甘蓝型油菜利用无性系变异创制耐镉油菜突变体的方法

本发明属于种质资源创新，具体涉及甘蓝型油菜利用无性系变异创制耐镉油菜突变体的方法。

背景技术：

1、近年来，无论是中国还是全世界范围内，农田土壤镉污染问题越来越普遍。土壤镉污染不仅严重威胁农业安全生产，还可以通过食物链的富集作用对人体健康带来潜在的危害。

2、油菜表现出较强的耐镉性，生物量较大，营养体可以积累较多的镉，是极具植物修复潜力的物种。油菜花具有花色丰富鲜艳、花期持续时间长、利于田间景观设计等特点，近年来在乡村旅游中发挥重要的作物，因此，油菜用于镉污染土壤植物修复的同时还可以开发以油菜花为主题的景观旅游，增加当地的经济收益。修复过程中收获的含镉油菜籽和秸秆还是生产生物能源的良好材料，不仅可以增加污染地的经济效益，还避免镉流入食物链途径对人体健康造成的威胁。

3、因此，培育超耐受和超富集镉的甘蓝型油菜品种用于镉污染土壤的修复，对于保障镉污染土壤的修复和利用都具有十分重要的现实意义和应用前景。

4、公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供甘蓝型油菜利用无性系变异创制耐镉油菜突变体的方法，其能够解决上述背景技术提出的问题。

2、为了实现上述目的，本发明一具体实施例提供的了甘蓝型油菜利用无性系变异创制耐镉油菜突变体的方法，包括下述步骤；

3、s1、种子萌发；选取适合的种子，先用75％酒精消毒，再用15％次氯酸钠消毒，然后用无菌水清洗干净后，种植在含25ml b0培养基的组培瓶中，在无菌的环境下避光萌发；

4、s2、外植体脱分化形成愈伤组织；将萌发的幼苗的下胚轴用手术刀切成小段，均匀摆放在脱分化b1培养基上，在无菌的环境下黑暗培养16～36天，将外植体脱分化形成愈伤组织。

5、s3、愈伤组织诱变处理；将脱分化形成的愈伤组织分割成小块，在紫外光下诱变处理，然后将处理的愈伤组织，在新的b1培养基中进行继代培养15～25天。

6、其中；培养条件为无菌，温度为；15～28℃，黑暗环境下进行培养。

7、s4、愈伤组织的镉诱导和筛选处理；将紫外诱变后的愈伤组织分割成小块，依次在含50μmol/l、100μmol/l、150μmol/l镉的b1培养基中进行继代培养。每轮继代都选择其中健康的愈伤组织转接到更高镉浓度的b1培养基中进行继代培养；

8、s5、耐镉愈伤组织分化成苗和生根培养；取耐镉愈伤组织在分化培养基b2中分化成芽，将分化成芽的耐镉无性系接种在生根培养基b3中培养15～25天

9、s6、耐镉无性系移栽及繁殖；将根系和芽完整的耐镉无性系移栽至土壤中培养，开花后自交繁种，收获成熟的种子。

10、s7、耐镉性评价；获得耐镉性创新种质资源。

11、在本发明的一个或多个实施例中，所述b0培养基的配方包括有：ms：2～6g/l、蔗糖：15～50g/l和琼脂：6～15g/l。所述b0培养基的制备方法为：准备ms：2～6g/l、蔗糖：15～50g/l和琼脂：6～15g/l，将其混合后加水至1l，调整ph值至5.8，温度为110～131℃后，进行灭菌处理20～50min。

12、在本发明的一个或多个实施例中，所述脱分化b1培养基配方包括有：ms：2～6g/l、蔗糖：15～50g/l、琼脂：6～15g/l、6-ba：1～6mg/l、naa：0.2～0.8mg/l、agno3：2.2～3.2mg/l；。所述脱分化b1培养基的制备方法为：准备ms：2～6g/l、蔗糖：15～50g/l和琼脂：6～15g/l，将其混合后加水至1l，调整ph值至5.8，温度为110～131℃后，进行灭菌处理20～50min，灭菌后再添加无菌的6-ba：1～6mg/l、naa：0.2～0.8mg/l、agno3：2.2～3.2mg/l。

13、在本发明的一个或多个实施例中，所述分化培养基b2培养基配方包括有：ms：2～6g/l、蔗糖：15～50g/l、琼脂：6～15g/l、6～ba：2～9mg/l、naa：0.01～0.03mg/l、agno3：2.1～2.9mg/l。所述分化培养基b2培养基制备方法为；准备ms：2～6g/l、蔗糖：15～50g/l、琼脂：6～15g/l，将其混合后加水至1l，调整ph值至5.8，温度为110～131℃后，进行灭菌处理20～50min，灭菌后再添加无菌的6～ba：2～9mg/l、naa：0.01～0.03mg/l、agno3：2.1～2.9mg/l。

14、在本发明的一个或多个实施例中，所述生根培养基b3的配方包括有：ms：2～6g/l、蔗糖：15～50g/l、琼脂：6～15g/l、naa：0.1～0.3mg/l。所述生根培养基b3制备方法为；准备ms：2～6g/l、蔗糖：15～50g/l、琼脂：6～15g/l，将其混合后加水至1l，调整ph值至5.8，温度为110～131℃后，进行灭菌处理20～50min，灭菌后再添加无菌的naa：0.1～0.3mg/l。

15、在本发明的一个或多个实施例中，所述s1步骤中75％酒精消毒时间为1～10min，再用15％次氯酸钠消毒2～15min，在无菌温度为15～28℃的环境下避光萌发3～10天，所述所有种子均来源于自交。所述s3步骤在紫外光下诱变处理2～10min。所述s4步骤中的每轮继代的周期为15～25天。所述s5和所述s6步骤中的分化培养的环境为：无菌，温度为；15～28℃，光照时间为10～26h，黑暗时间为6～18h。

16、在本发明的一个或多个实施例中，在所述s7步骤中耐镉无性系的耐镉性评价包括下述步骤；

17、s11、种子消毒：针对耐镉无性系的种子进行消毒：使用1％次氯酸钠消毒10～30min，蒸馏水清洗干净。

18、s12、催芽处理：用蒸馏水将纱布浸湿，包裹种子，催芽10～18h；

19、s13、水培育苗：催芽后的种子平铺在20目的漏网上，放置于1/4霍格兰营养液中育苗3～5天；

20、s14、水培培育：将3～5天苗龄的幼苗，转移至含1/2霍格兰营养液的水培装置中培育2～8天；

21、s15、镉处理：将上述培养的健康幼苗，转移至含40μmol/l的镉全营养液中处理6～13天；

22、其中，第4天更换一次培养液；

23、s16、耐镉性评价：将s15步骤完成镉处理5～10天的幼苗，称取幼苗的地上部，根茎，根部的鲜重，以野生型品种为对照，比较耐镉无性系的耐镉性，筛选耐镉性突出的无性变异材料。其中，野生型品种包括有浙油18；

24、s17、镉含量测定：采集幼苗的地上部，使用烘箱杀青，温度控制为90～115℃，时间为20～30min，再将温度控制为60～100℃烘干至恒重，称取1～6g的烘干后的干样，将其放置在聚四氟乙烯消解管内，在聚四氟乙烯消解管内加入5～16ml混酸，聚四氟乙烯消解管置于电热板上进行加热消煮。

25、其中，所述加热消煮采用逐步升温法消煮至透明澄清，消解完全后使用30～60ml的1％硝酸定容，用双层定量滤纸过滤后进行测定，混酸配比为；hno3：hclo4＝4：1。

26、在本发明的一个或多个实施例中，所述1/4霍格兰营养液的配方包括有：1/4霍格兰营养液的配方包括有：h3bo3：1.1～3.5μmol/l、mnso4：0.1～0.325μmol/l、znso4·7h2o：0.05～0.523μmol/l、cuso4·5h2o：0.01～0.03μmol/l、(nh4)6mo7o24·4h2o：0.01～0.059μmol/l、na2h2po4·2h2o：0.05～0.325mmol/l、mgso4·7h2o：0.03～0.0825mmol/l、cacl2：0.11～0.65mmol/l、kno3：0.6～1mmol/l、fe-edta：0.05～0.2mmol/l。

27、在本发明的一个或多个实施例中，所述1/2霍格兰营养液的配方包括有：h3bo3：2～7μmol/l、mnso4：0.05～0.35μmol/l、znso4·7h2o：0.2～0.646μmol/l、cuso4·5h2o：0.04～0.08μmol/l、(nh4)6mo7o24·4h2o：0.03～0.0758μmol/l、na2h2po4·2h2o：0.1～0.65mmol/l、mgso4·7h2o：0.05～0.325mmol/l、cacl2：0.3～0.8mmol/l、kno3：1.25～1.95mmol/l、fe-edta：0.2～0.6mmol/l。

28、在本发明的一个或多个实施例中，所述霍格兰营养液的配方包括有：h3bo3：8～16μmol/l、mnso4：0.3～0.8μmol/l、znso4·7h2o：0.6～0.992μmol/l、cuso4·5h2o：0.06～0.12μmol/l、(nh4)6mo7o24·4h2o：0.06～0.012μmol/l、na2h2po4·2h2o：0.55～1.1mmol/l、mgso4·7h2o：0.05～0.325mmol/l、cacl2：0.6～1.2mmol/l、kno3：2.5～3.5mmol/l、fe-edta：0.2～0.8mmol/l。

29、与现有技术相比，本发明的甘蓝型油菜利用无性系变异创制耐镉油菜突变体的方法，具有以下益处；

30、1)、本发明利用物理诱变创制耐镉性甘蓝型油菜愈伤组织，提高了耐镉性无性系材料的创制效率；

31、2)、本发明在愈伤组织继代培养基中添加镉进行愈伤组织的耐镉性筛选，具有定向诱导和筛选的作用，提高了耐镉无性系的筛选效率；

32、3)、本发明在无性系耐镉性筛选的基础上，增加了水培条件下的突变体耐镉性鉴定，增加了耐镉性突变体的表型稳性，有利于获得稳定的耐镉且超富集镉的甘蓝型油菜突变体。