筛选甲状腺癌血清蛋白质指纹图谱诊断模型及其构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种筛选甲状腺癌血清蛋白质指纹图谱诊断模型及其构建方法，该筛选甲状腺癌血清蛋白质指纹图谱诊断模型的构建方法包括以下步骤：血清样品的收集、处理、保存及与蛋白质芯片的结合，收集甲状腺癌患者和健康者的血清样本，预处理，并与CM10芯片结合；仪器校正及数据的采集：采用PBSⅡ型蛋白质芯片阅读仪检测芯片，采用ProteinchipSoftware3.2.1分析软件自动采集数据；生物信息学统计分析，得到筛选甲状腺癌血清早期诊断的特异性蛋白质标记物并构建诊断模型；筛选甲状腺癌血清蛋白质指纹图谱诊断模型包括血清蛋白质质谱中质核比(M/Z)2050.69、2940.50、3942.92、5345.54、6918.33的5个蛋白质峰。本发明为甲状腺癌早期诊断和定性诊断水平提供了特异性标志物，为发现肿瘤标志物提供了基础。
【专利说明】筛选甲状腺癌血清蛋白质指纹图谱诊断模型及其构建方法
【技术领域】
[0001]本发明属于蛋白质组学检测【技术领域】，尤其涉及一种筛选甲状腺癌血清蛋白质指纹图谱诊断模型及其构建方法。
【背景技术】
[0002]甲状腺癌如今已成为常见的恶性肿瘤之一，约占全身恶性肿瘤的1%?4%，并且甲状腺癌占头颈部恶性肿瘤发病率的首位。我国甲状腺癌的临床发病率近年明显上升，且有年轻化趋势，是近年备受关注的肿瘤之一。手术是各型甲状腺癌的基本治疗方法，早期予以手术治疗预后较好，因此，甲状腺癌的早期诊断对患者来说具有重要的意义。而目前临床甲状腺癌术前诊断主要依靠B超、CT、MR1、核素扫描、细针穿刺细胞学检查等，但当前诊断技术尚无法满足临床上无创、特异性早期诊断甲状腺癌的要求。因此，需要新的特异性检测指标来进一步提高甲状腺癌的早期诊断水平。
【发明内容】
[0003]本发明实施例的目的在于提供一种筛选甲状腺癌血清蛋白质指纹图谱诊断模型及其构建方法，旨在解决现有的甲状腺癌诊断方法对提高诊断准确率提高有限，无法满足临床要求的问题。
[0004]本发明实施例是这样实现的，一种筛选甲状腺癌血清蛋白质指纹图谱诊断模型的构建方法，该筛选甲状腺癌血清蛋白质指纹图谱诊断模型的构建方法包括以下步骤:
[0005]步骤一，血清样品的收集、处理、保存及与蛋白质芯片的结合，收集甲状腺癌患者和健康者的血清样本，预处理，并与CMlO芯片结合；
[0006]步骤二，仪器校正及数据的采集:采用PBS II型蛋白质芯片阅读仪检测芯片，采用Proteinchip Software3.2.1分析软件自动采集数据；
[0007]步骤三，生物信息学统计分析，从而得到筛选甲状腺癌血清早期诊断的特异性蛋白质标记物并构建诊断模型；
[0008]生物信息学统计分析的具体步骤为:
[0009]第一步，所有原始数据先用Proteinchip Software3.2.1做校正,使总离子强度及分子量达到均一；
[0010]第二步，对位于2000Da?20000Da的质荷比峰值用Biomarker Wizard3.1软件过滤噪音，设置初始的噪音过滤值为5，二次信噪比为2，允许同一蛋白质峰在不同样本中的偏差小于0.3%，以10%为最小阈值进行聚类，得到所有样本的质谱数据在2000Da?20000Da的蛋白质峰；
[0011]第三步，得到初步筛选结果后，由Biomarker Wizard3.1软件对初步筛选出来的蛋白质谱峰M/Z峰强度做用秩和检验，由Biomarker Wizard3.1软件自动完成,各组数据用X士 s表示，应用P值评价每一个蛋白质峰的相对重要性，P值越小说明这个蛋白质峰对区分两类样本越重要；[0012]第四步，将Biomarker Wizard3.1软件处理后的差异蛋白质峰导入BiomakerPattern Software5.0.2软件中，采用决策树分类算法对两组间相同质荷比的差异蛋白质峰做分类分析，建立决策树模型；
[0013]第五步，进一步优化试验参数确定最佳的分类模型，即诊断模型；
[0014]第六步,导出统计结果和图片。
[0015]进一步，在步骤二中，在每次采集数据使用ALL-1n-One标准蛋白质芯片校正质谱仪，使分子量检测误差小于0.1%，蛋白质芯片阅读仪设置激光强度为220，灵敏度为9，收集数据的质荷比范围为2000Μ/Ζ?20000Μ/Ζ，优化范围为2000Μ/Ζ?15000Μ/Ζ，信号收集位置从20?80，收集总点数为140次，计算机以1x109Hz的速度从所获得的原始数据快速精确的绘制出蛋白指纹图谱，纵坐标为峰强度，横坐标为蛋白质质荷比。
[0016]进一步原始数据蛋白质指纹图谱由检测者的多个特异性蛋白质的质荷比和峰强度绘制而成。
[0017]进一步，该筛选甲状腺癌血清蛋白质指纹图谱诊断模型的构建方法包括:
[0018]第一步，收集甲状腺癌患者和健康者的血清样本，甲状腺癌组40例，女34例，男6例，平均年龄41.82 ±10.26岁，健康对照组30例，女25例，男5例，平均年龄40.10 ±9.15岁；
[0019]第二步，血清标本的采集、处理和保存:
[0020]采集病人治疗前及健康者清晨空腹静脉血2ml?5ml，半小时内放入4°C冰箱静置Ih后，4°C 4000转离心5分钟，取上清加入EP管，再次6000转离心5分钟，EP管分装，IOul?IOOul每管，放入-80°C密闭保存，期间所有操作均在4°C以下操作进行，所有样本保证只冻融一次；
[0021]第三步,具体实验步骤:
[0022]芯片的预处理；
[0023]I)小心的取出CMlO芯片，在芯片背后标记时间，芯片种类，操作者的姓名资料，记下芯片号；
[0024]2)将芯片装入生物芯片处理器，在组装生物芯片处理器时，注意不要触碰加样孔，同时要将芯片上带有A的一头放在外端，注意密封；
[0025]3)每孔加入200ul结合缓冲液50mM NaAC, pH = 4.0,室温下置摇床上600rpm震荡5分钟，甩掉缓冲液，重复上述操作一次，芯片上每个点的表面要保持湿润，加缓冲液后要观察芯片有无气泡，如有气泡用取液器吹去，枪头不得接触芯片上各点的表面；
[0026]血清的预处理
[0027]I) _80°C冰箱中取出血清样品，置冰盒上融解；
[0028]2)以 10000rpm，4°C离心 5 分钟；
[0029]3)将5ul血清用2倍体积U9缓冲液IOul稀释，稀释时注意不要用取液器反复吹吸，避免产生大量气泡，将样品冰浴上振荡30分钟或每隔5分钟用手指轻弹混匀一次，将样品充分混匀；
[0030]4)用缓冲液50mM NaAC, PH = 4.0将U9处理过的血清样品稀释到200ul，使得血清的总稀释倍数达到40倍，摇床上600rpm混匀2分钟，避免气泡产生；
[0031]蛋白与芯片的结合[0032]I)排枪在芯片处理器每孔中加入IOOul处理好的样品，置振荡器400转/分?600
转/分，4°C震荡I小时,使血清与芯片充分结合，甩掉，拍干；
[0033]2)每孔加入200ul的结合缓冲液50mM NaAc, pH4.0,置振荡器400转/分?600转/分，室温下震荡5分钟，甩去孔中液体，再次加入结合缓冲液200ul，重复操作一次；
[0034]3)每孔加入200ul HPLC水，立刻甩出，拍干，拆开芯片处理器，取出芯片，自然干燥；
[0035]4)点能量吸收分子
[0036]待芯片自然干燥后，在每个加样孔上加半饱和SPA溶液0.5ul，待干后重复点加一次，自然干燥，上机检测；
[0037]第四步，仪器校正及数据的采集:采用PBS II型蛋白质芯片阅读仪检测芯片，在每次采集数据使用ALL-1n-One标准蛋白质芯片校正质谱仪，使分子量检测误差小于0.1%,蛋白质芯片阅读仪设置激光强度为220，灵敏度为9，收集数据的质荷比范围为2000M/Z?20000M/Z，优化范围为2000M/Z?15000M/Z，信号收集位置从20?80，收集总点数为140次，采用Proteinchip Software3.2.1分析软件自动采集数据，计算机以1x109Hz的速度从所获得的原始数据快速精确的绘制出蛋白指纹图谱，纵坐标为峰强度，横坐标为蛋白质质荷比；
[0038]第五步，生物信息学统计分析
[0039]步骤一，所有原始数据先用Proteinchip Software3.2.1做校正,使总离子强度及分子量达到均一；
[0040]步骤二，对位于2000Da?20000Da的质荷比峰值用Biomarker Wizard3.1软件过滤噪音，设置初始的噪音过滤值为5，二次信噪比为2，允许同一蛋白质峰在不同样本中的偏差小于0.3%，以10%为最小阈值进行聚类，得到所有样本的质谱数据在2000Da?20000Da的蛋白质峰；
[0041]步骤三，得到初步筛选结果后，由Biomarker Wizard3.1软件对初步筛选出来的蛋白质谱峰M/Z峰强度做用秩和检验，由Biomarker Wizard3.1软件自动完成,各组数据用
士 s表示，应用P值评价每一个蛋白质峰的相对重要性，P值越小说明这个蛋白质峰对区分两类样本越重要；
[0042]步骤四，将Biomarker Wizard3.1软件处理后的差异蛋白质峰导入BiomakerPattern Software5.0.2软件中，采用决策树分类算法对两组间相同质荷比的差异蛋白质峰做分类分析，建立决策树模型；
[0043]步骤五，进一步优化试验参数确定最佳的分类模型，即诊断模型；
[0044]步骤六,导出统计结果和图片。
[0045]本发明实施例的另一目的在于提供一种筛选甲状腺癌血清蛋白质指纹图谱诊断模型，该筛选甲状腺癌血清蛋白质指纹图谱诊断模型为通过甲状腺癌组和健康对照组的血清差异蛋白比较，由血清蛋白质质谱中质核比(Μ/Ζ) 2050.69,2940.50,3942.92,5345.54、6918.33的5个蛋白质峰组成。
[0046]进一步，蛋白质质荷比和峰强度由表面增强激光解吸电离飞行时间质谱仪及分析系统检测得到，蛋白质决策树分类诊断模型由生物标志物向导软件和分析软件检测分析得。[0047]本发明提供的筛选甲状腺癌血清蛋白质指纹图谱诊断模型及其构建方法，通过甲状腺癌组和健康对照组的血清差异蛋白比较，由血清蛋白质质谱中质核比(M/Z)2050.69、2940.50,3942.92,5345.54,6918.33的5个蛋白质峰用于构建该决策树分类诊断模型；采用生物学信息分析，建立诊断模型，方法，设计合理可行，且操作简便，可批量处理，特异性强、敏感性高。本发明的诊断模型为甲状腺癌早期诊断和定性诊断水平提供了特异性的标志物，为进一步发现肿瘤标志物提供了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0048]图1是本发明实施例提供的筛选甲状腺癌血清蛋白质指纹图谱诊断模型的构建方法流程图；
[0049]图2是本发明实施例提供的甲状腺癌组和健康对照组血清蛋白质指纹图谱诊断模型示意图。
【具体实施方式】
[0050]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0051]下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
[0052]一种筛选甲状腺癌血清蛋白质指纹图谱诊断模型，通过甲状腺癌组和健康对照组的血清差异蛋白比较，由血清蛋白质质谱中质核比(M/Z)2050.69、2940.50、3942.92、5345.54,6918.33的5个蛋白质峰组成。
[0053]如图1所示，本发明实施例的筛选甲状腺癌血清蛋白质指纹图谱诊断模型的构建方法包括以下步骤:
[0054]SlOl:血清样品的收集、处理、保存及与蛋白质芯片的结合，收集甲状腺癌患者和健康者的血清样本，预处理，并与CMlO芯片结合；
[0055]S102:仪器校正及数据的采集:采用PBS II型蛋白质芯片阅读仪检测芯片，采用Proteinchip Software3.2.1分析软件自动采集数据；
[0056]S103:生物信息学统计分析，从而得到筛选甲状腺癌血清早期诊断的特异性蛋白质标记物并构建诊断模型。
[0057]在步骤S102中，在每次采集数据使用ALL-1n-One标准蛋白质芯片校正质谱仪，使分子量检测误差〈0.1%，蛋白质芯片阅读仪设置激光强度为220，灵敏度为9，收集数据的质荷比范围为2000M/Z?20000M/Z，优化范围为2000M/Z?15000M/Z，信号收集位置从20?80，收集总点数为140次，计算机以1x109Hz的速度从所获得的原始数据快速精确的绘制出蛋白指纹图谱，纵坐标为峰强度，横坐标为蛋白质质荷比。
[0058]在步骤S103中，生物信息学统计分析的具体步骤为:
[0059]第一步，所有原始数据先用Proteinchip Software3.2.1做校正,使总离子强度及分子量达到均一；
[0060]第二步，对位于2000Da?20000Da的质荷比峰值用Biomarker Wizard3.1软件过滤噪音，设置初始的噪音过滤值为5，二次信噪比为2，允许同一蛋白质峰在不同样本中的偏差〈0.3%，以10%为最小阈值进行聚类，得到所有样本的质谱数据在2000Da?20000Da的蛋白质峰；
[0061]第三步,得到初步筛选结果后，由Biomarker Wizard3.1软件对初步筛选出来的蛋白质谱峰M/Z峰强度做用秩和检验，由Biomarker Wizard3.1软件自动完成,各组数据用Y士 s表示，应用P值评价每一个蛋白质峰的相对重要性，P值越小说明这个蛋白质峰对区分两类样本越重要；
[0062]第四步，将Biomarker Wizard3.1软件处理后的差异蛋白质峰导入BiomakerPattern Software5.0.2软件中，采用决策树分类算法对两组间相同质荷比的差异蛋白质峰做分类分析，建立决策树模型；
[0063]第五步，进一步优化试验参数等确定最佳的分类模型，即诊断模型；
[0064]第六步,导出统计结果和图片。
[0065]结合本发明的具体实施例对本发明做进一步的说明:
[0066]第一步，收集甲状腺癌患者和健康者的血清样本，甲状腺癌组40例，女34例，男6例，平均年龄41.82 ±10.26岁，健康对照组30例，女25例，男5例，平均年龄40.10 ±9.15岁；
[0067]第二步，血清标本的采集、处理和保存:
[0068]采集病人治疗前及健康者清晨空腹静脉血2ml?5ml，半小时内放入4°C冰箱静置Ih后，4°C 4000转离心5分钟，取上清加入EP管，再次6000转离心5分钟，EP管分装，IOul?IOOul每管，放入-80°C密闭保存，期间所有操作均在4°C以下操作进行，所有样本保证只冻融一次；
[0069]第三步，具体实验步骤:
[0070]A:芯片的预处理
[0071]I)小心的取出CMlO芯片，在芯片背后标记时间，芯片种类，操作者的姓名等资料，记下芯片号；
[0072]2)将芯片装入生物芯片处理器(Bio-processor)，在组装生物芯片处理器时，注意不要触碰加样孔，同时要将芯片上带有”A”的一头放在外端，注意密封；
[0073]3)每孔加入200ul结合缓冲液(50mM NaAC, pH = 4.0),室温下置摇床上600rpm震荡5分钟，甩掉缓冲液，重复上述操作一次，(以上操作要注意芯片上每个点的表面要保持湿润，加缓冲液后要观察芯片有无气泡，如有气泡用取液器吹去，枪头不得接触芯片上各点的表面)；
[0074]B:血清的预处理
[0075]5) _80°C冰箱中取出血清样品，置冰盒上融解；
[0076]6)以 10000rpm，4°C离心 5 分钟；
[0077]7)将5ul血清用2倍体积U9缓冲液IOul稀释，稀释时注意不要用取液器反复吹吸，避免产生大量气泡，将以上样品冰浴上振荡30分钟(或每隔5分钟用手指轻弹混匀一次)，将样品充分混匀；
[0078]8)用缓冲液(50mM NaAC, PH = 4.0)将U9处理过的血清样品稀释到200ul，使得血清的总稀释倍数达到约40倍，摇床上600rpm混匀2分钟，避免气泡产生，
[0079]C:蛋白与芯片的结合[0080]4)排枪在芯片处理器每孔中加入IOOul处理好的样品，置振荡器400转/分?600转/分，4°C震荡I小时,使血清与芯片充分结合，甩掉，拍干；
[0081]5)每孔加入200ul的结合缓冲液(50mMNaAc，pH4.0)，置振荡器400转/分?600转/分，室温下震荡5分钟，甩去孔中液体(注意不要甩的太干)，再次加入结合缓冲液200ul，重复操作一次；
[0082]6)每孔加入200U1HPLC水，立刻甩出，拍干，拆开芯片处理器，取出芯片，自然干燥；
[0083]4)点能量吸收分子
[0084]待芯片自然干燥后，在每个加样孔上加半饱和SPA溶液0.5ul，待干后重复点加一次，自然干燥，上机检测；
[0085]第四步，仪器校正及数据的采集:采用PBS II型蛋白质芯片阅读仪检测芯片(SELD1-T0F-MS)，在每次采集数据使用ALL-1n-One标准蛋白质芯片校正质谱仪，使分子量检测误差〈0.1%，蛋白质芯片阅读仪设置激光强度为220，灵敏度为9，收集数据的质荷比范围为2000M/Z?20000M/Z，优化范围为2000M/Z?15000M/Z，信号收集位置从20?80，收集总点数为140次,采用Proteinchip Software3.2.1分析软件自动采集数据，计算机以1x109Hz的速度从所获得的原始数据快速精确的绘制出蛋白指纹图谱，纵坐标为峰强度(蛋白质相对含量)，横坐标为蛋白质质荷比；
[0086]第五步，生物信息学统计分析
[0087]步骤一，所有原始数据先用Proteinchip Software3.2.1做校正,使总离子强度及分子量达到均一；
[0088]步骤二，对位于2000Da?20000Da的质荷比峰值用Biomarker Wizard3.1软件过滤噪音，设置初始的噪音过滤值为5，二次信噪比为2，允许同一蛋白质峰在不同样本中的偏差〈0.3%，以10%为最小阈值进行聚类，得到所有样本的质谱数据在2000Da?20000Da的蛋白质峰；
[0089]步骤三，得到初步筛选结果后，由Biomarker Wizard3.1软件对初步筛选出来的蛋白质谱峰M/Z峰强度做用秩和检验，由Biomarker Wizard3.1软件自动完成,各组数据用JT士 s表示，应用P值评价每一个蛋白质峰的相对重要性，P值越小说明这个蛋白质峰对区分两类样本越重要；
[0090]步骤四，将Biomarker Wizard3.1软件处理后的差异蛋白质峰导入BiomakerPattern Software5.0.2软件中，采用决策树分类算法对两组间相同质荷比的差异蛋白质峰做分类分析，建立决策树模型；
[0091]步骤五，进一步优化试验参数等确定最佳的分类模型，即诊断模型；
[0092]步骤六,导出统计结果和图片。
[0093]结合以下实施例的结果和分析对本发明的使用效果做补充说明:
[0094]结果:甲状腺癌组和健康对照组的血清差异蛋白质峰的筛选比较及诊断模型的建
[0095]1、差异蛋白质峰的初步筛选及比较
[0096]通过SELDI蛋白指纹图谱仪对40例甲状腺癌患者和30例健康者的血清样品进行数据采集，用Biomarker Wizard进行初步统计分析后，在2000Da?20000Da范围内共得到121个蛋白质峰，大部分蛋白质峰集中在2000Da~1000ODa(表1和表2)，其中18个蛋白质峰在两组之间表达有显著性差异(P〈0.01)，13个蛋白质峰在甲状腺癌组中表达量明显升高，5个蛋白质峰表达量降低，具体见表1 ;
[0097]表1甲状腺癌组和健康对照组的血清蛋白质峰表达量的比较(Y.士 s)
【权利要求】
1.一种筛选甲状腺癌血清蛋白质指纹图谱诊断模型的构建方法，其特征在于，该筛选甲状腺癌血清蛋白质指纹图谱诊断模型的构建方法包括以下步骤: 步骤一，血清样品的收集、处理、保存及与蛋白质芯片的结合，收集甲状腺癌患者和健康者的血清样本，预处理，并与CMlO芯片结合； 步骤二，仪器校正及数据的采集:采用PBS II型蛋白质芯片阅读仪检测芯片，采用Proteinchip Software3.2.1分析软件自动采集数据； 步骤三，生物信息学统计分析，从而得到筛选甲状腺癌血清早期诊断的特异性蛋白质标记物并构建诊断模型； 生物信息学统计分析的具体步骤为: 第一步，所有原始数据先用Proteinchip Software3.2.1做校正,使总离子强度及分子量达到均一； 第二步,对位于2000Da~20000Da的质荷比峰值用Biomarker Wizard3.1软件过滤噪音，设置初始的噪音过滤值为5，二次信噪比为2，允许同一蛋白质峰在不同样本中的偏差小于0.3%，以10%为最小阈值进行聚类，得到所有样本的质谱数据在2000Da~20000Da的蛋白质峰； 第三步，得到初步筛选结果后，由Biomarker Wizard3.1软件对初步筛选出来的蛋白质谱峰M/Z峰强度做用秩和检验，由Biomarker Wizard3.1软件自动完成,各组数据用Y 士 s表示，应用P值评价每一个蛋白质峰的相对重要性，P值越小说明这个蛋白质峰对区分两类样本越重要； 第四步，将Biomarker Wizard3.1软件处理后的差异蛋白质峰导入Biomaker PatternSoftware5.0.2软件中，采用决策树分类算法对两组间相同质荷比的差异蛋白质峰做分类分析，建立决策树模型； 第五步，进一步优化试验参数确定最佳的分类模型，即诊断模型； 第六步，导出统计结果和图片。
2.如权利要求1所述的筛选甲状腺癌血清蛋白质指纹图谱诊断模型的构建方法，其特征在于，在步骤二中，在每次采集数据使用ALL-1n-One标准蛋白质芯片校正质谱仪，使分子量检测误差小于0.1%，蛋白质芯片阅读仪设置激光强度为220，灵敏度为9，收集数据的质荷比范围为2000M/Z~20000M/Z，优化范围为2000M/Z~15000M/Z，信号收集位置从20~80，收集总点数为140次，计算机以1x109Hz的速度从所获得的原始数据快速精确的绘制出蛋白指纹图谱，纵坐标为峰强度，横坐标为蛋白质质荷比。
3.如权利要求2所述的筛选甲状腺癌血清蛋白质指纹图谱诊断模型的构建方法，其特征在于，原始数据蛋白质指纹图谱由检测者的多个特异性蛋白质的质荷比和峰强度绘制而成。
4.如权利要求1所述的筛选甲状腺癌血清蛋白质指纹图谱诊断模型的构建方法，其特征在于，该筛选甲状腺癌血清蛋白质指纹图谱诊断模型的构建方法包括: 第一步，收集甲状腺癌患者和健康者的血清样本，甲状腺癌组40例，女34例，男6例，平均年龄41.82 ±10.26岁，健康对照组30例，女25例，男5例，平均年龄40.10 ±9.15岁； 第二步，血清标本的采集、处理和保存:采集病人治疗前及健康者清晨空腹静脉血2ml~5ml，半小时内放入4°C冰箱静置Ih后，4°C 4000转离心5分钟，取上清加入EP管，再次6000转离心5分钟，EP管分装，IOul~IOOul每管，放入_80°C密闭保存，期间所有操作均在4°C以下操作进行，所有样本保证只冻融一次； 第三步，具体实验步骤: 芯片的预处理； 1)小心的取出CMlO芯片，在芯片背后标记时间，芯片种类，操作者的姓名资料，记下芯片号; 2)将芯片装入生物芯片处理器，在组装生物芯片处理器时，注意不要触碰加样孔，同时要将芯片上带有A的一头放在外端，注意密封； 3)每孔加入200ul结合缓冲液50mMNaAC, pH = 4.0,室温下置摇床上600rpm震荡5分钟，甩掉缓冲液，重复上述操作一次，芯片上每个点的表面要保持湿润，加缓冲液后要观察芯片有无气泡，如有气泡用取液器吹去，枪头不得接触芯片上各点的表面； 血清的预处理 1)-800C冰箱中取出血清样品，置冰盒上融解； 2)以10000rpm，4°C离心 5 分钟； 3)将5ul血清用2倍体积U9缓冲液IOul稀释，稀释时注意不要用取液器反复吹吸，避免产生大量气泡，将样品冰浴上振荡30分钟或每隔5分钟用手指轻弹混匀一次，将样品充分混匀； 4)用缓冲液50mMNaAC, PH = 4.0将U9处理过的血清样品稀释到200ul，使得血清的总稀释倍数达到40倍，摇床上600rpm混匀2分钟，避免气泡产生； 蛋白与芯片的结合 1)排枪在芯片处理器每孔中加入IOOul处理好的样品，置振荡器400转/分~600转/分，4°C震荡I小时，使血清与芯片充分结合，甩掉，拍干； 2)每孔加入200ul的结合缓冲液50mMNaAc, pH4.0,置振荡器400转/分~600转/分，室温下震荡5分钟，甩去孔中液体，再次加入结合缓冲液200ul，重复操作一次； 3)每孔加入200ulHPLC水，立刻甩出，拍干，拆开芯片处理器，取出芯片，自然干燥； 4)点能量吸收分子 待芯片自然干燥后，在每个加样孔上加半饱和SPA溶液0.5ul，待干后重复点加一次，自然干燥，上机检测； 第四步，仪器校正及数据的采集:采用PBS II型蛋白质芯片阅读仪检测芯片，在每次采集数据使用ALL-1n-One标准蛋白质芯片校正质谱仪，使分子量检测误差小于0.1 %，蛋白质芯片阅读仪设置激光强度为220，灵敏度为9，收集数据的质荷比范围为2000M/Z~20000M/Z，优化范围为2000M/Z~15000M/Z，信号收集位置从20~80，收集总点数为140次，采用Proteinchip Software3.2.1分析软件自动采集数据，计算机以1x109Hz的速度从所获得的原始数据快速精确的绘制出蛋白指纹图谱，纵坐标为峰强度，横坐标为蛋白质质荷比； 第五步，生物信息学统计分析 步骤一,所有原始数据先用Proteinchip Software3.2.1做校正,使总离子强度及分子量达到均一； 步骤二，对位于2000Da~20000Da的质荷比峰值用Biomarker Wizard3.1软件过滤噪音，设置初始的噪音过滤值为5，二次信噪比为2，允许同一蛋白质峰在不同样本中的偏差小于0.3%，以10%为最小阈值进行聚类，得到所有样本的质谱数据在2000Da~20000Da的蛋白质峰； 步骤三,得到初步筛选结果后，由Biomarker Wizard3.1软件对初步筛选出来的蛋白质谱峰M/Z峰强度做用秩和检验，由Biomarker Wizard3.1软件自动完成,各组数据用JT 士 s表示，应用P值评价每一个蛋白质峰的相对重要性，P值越小说明这个蛋白质峰对区分两类样本越重要； 步骤四，将Biomarker Wizard3.1软件处理后的差异蛋白质峰导入Biomaker PatternSoftware5.0.2软件中，采用决策树分类算法对两组间相同质荷比的差异蛋白质峰做分类分析，建立决策树模型； 步骤五，进一步优化试验参数确定最佳的分类模型，即诊断模型； 步骤六，导出统计结果和图片。
5.一种筛选甲状腺癌血清蛋白质指纹图谱诊断模型，其特征在于，该筛选甲状腺癌血清蛋白质指纹图谱诊断模型为通过甲状腺癌组和健康对照组的血清差异蛋白比较，由血清蛋白质质谱中质核比(M/Z) 2050.69,2940.50,3942.92,5345.54,6918.33的5个蛋白质峰组成。
6.如权利要求5所述 的筛选甲状腺癌血清蛋白质指纹图谱诊断模型，其特征在于，蛋白质质荷比和峰强度由表面增强激光解吸电离飞行时间质谱仪及分析系统检测得到，蛋白质决策树分类诊断模型由生物标志物向导软件和分析软件检测分析得。
【文档编号】G01N30/88GK104007217SQ201410234545
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年5月29日 优先权日:2014年5月29日
【发明者】吴正治, 孙珂焕, 曹美群 申请人:深圳市第二人民医院
文档序号 :
【 6228852 】
技术研发人员：吴正治,孙珂焕,曹美群
技术所有人：深圳市第二人民医院
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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