泌者）作用于CD14+单核细胞以调控 同种异体T细胞之功能，并经由ERK1/2增加IL-10。间充质干细胞所分泌之HGF直接作用 于⑶14+单核细胞（其表达HGF之受体c-Met)，以抑制经活化之⑶4 +细胞增殖作用。此种 ⑶14+单核细胞为间充质干细胞所分泌之HGF对经活化之⑶4 +细胞之抑制效果所必须，该 抑制效果包含增加免疫调控性⑶14+CD16^单核细胞、诱发IL-10生成、调控T细胞之细胞因 子图谱，由Thl导向Th2。就机制上而言，HGF系经由ERK1/2途径而诱发⑶14+单核细胞之 IL-10生成。上述实施例显示了先前技术未知的间充质干细胞之强免疫调节特性之机制，以 及，强调了免疫调节性单核细胞在改变T细胞免疫功能上所扮演的重要角色。
[0105] 值得注意的是，HGF对T细胞增殖的抑制效果并非剂量依赖性，可能是因为单核细 胞上c-Met (HGF之受体）表达量低，因此受体饱和之阀值也相对较低。
[0106] HGF诱发单核细胞中ERK1/2及p38MAPK之磷酸化，且HGF所诱发IL-10生成仅受 ERK1/2抑制剂所阻断，表示Ras/Raf?讯息传导途径与HGF所诱发之单核细胞分泌IL-10有 关。ERK1/2负责在免疫细胞中控制IL-10表达之数种转录因子之磷酸化及活化，包括MAF、 JUN、GATA3、及SMAD4,并非p38之受质。因此，该等转录因子可能在HGF所诱发之单核细胞 生成IL-10中具有关键作用。
[0107] 上述实施例证实HGF可直接且非常迅速地在⑶14+单核细胞（3天内）诱发免疫 调节表型，且细胞仍然为未贴附状态，表示分化尚未开始。循环外周血单核细胞之亚群（为 ⑶14++⑶16〇可产生高量抗炎细胞因子，包括IL-10。循环⑶14+单核细胞为外周血白细胞 之大部分成分，且若免疫调节性单核细胞可迅速地被诱发，该等白细胞可以对循环免疫调 节性细胞整体之量做出更显著的贡献。
[0108] 上述特定实施例之内容系为了详细说明本发明，然而，该等实施例系仅用于说明， 并非意欲限制本发明。熟习本领域之技艺者可理解，在不悖离后附权利要求书所界定之范 畴下针对本发明所进行之各种变化或修改系落入本发明之一部分。
【主权项】
1. 一种产生免疫调节细胞之方法，包括：以肝细胞生长因子处理外周单个核细胞，以 诱发该外周单个核细胞分化成免疫调节性白细胞。
2. 权利要求1的方法，其中，该外周单个核细胞来自哺乳动物。
3. 权利要求1的方法，其中，该肝细胞生长因子为重组蛋白质或天然蛋白质。
4. 权利要求3的方法，其中，该肝细胞生长因子来自间充质干细胞。
5. 权利要求1的方法，其中，该免疫调节性白细胞包括骨髓衍生的抑制细胞、单核细 胞、或前述之组合。
6. 权利要求5的方法，其中，该免疫调节性白细胞抑制经活化之同种异体淋巴细胞之 增殖。
7. 权利要求5的方法，其中，该骨髓衍生的抑制细胞表现为⑶14XDllb+⑶33+。
8. 权利要求5的方法，其中，该骨髓衍生的抑制细胞产生精氨酸酶及一氧化氮合酶。
9. 权利要求5的方法，其中，该骨髓衍生的抑制细胞诱导调节性T细胞。
10. 权利要求5的方法，其中，该单核细胞表现为⑶14 +⑶16_IL10+。
11. 权利要求5的方法，其中，该单核细胞产生IL-10。
12. 权利要求5的方法，其中，该单核细胞产生抗炎细胞因子。
13. 权利要求5的方法，其中，该单核细胞调节免疫反应，使其倾向Th2优势型反应。
14. 一种免疫调节细胞，其依据权利要求1的方法所制备。
15. 权利要求14的免疫调节细胞，其为⑶14TDllb+⑶33+之骨髓衍生的抑制细胞。
16. 权利要求14的免疫调节细胞，其为⑶14 +⑶161L10+之单核细胞。
17. -种治疗由异常免疫反应所致疾病之方法，包括： (a) 对患有该疾病之患者施用肝细胞生长因子； (b) 诱发该患者之外周单个核细胞分化成免疫调节性白细胞；及 (c) 调节该异常免疫反应。
18. 权利要求17的方法，其中，该由异常免疫反应所致疾病包括自体免疫疾病、或器官 移植之移植物排斥。
19. 权利要求18的方法，其中，该自体免疫疾病包括系统性红斑狼疮、多发性硬化症、 类风湿性关节炎、1型糖尿病、乳糜泻、干燥综合征、桥本氏甲状腺炎、葛瑞夫兹氏症、或特发 性血小板减少性紫癜。
20. 权利要求17的方法，其中，该肝细胞生长因子来自间充质干细胞。
【专利摘要】本发明系提供一种简单、直接且迅速的方法以由外周单个核细胞产生免疫调节细胞，该方法包括：以肝细胞生长因子(HGF)处理外周单个核细胞，以诱发该外周单个核细胞分化成免疫调节性白细胞。本发明亦提供一种以前述方法所制备之免疫调节细胞。本发明另提供一种治疗由异常免疫反应所致疾病之方法，包括：对患有该疾病之患者施用肝细胞生长因子；诱发该患者之外周单个核细胞分化成免疫调节性白细胞；及调节该异常免疫反应。
【IPC分类】C12N5-0783
【公开号】CN104781395
【申请号】CN201380047132
【发明人】颜伶汝, 刘柯俊, 司徒惠康
【申请人】财团法人卫生研究院
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2013年9月9日
【公告号】EP2893005A1, US8927278, US20140073569, WO2014039985A1
文档序号 :
【 8460339 】
技术研发人员：颜伶汝,刘柯俊,司徒惠康
技术所有人：财团法人卫生研究院
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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