突变型番茄及其用于预防体重增加和/或治疗肥胖相关疾病的用图
[0021]因此，现有技术没有公开或提示成熟-缺损突变型番茄、提取物或其纯化的片段的抗脂肪形成或脂类积累抑制的活性。更具体地，其在预防或抑制脂肪形成介导的疾病中的应用没有被文献所包括。
[0022]本文所用的成熟抑制(rin)突变型番茄是指表达突变的成熟抑制(rin)番茄基因的番前(Lycopersicon esculentum)，因此，包括从杂合rin到纯合rin番前的系列范围内的任何变种。在一个实施例中，番前为rin杂合子。在另一个实施例中，番前为纯合rin番茄。利用组织培养技术，本发明的发明人成功地繁育了 rin含量在50-100%之间的番茄变种。
[0023]本文所用的术语“rin含量”被定义为相对于在rin/rin纯合子番前中100% rin的任意量的番前rin mRNA的含量。番前rin杂合子的rin含量为50%。RIN纯合子的rin含量为0%。
[0024]基于已知的rin基因序列，通过本领域的已知方法来适当地确定rin含量。例如，使用标准的PCR方法，其基于专门检测rin突变而设计的一套引物。优选实时定量PCR (RT-PCR) ο RT-PCR是当前用于适当数量的选定的基因的准确表达谱的标准方法，它的主要优点是高灵敏度和特异性，并且定量范围宽。RT-PCR的操作步骤在本领域是公知的。参见例如Derveaux et al.Methods 50 (2010)，227-230。不论使用何种实验技术，对于获得准确可信的基因表达水平的量，适当的标准化是至关重要的。标准化的目的是纠正与实验步骤中的各步相关的变异性，例如在起始样品的量、RNA回收、RNA的完整性、cDNA合成的效率方面的差异，以及所分析的组织或细胞的总体上的转录活性差异。优选地，PCR分析也可以检测一种或多种番茄的看家基因或组成型表达基因，例如GAPDH、EFa 1、TBP、RPL8、APT、DNAJ、TUA、TIP41、SAND、CAC和SGN-U346908SGN(Exposito-Rodriquez et al.BMC Plant B1logy2008,8:131)。除检测rin基因外，一种或多种rin靶基因的相对表达水平也可以被检测。例如，现已发现rin/rin突变体缺乏LeACS2、LeACS4、TBG4、LeEXPU LeMAM和PSYl的表达，并且显示LeACOl、ETR3、PG和INV的表达水平降低，而这些基因在野生型果实中被高水平的上调，这表明所有的这些基因直接或间接地被rin调节(Fujisawa et al., BMC PlantB1logy 2011,11:26)。因此，在一个实施例中，本发明提供了了用在抑制、预防或改善哺乳动物中的与脂肪形成有关的疾病状况的方法中的番茄植株、果实、片段或其提取物，其中，番茄缺乏 LeACS2、LeACS4、TBG4、LeEXPl、LeMAM 和 / 或 PSYl 的表达，和 / 或显示 LeACOl、ETR3、PG 和 / 或 INV 的表达水平降低。优选地，LeACS2、LeACS4、TBG4、LeEXP1、LeMAM、PSYl、LeAC01、ETR3、PG和/或INV的表达水平与在rin番茄中发现的表达水平相关。
[0025]所述表达水平可被适当地表示为与18S信号的基因特异性表达相比的相对表达。在一个实施例中，与果实成熟过程相关的靶基因TDR-4的减少的相对表达被使用。
[0026]在一个实施例中，番茄含有至少53 %的rin含量，如至少60 %，优选至少65 %，更优选至少70%。具有75-100%的rin含量的番茄可获得非常好的结果。
[0027]在一个特定的方面，所述番前选自变种“Slimmy” (rin含量53 % )、“ Mr.Slimmy” (rin 含量 53% )、“Gusto Delight” (rin 含量 75% )、“Snoepboompje” (rin 含量75% )和“Tomango，，(rin 含量 100% ) ο
[0028]在本发明之前，纯合rin番前(rin/rin)主要用于将一致成熟(u/u)的变种中的rin基因杂交以繁育保质期长(慢熟)的杂合(u/rin)番茄。在普通的植株培育中，获得的rin含量一般高达50%，因为两个rin/rin亲本品系的杂交收获的果实不完全成熟，因而不能用于传统的番茄培育程序。本发明的发明人认识到高水平的rin含量对获得抗脂肪形成效果的重要性，因而通过选择F2或F3代植株来规避这一问题，所述F2或F3代植株是强的rin杂合子，并且发明人利用分生组织培养获得含有高于50%，如至少53%，特别是60-100%的rin含量的等同植株。
[0029]用于本发明的成熟-缺陷突变型番茄可使用标准的种植技术获得，特别是植物组织培养。在一个实施例中，其包括特别适用于保存产生杂合类型植物的种子的遗传资源的分生组织培养。分生组织是一组未分化的植物细胞(存在于生长点)，其可经历分化以形成组织的所有类型。一般来说，使用的外植体为带有一对或两对最幼的叶原基、长度小于
0.1mm的光亮的圆顶状结构。在无菌条件下，分生组织被分离并在适于生长的培养基中培养。分生组织在其剪切的末端形成愈伤组织，大量的芽原基在所述愈伤组织上形成。这些原基形成丛生芽，在生根后，其生成生出5或6片叶子的小植株。芽生长直接形成可培养的可切割芽尖。在芽尖培养基中，使用的外植体是带有初生和次生叶片的分生组织并与干组织相邻。
[0030]本发明可使用成熟-缺陷突变型番茄实践，例如rin番茄、植株、果实、片段或其提取物。本文所用的“片段”是指植株的一部分，如叶、茎、根或果实。在一个实施例中，使用根或果实。优选地，使用果实或果实的提取物。研宄发现抗脂肪形成的效果不限于果实的果皮，而且也存在于果皮中。因此，整个番茄或仅果皮可以使用。为了减轻消耗和消费者的接受和评价，特别优选使用整个番茄的果实。举例来说，设想抗肥胖rin番茄可以作为普通的人类饮食的一部分来消费，例如作为鲜果或其加工产品，所述加工产品如酱汁或调味汁，凭借减少脂肪积累的优势取代传统番茄。
[0031]突变型番前的大小不等，从直径约5毫米的番前莓(tomberries)，到与野生番前大约相同大小1-2厘米(0.4-0.8英寸)的樱桃西红柿，再到直径为10厘米(4英寸)或以上的牛排番前(beefsteak tomatoes)。最广泛种植的商业番前往往是在5-6厘米(2.0-2.4英寸)的直径范围。用于罐头和调味汁的种植的番茄常常是细长的，7 - 9厘米(3 - 4英寸)长和4 - 5厘米(1.6 - 2.0英寸)的直径；它们被称之为李子形番茄，并具有较低的含水量。
[0032]在一个实施例中，本发明提供了一种成熟-缺陷突变型番茄提取物、酱汁、调味汁或果汁，以及其减少哺乳动物中的新脂肪组织形成和脂肪储备形成的用途，特别是支持体重管理，促进体重减轻和/或治疗肥胖的用途。番茄提取物可通过例如用合适的溶剂提取原料番茄来获得。在另一个实施例中，番茄果实作为酱汁或以干的形式使用。
[0033]被提取的原料番茄可以是整个番茄植株，也可以是果实、果皮、果汁或其他任选的部分。特别优选的部分是果皮，因为其含有大量具有抗脂肪形成活性的成分(以下称之为“抗脂肪形成活性成分”)。另外，原料番茄也可以是压榨番茄果实后获得的残渣。特别优选压榨残渣，因为其含有大量的果皮。另一个特别优选的部分是根，因为它有相对中性的味道，并且与粉末状的果实相比，其作为粉末包含较少的吸湿成分。在一个实施例中，本发明提供一种用在抑制、预防或改善哺乳动物中与脂肪形成有关的疾病情况的方法中的番茄植株的根或其提取物，其中，番茄是成熟-缺陷突变型番茄，优选成熟抑制(rin)突变型番茄。
[0034]如果原料番茄含有大量的水分，优选干燥后使用，以提高效率。更具体地，水分含量优选通过，例如，自然干燥或使用50-150°C热空气干燥1-24小时。当原料在提取前被冷冻干燥时可以获得好的结果。另外，为了提高提取效率，优选使用精细研磨后的原料番茄。对研磨的方法没有特别的限制，例如，包括使用研钵的方法，以及使用粉碎机的方法，比如旋转搅拌机或均质器。原料番茄优选被研磨到16目大小或更小。
[0035]适合在高浓度下提取抗脂肪形成活性成分的原料番茄是通过将番茄的整个果实、果皮或压榨后的番茄残渣干燥，然后碾压它们获得的。
[0036]对用于提取的溶剂没有特别的限制，只要其能够提取抗脂肪形成活性成分，普通的极性溶剂或两性溶剂等等都可以使用。可用的溶剂的例子包括有机溶剂、含有有机溶剂的溶剂或水和有机溶剂的混合溶剂。有机溶剂的具体例子包括低级醇类(具体地，乙醇、甲醇、丙醇和丁醇)、醚类(具体地，乙醚)、齒化碳类(具体地，氯仿)、腈类(具体地，乙腈)、酯类(具体地，乙酸乙酯)、酮类(具体地，丙酮)以及己烷、二甲亚砜和二甲基甲酰胺。从工作效率的角度讲，优选乙醇、甲醇和乙酸乙酯作为有机溶剂。两种或多种类型的有机溶剂可以结合使用。
[0037]鉴于抗脂肪形成活性成分的提取效率，特别优选低级醇类用作溶剂，特别是乙醇、甲醇、丙醇和丁醇，优选甲醇或乙醇。虽然对水和有机溶剂的混合比例没有特别的限制，但是优选含有20 %或更多的比例、特别优选含有50到99 %的比例的有机溶剂。当溶剂是醇类溶剂时，优选甲醇溶剂，更优选在70:30-95:5
文档序号 :
【 8515133 】
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