辣椒花药双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法
【专利摘要】本发明公开了一种辣椒花药双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法，包括以下步骤：1）利用辣椒花药进行蛋白质的提取；2）第一向IPG等电聚焦电泳；3）胶条的平衡；4）胶条的转移及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；5）凝胶扫描和图像分析；从而得辣椒花药双向电泳差异蛋白质图谱。运用本发明的方法能获得蛋白质点清晰、数目较多、分布均匀、背景清楚的辣椒花药蛋白质的双向电泳凝胶图谱，且实验结果稳定，此发明为进一步开展辣椒蛋白组学和分子生物学的研究奠定了重要的工作基础。
【专利说明】辣椒花药双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种辣椒花药双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法。
【背景技术】
[0002]辣椒(Chili P印per)原产于中拉丁美洲热带地区，原产国是墨西哥。为一年生或多年生植物，其Vc的含量在蔬菜中居第一位，具有较高的营养价值。辣椒为常异花授粉植物，杂交优势显著。但在杂交繁种中，由于母本去雄费时费工，且杂交种子纯度难以保证。而利用CMS三系配套法生产杂交种子，不但可减少人工去雄的麻烦，降低制种成本，而且能保障杂交种子的纯度。目前，国内外已选育出多个辣椒胞质雄性不育系，并逐步应用于辣椒杂交种子的生产。因此，利用CMS三系配套法生产杂交种子在辣椒生产上具有极大的潜力和市场需求。但是通过自然变异获得不育系的概率比较小，且数量少。另外，如果引进不育系，其需要稳定的时间周期又比较长。因此，稳定不育系的难获得，已成为目前辣椒利用CMS三系配套法杂交制种的最大障碍。利用基于双向电泳的蛋白质组学技术，可以快速挖掘出辣椒育性不同的差异基因表达的产物，从而阐述不育机制，为将来辣椒杂交制种工作提供重要技术支撑。
[0003]现有研究辣椒不育机理的方法往往借助于基因组学技术，可以在一定程度上挖掘植物不育的重要基因。但是因为蛋白质是基因表达的最终产物，所以找出与不育相关的直接差异蛋白将更有助于不育机理的研究。利用基于双向电泳的差异蛋白质组学技术，获得高质量的差异蛋白图谱，是研究不育机理的强有力工具。目前利用双向电泳获得蛋白图谱的方法在生物医学领域和部分植物研究(如苹果叶片)等植物种类有一定程度的应用，但是在辣椒，特别是花药研究方面几乎空白。张彩霞等借助酚抽提法在苹果叶片中得到了高质量的蛋白质点图谱。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是提供一种能得到高质量辣椒花药双向电泳蛋白质图谱的获取方法。
[0005]为了解决上述技术问题，本发明提供一种辣椒花药双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法，包括以下步骤:
[0006]I)、利用辣椒花药进行蛋白质的提取；
[0007]2)、第一向IPG等电聚焦(IEF)电泳:
[0008]取步骤I)所得的蛋白提取液40 μ L、240?280 μ L的IPG buffer混匀后配成水
化溶液，装入等电聚焦槽中；利用等电聚焦胶条进行等电聚焦；设定参数如下:
[0009]
【权利要求】
1.辣椒花药双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法，其特征是包括以下步骤: 1)、利用辣椒花药进行蛋白质的提取； 2)、第一向IPG等电聚焦电泳: 取步骤I)所得的蛋白提取液40 μ L、240~280 μ L的IPG buffer混匀后配成水化溶液，装入等电聚焦槽中；利用等电聚焦胶条进行等电聚焦；设定参数如下:
2.根据权利要求1所述的辣椒花药双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法，其特征是: 所述步骤4)中的SDS-PAGE胶的制备方法中所用的凝胶溶液为12%的凝胶溶液；所述12%的凝胶溶液的制备方法为: 在13.4ml的超纯水中加入16.0ml的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的混合水溶液、IOml的Tris-Hcl缓冲液(1.5mol/L, ρΗ8.8),0.4ml的SDS水溶液、200 μ L的过硫酸铵水溶液、20 μ L的N, N，N，，N，-四甲基乙二胺； 每ml丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的混合水溶液含292mg的丙烯酰胺、8mg的甲叉双丙烯酰胺，其余为水；每ml SDS水溶液中含有IOOmg的SDS，其余为水；每ml过硫酸铵水溶液中含有IOOmg的过硫酸铵，其余为水。
3.根据权利要求1或2所述的辣椒花药双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法，其特征是: 所述蛋白质的提取包括以下步骤: ①、取0.4g辣椒花药用液氮研磨后将其悬浮于IOml的三氯乙酸/丙酮溶液中，-200C沉淀10小时; 所述三氯乙酸/丙酮溶液由8%的三氯乙酸和92%的丙酮组成，上述％为体积％ ； ②、将步骤①的所得物 离心，弃上清； ③、将步骤②所得的沉淀悬浮于IOml的B-巯基乙醇冷丙酮溶液；离心； 所述B-巯基乙醇冷丙酮溶液的制备方法为:将冷丙酮与B-巯基乙醇按照1:0.09的体积比进行混合；所述冷丙酮为温度为4°C的丙酮； ④、将步骤③所得的沉淀真空抽干至含水量<0.05% (质量％)，得到粗蛋白干粉；加入Iml裂解液A以溶解上述粗蛋白干粉，离心，所得的即为蛋白提取液； 所述裂解液A为在每ml水中加入380mg尿素、IOOmg硫脲、30mg3-[3_(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、6.2m g 二硫苏糖醇、10 μ L载体两性电解质Ampholine ρΗ3_10,，0.174mg苯甲基磺酰氟制备 而得。
【文档编号】G01N1/28GK103884765SQ201410060630
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年2月21日 优先权日:2014年2月21日
【发明者】吕晓菡, 柴伟国, 方献平 申请人:杭州市农业科学研究院
文档序号 :
【 6218722 】
技术研发人员：吕晓菡,柴伟国,方献平
技术所有人：杭州市农业科学研究院
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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