生物材料性能的保存和储存方法
[0043] 在一些实施方式中，本发明涉及一种组合物，其包含不含动物产品的溶液，该溶液 包含至少一种基质金属蛋白酶抑制剂。在一些实施方式中，该不含动物产品的溶液包含 细胞培养基。在一些实施方式中，该不含动物产品的溶液是不包含细胞培养基的胞内型 溶液。在一些实施方式中，该基质金属蛋白酶抑制剂降低或抑制MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、 MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MMP19、MMP20、MMP21、 MMP23A、MMP23B、MMP24、MMP25、MMP26、MMP27、MMP28 或其任意组合中至少一种的酶活性。 在一些实施方式中，该至少一种基质金属蛋白酶抑制剂降低或抑制MMP1、MMP8、MMP9、MMP13 或其任意组合中至少一种的酶活性。在一些实施方式中，该至少一种基质金属蛋白酶抑制 剂降低或抑制MMP1、MMP8、MMP9、MMP13或其任意组合中至少两种的酶活性。在一些实施 方式中，该至少一种基质金属蛋白酶抑制剂降低或抑制MMP1、MMP8、MMP9、MMP13或其任意 组合中至少三种的酶活性。在一些实施方式中，该至少一种基质金属蛋白酶抑制剂在不含 动物产品的溶液中的浓度范围为1.0 nM至1000 μ M。在一些实施方式中，该至少一种基质 金属蛋白酶抑制剂在不含动物产品的溶液中的浓度范围为IOOnM至100 μΜ。在一些实施 方式中，该至少一种基质金属蛋白酶抑制剂在不含动物产品的溶液中的浓度范围为IpM至 30 μΜ。在一些实施方式中，该至少一种基质金属蛋白酶抑制剂在不含动物产品的溶液中的 浓度范围为IOOpM至20 μΜ。在一些实施方式中，该至少一种基质金属蛋白酶抑制剂在不 含动物产品的溶液中的浓度范围为500ρΜ至10 μΜ。在一些实施方式中，该至少一种基质 金属蛋白酶抑制剂在不含动物产品的溶液中的浓度范围为1 μΜ至5 μΜ。在一些实施方式 中，该至少一种基质金属蛋白酶抑制剂选自：多西环素、??ΜΡ、上调内源性??ΜΡ的化合物、 PCK3145、BB-2516和ΒΒ-94。在一些实施方式中，该至少一种基质金属蛋白酶抑制剂选自： 多西环素、??ΜΡ、上调内源性??ΜΡ的化合物、PCK3145、BB-2516和BB-94。在一些实施方式 中，该基质金属蛋白酶抑制剂是浓度范围为1.0 nM至1000 μ M的多西环素。在一些实施方 式中，该胞内型溶液还包含营养混合物，该营养混合物包含至少一种以下组分：D-葡萄糖、 甘氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-半胱氨酸盐酸盐、L-谷氨酰胺、L-组氨酸盐酸盐、L-异亮氨 酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨 酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、吡哆醇、核黄素、硫胺、肌醇、其任 何盐或其任意组合。在一些实施方式中，该胞内型溶液还包含营养混合物，该营养混合物包 含至少一种以下组分：D-葡萄糖、甘氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-半胱氨酸盐酸盐、L-谷氨酰 胺、L-组氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨 酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、 吡哆醇、核黄素、硫胺、肌醇、其任何盐或其任意组合。
[0044] 在一些实施方式中，本发明涉及一种组合物，其包含溶液中的生物材料，该溶液促 进胞外基质完整性和细胞活力的保留，该溶液包含酶抑制剂。在一些实施方式中，本发明 涉及一种方法，该方法包括使用至少一种促进胞外基质完整性和细胞活力保留的添加剂在 低温温度下在胞内型溶液内储存生物材料。在一些实施方式中，该至少一种添加剂包括酶 抑制剂、氨基酸、多种氨基酸、糖、多种糖、脂质、多种脂质、维生素、多种维生素，或其任意组 合。
[0045] 通过以下实施例可以更好地理解上述内容，提供以下实施例仅是为了说明目的， 而非旨在限制本发明的范围。 实施例
[0046] 给出下列实施例以为本领域的普通技术人员完整地公开和描述本文描述和要求 权利的组合物和方法是如何制备和评价的，这些实施例完全是出于示例目的而不是为了限 制对发明人而言其发明的范围。已经作出了努力以确保数字（含量、温度等）的精确性，但 也应当考虑正常的错误和偏差。除非另外指出，否则，份是重量份，温度按°0表示或是环境 温度，压力为大气压或接近大气压。对反应条件，如组分浓度、所需溶剂、溶剂混合物、温度、 压力和使由所述方法得到的产物纯度和产率最佳化的其他反应范围和条件，可以有许多的 变化和组合。
[0047] 初步研究
[0048] 将样品在多种溶液（例如DMEM、SPS、PBS和UHK)中低温储存28天。随后将这些 样品从储存中取出并评价软骨软骨细胞活力和渗透性（即软骨的胞外基质完整性）。如图 1所示，在样品中评价软骨细胞活力和增殖，所述样品在四种不同溶液中储存28天。通过使 用刃天青还原代谢试验评估活力，与SPS、PBS和UHK中储存的样品相比，DMEM中储存的细 胞显示明显较高的软骨细胞活力。具体而言，图1的数据以平均RFU/6mm塞±lse的形式 表示且*表示p〈〇. 05的显著性差异。从第2天起始的在DMEM与其他溶液中储存的细胞之 间观察到细胞活力方面统计学显著的差异。培养4天后DMEM达到对照水平。未处理的对 照值以平均值（虚线）± Ise (影线）的形式显示于图的顶部。在储存后恢复组织培养（图 1)中，这些结果与软骨基质渗透性缺失之间的相关系数（R2)在4天中增加（示于图3)。这 些数据表明，复杂的胞外型培养基（如DMEM)对于维持软骨细胞功能而言是最佳的（图1)， 所述软骨细胞功能与细胞存活（即细胞活力）相关。此外，将这些样品在两种胞内型溶液 (即SPS和UHK)中储存约一个月导致在生理组织培养条件下恢复后增殖期间代谢较少（图 1)。类似地，将这些样品储存于磷酸盐缓冲盐水（PBS)(-种不含营养物的胞外制剂）中也 显示恢复后组织培养期间的增殖较少。这些观察表明，营养物造成储存在DMEM中的软骨塞 的明显更好的性能（即软骨细胞活力）（图1)。
[0049] 有趣的是，在4天的储存后恢复之后，储存在DMEM中的软骨显示最高的细胞活力 (即RFU活力值）但最低的电导率（mS/cm)。虽然该结果表明DMEM促进最高的细胞活力， 但该结果还表明软骨基质渗透性的最大损失发生在软骨储存于DMEM中时。该观察产生以 下假说，即细胞活力的保留导致影响胞外基质渗透性的细胞来源材料的释放。具体而言，这 些研宄证明了细胞活力保留与软骨基质渗透性损失之间的强关联（R 2= 0. 90)(图2)。图 2具体显示了高细胞活力与软骨基质渗透性和电导率损失之间的相关系数（R2)由于在4种 不同溶液中冷冻储存而在4天的储存后恢复组织培养期间从0. 78升高至0. 90。
[0050] 基于图1和2的数据，在各样品中进一步评价软骨渗透性，所述样品储存在不同的 溶液中。与在其他溶液（即PBS、UHK和SPS)中储存的样品相比，在DMEM中储存28天的样 品（即DMEM 28)表现出显著较低的电导率。图3显示低温储存对软骨渗透性的影响，其通 过测量低温盐水中电导率来评价。数据以平均值± Ise的形式表示且*表示第一天时DMEM 对照与28天后储存组之间p〈0. 05的显著性差异，每个猪供体η = 5个样品。在四个独立 实验中，第28天DMEM组显著较少。因此，这些数据进一步显示将软骨储存于DMEM中时高 细胞活力与低渗透性之间的关联。
[0051] 实施例
[0052] 实施例1 :评价在胞外型溶液中储存期间基质金属蛋白酶(MMP)抑制对于软骨性 能的影响。
[0053] 使用多种浓度的MMP抑制剂（如多西环素）配制不含动物产品的培养基。在 至少一个月的低温储存期间内比较生物材料性能（包括软骨细胞活力、软骨化学、渗透 性和其他生物材料性能）。使用已建立的方法进行生物材料测试[Yao, 2002 ;Gu, 2004 ; Brockbank, 2011 (参见下文参考文献列表）]。
[0054] 多西环素在临床上用于治疗牙周病且是仅有的广泛用于临床使用的MMP抑制剂。 已证明多西环素对于软骨具有有益的体内作用，如降低动物模型和人中的MMP 8、9和13活 性。此外，体外研宄显示多西环素可抑制M
文档序号 :
【 8515135 】
技术研发人员：K·G·M·布鲁克班克
技术所有人：生命线科学有限公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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