生物材料性能的保存和储存方法
[0055] 其他MMP抑制剂也可以是有效的，包括，例如，??ΜΡ、PCK3145 (对应于前列腺分泌 蛋白94的氨基酸31-45的合成肽）和马立马司他（BB-2516)。在早期临床研宄中，PCK3145 和马立马司他都是良好耐受的。还可能不需要以一周为间隔的溶液替换，但需要探索软骨 质量与溶液体积的比例。对于不进行溶液替换的长期储存，可能需要高多西环素浓度。
[0056] 实骀设计:
[0057] 获得猪软骨塞并将这些塞在4°C (低温条件）下储存于附加有0-300 μ M多西环素 的不含动物产品的DMEM中。在某些样品中，每周改变介质，如先前研宄中那样（图1-3)， 且对于其他样品，在储存期间不改变介质。比较这两个样品组（即（1)每周改变的介质和 (2)无介质改变）。在某些方面中，一旦将同种异体移植物置于储存中后，需要最小化同种 异体移植物的操作需要。
[0058] 方法:
[0059] 从成年家养约克郡跨农场猪（25Kg)中在死后获取猪膝。获取膝后，将膝置于含有 碘溶液的密封塑料袋中并在冰上转移至实验室用于无菌解剖。使用无菌穿孔制备股骨头软 骨盘状塞。将5个塞的各组置于无菌容器内的储存溶液中，每周替换或不替换基质，持续 1-2 月。
[0060] 代谢活件:
[0061] 使用刃天青还原试验来评估对照和经处理的软骨塞的代谢活性[O' Brien，2000 ; Brockbank，2011]。将组织塞（η = 5/实验/供体）在2ml的DMEM+10% FBS培养基中孵育 一小时以进行平衡，随后在标准细胞培养条件下添加20%刃天青还原试验溶液，持续3小 时。刃天青还原试验试剂是基于代谢活性检测的荧光指示剂。在544nm的激发波长和590nm 的发射波长下通过多模式酶标仪重复测量荧光量。每天进行该评估并持续数天以对组织中 经复温的细胞进行表征（图2)。刃天青在所用浓度下不具有细胞毒性，因此可在多种情况 下测试相同的组织样品。复温后不久（第〇天）的结果显示细胞活力，1-2天后的下降表明 因为凋亡产生的细胞死亡，而上升测量细胞增殖。随后干燥组织塞以获得干重。对于各实 验组和未处理对照，细胞代谢活性表示为每mg干重或每个组织塞的相对荧光单位（RFU)。
[0062] 其他活力评估方法:
[0063] 上文所述代谢试验是主要的活力评估方法；然而，还可进行其他的活力评估试 验。例如，可通过细胞的荧光活/死染色进一步测定细胞活力。还可在通过酶消化从 组织塞中释放细胞后对细胞进行评估并使用基于膜完整性的台盼蓝排除试验进行评估 [Brockbank，2011]。还可将细胞在DMEM中培养至少一周以验证细胞（软骨细胞）实际上 能够在体外粘附并增殖。可对培养物进行细胞计数和数码成像分析。
[0064] 水、蛋白聚糖和胶原含量：材料性能测量后，可将样品冻干以测定水（孔隙）、 蛋白聚糖（S-GAG)和胶原（羟基脯氨酸）含量。基于阿基米德原理分析样品的孔隙 度[Gu, 2004]，使用Farndale (1982)所述方法分析样品的S-GAG并使用Bergman和 Loxley(1970)的方法分析样品的羟基脯氨酸含量。
[0065] 电导率:
[0066] 使用标准设备在零流体流动条件下测量组织电导率[Gu 2002a ;2002b]，该设备 由置于含有各试样的树脂玻璃室周围的电流和电压电极组成。使用4导线方法和Keithley 源表的组合，在〇.〇15mA/cm2的非常低的电流密度下测量跨试样的电阻（R)。电流传感测微 计用于测量试样尺寸，使用以下方程生成相应的电导率：
[0067] X = h/ (RA) (1)
[0068] 其中A是横截面面积，且h是组织试样的厚度。在室温（22°C )下在等渗或低渗磷 酸盐缓冲盐水（PBS，pH7. 4)中进行电导率测量。
[0069] 溶质扩散率:
[0070] 在零流体流动条件下，根据Maroudas (1968) NaCl溶液中组织的电导率（X )与Na+ 和Cl扩散率（D α，α = +，-)相关：
[0071] X = Fc2<i)w(c+D++cTr)/RT， (2)
[0072] 其中F。是法拉第常数，#是水的体积分数（孔隙度），c+是阳离子（Na+)浓度 且是阴离子（Cl 〇浓度，R是气体常数，T是温度。可使用唐南方程（Donnan equation) [Maroudas, 1975]计算 c+和 c、
【主权项】
1. 一种组合物，其包含置于溶液中的生物材料，所述溶液包含至少一种试剂，所述至少 一种试剂降低或防止生物材料性能损失，其中 所述溶液是不含动物产品的溶液， 所述生物材料包括软骨或胞外基质中的软骨细胞，且 所述至少一种试剂包括浓度范围为1.0 nM-ImM的基质金属蛋白酶的酶抑制剂。
2. 如权利要求1所述的组合物，所述生物材料性能包括胞外基质完整性、细胞活力或 其组合，其中，胞外基质完整性包括胞外基质渗透性、胞外基质水含量、胞外基质糖胺聚糖 含量或其任意组合。
3. 如前述权利要求中任一项所述的组合物，所述溶液不包含胎牛血清。
4. 如前述权利要求中任一项所述的组合物，所述不含动物产品的溶液是等渗的胞外型 溶液，或者所述不含动物产品的溶液是等渗的胞内型溶液。
5. 如前述权利要求中任一项所述的组合物，所述酶抑制剂最小化酶活性以降低或防止 生物性能损失，所述生物性能包括胞外基质完整性。
6. 如前述权利要求中任一项所述的组合物，所述基质金属蛋白酶包括一种或多种以下 物质：MMPl、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、 MMP17、MMP19、MMP20、MMP21、MMP23A、MMP23B、MMP24、MMP25、MMP26、MMP27 和 MMP28〇
7. 如前述权利要求中任一项所述的组合物，所述酶抑制剂选自多西环素、??ΜΡ、上调内 源性 ??ΜΡ 的化合物、PCK3145、BB-2516 和 BB-94。
8. -种储存生物材料的方法，包括制备前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，制 备权利要求1所述的组合物包括将所述生物材料置于溶液中，所述溶液包含至少一种降低 或防止生物材料性能损失的试剂。
9. 如权利要求8所述的方法，所述方法还包括在-25 °C至+35 °C范围的温度下在所述溶 液中储存所述生物材料。
10. -种组合物，其包含不含动物产品的溶液，其中 所述溶液包含浓度范围为1. ΟηΜ-1000 μM的至少一种基质金属蛋白酶抑制剂， 所述不含动物产品的溶液是不包含细胞培养基的胞内型溶液，且 所述基质金属蛋白酶抑制剂降低或抑制ΜΜΡ1、ΜΜΡ2、ΜΜΡ3、ΜΜΡ7、ΜΜΡ8、ΜΜΡ9、ΜΜΡ10、 ΜΜΡ11、ΜΜΡ12、ΜΜΡ13、ΜΜΡ14、ΜΜΡ15、ΜΜΡ16、ΜΜΡ17、ΜΜΡ19、ΜΜΡ20、ΜΜΡ21、ΜΜΡ23Α、ΜΜΡ23Β、 ΜΜΡ24、ΜΜΡ25、ΜΜΡ26、ΜΜΡ27、ΜΜΡ28或其任意组合中至少一种的酶活性。
11. 如权利要求11所述的组合物，所述至少一种基质金属蛋白酶抑制剂降低或抑制 ΜΜΡ1、ΜΜΡ8、ΜΜΡ9和ΜΜΡ13中至少两种的酶活性，或者所述至少一种基质金属蛋白酶抑制剂 降低或抑制ΜΜΡ1、ΜΜΡ8、ΜΜΡ9和ΜΜΡ13中至少三种的酶活性。
12. 如权利要求10和11所述的组合物，所述至少一种基质金属蛋白酶抑制剂选自多西 环素、??ΜΡ、上调内源性??ΜΡ的化合物、PCK3145、ΒΒ-2516和ΒΒ-94。
13. 如权利要求10-12所述的组合物，其中，多西环素是所述至少一种基质蛋白酶抑制 剂且浓度为1.0 nM-1000 μ Μ。
14. 如权利要求10-13所述的组合物，所述胞内型溶液还包含营养混合物，所述营养 混合物包含至少一种以下组分：D-葡萄糖、甘氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-半胱氨酸盐酸盐、 L-谷氨酰胺、L-组氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-甲硫氨酸、 L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、胆碱、D-泛酸钙、叶 酸、烟酰胺、吡哆醇、核黄素、硫胺、肌醇、其任何盐或其任意组合。
15. -种包括在低温温度下在权利要求10-14所述的组合物中储存生物材料的方法， 其中 所述组合物包含至少一种添加剂，所述添加剂促进胞外基质完整性和细胞活力的保 留，且 所述至少一种添加剂包括酶抑制剂、氨基酸、多种氨基酸、糖、多种糖、脂质、多种脂质、 维生素、多种维生素，或其任意组合。
【专利摘要】本文描述了增强的用于储存生物材料的组合物和方法。在某些方面中，这些生物材料包括天然和工程改造的真核组织。本文所述方法包括以降低或防止储存期间或从储存中取出生物材料后生物材料性能(如胞外基质完整性、细胞活力或其组合)损失的方式储存这些生物材料。在某些方面中，可在含有防止或降低胞外基质完整性损失的试剂的不含动物产品的溶液中储存这些生物材料。
【IPC分类】C12N5-077, A01N1-02
【公开号】CN104837339
【申请号】CN201380063773
【发明人】K·G·M·布鲁克班克
【申请人】生命线科学有限公司
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2013年10月18日
【公告号】EP2908630A1, US20140113273, WO2014063041A1
文档序号 :
【 8515135 】
技术研发人员：K·G·M·布鲁克班克
技术所有人：生命线科学有限公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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