布鲁氏菌分子标记和毒力缺失弱毒疫苗及制备方法
专利名称：：布鲁氏菌分子标记和毒力缺失弱毒疫苗及制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种布鲁氏菌弱毒疫苗及生产工艺，尤其是提供一种可区分自然感染或野毒感染的布鲁氏菌弱毒疫苗，用于能区分人与动物是疫苗接种还是自然感染；本发明还公开了上述疫苗的生产方法，属于免疫疫苗生产
技术领域：
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背景技术：
：布鲁氏菌病(Brucellosis)是由小球杆状布鲁氏菌引起的一种人畜共患传染病，在世界各地都有广泛流行。每年因此造成的经济损失高达数十亿美元，而且此病还会对人类健康造成严重威胁。从上个世纪90年代起，人与动物发病率又有上升的趋势。当前的布鲁氏菌疫苗种类较多。重组蛋白疫苗与DNA疫苗保护性能有限，灭活疫苗保护期短。目前人和动物多用弱毒疫苗，弱毒疫苗较前几种疫苗保护作用及效果好，但它同样存在着缺陷，致使人们不敢、不愿也不能对其广泛应用。主要原因是其一，接种后人们无法区别自然感染和人工接种免疫。如果广泛应用这样的疫苗就给该病流行病学调査，探查疫源产生很大的障碍。许多国家与地区限制用血清学方法检测布鲁氏菌病呈阳性地区的肉制品、奶制品进口，对国际贸易产生严重的影响；其二，毒性大，返祖现象严重，会对人与动物机体造成伤害，甚至发病。所以研制一种能区分是自然感染还是人工主动免疫，保护性能好，毒力弱、安全性能好的布鲁氏菌病弱毒疫苗具有重要的实践意义。所以构建一株能区分是自然感染还是人工接种免疫，保护性能好，毒力弱的布鲁氏菌弱毒疫苗是本发明的任务。
发明内容本发明的目的是公开一种可区分自然感染或野毒感染的布鲁氏菌弱毒疫苗△S19-1和AS19-2，解决了常规的布鲁氏菌疫苗不能区分人与动物是人工免疫接种还是野生菌感染、病毒强，容易至使接种的人与动物不良反应、甚至发病的问题。本发明还公开了该布鲁氏菌弱毒疫苗的制备方法，适用于工业化生产。一种布鲁氏菌弱毒疫苗AS19-l,特征在于:布鲁氏菌需弱毒疫苗株S19的Bp26基因缺失而成AS19-1。一种布鲁氏菌弱毒疫苗AS19-2，特征在于AS19-1毒力基因Bmpl8缺失而成弱毒疫苗株AS19-2。本发明的技术解决方案如下为了本发明的目的，首先以布鲁氏菌的弱毒疫苗株S19为起始材料，以PCR的方法从S19的染色体中扩增出要改造的目的基因Bp26的引导序列，并把它克隆到T载体上，进行基因改造。而后把这个经改造的引导序列克隆到pBK-CMV上而成重组质粒pBK-BP26-Luc，并在pBK-Bp26-Luc合适的位置上，克隆上sacB基因，最终成为同源重组载体(自杀性质粒)pBLs。用同样的方法得到布鲁氏菌毒力基因B卿8的引导序列，克隆到T载体上，进行基因改造，并把它连接到pBluescriptSK+重组质粒，最终成为同源重组载体pBBs,用电转化法把自杀性质粒pBLs转化到布鲁氏菌S19中，由于同源重组载体(自杀性质粒)不能在布鲁氏菌中自主复制，因此转入受体菌细胞内的超螺旋的自杀质粒便会被线性化。因自杀质粒上含有受体菌基因的同源序列，它便会插入受菌体S19的染色体中，接着线性化的质粒与Bp26基因发生置换，也就是通常所说的单交换同源重组事件的发生。只有置换到S19染色体上被线性化的自杀质粒才能随着染色体的复制而存在。把受体菌涂布在含有筛选标记的肝汤琼脂平板上，因自杀质粒上带有筛选药品抗性基因，所以很容易的筛选出单交换子。由于单交换是整个载体序列(含筛选药物抗性基因和sacB基因)都置换到染色体上，因此，我们必须筛选仅有经改造的目的基因整合到染色体上的双交换子。将获得的同源重组单交换子液体培养物涂布于添加5%蔗糖的肝汤培养基平板上，挑取单菌落即为阳性同源重组双交换子。因为如果布鲁氏菌双交换子染色体上存在sacB基因等载体序列，在蔗糖存在的情况下将会导致细菌死亡，只有在5%蔗糖肝汤培养基上生长的菌落才是发生2次重组的双交换子(丢失sacB基因和抗性等载体序列)，即得到本发明的厶S19-1。用同样的方法把自杀性质粒pBBs转化到AS19-1中去得到本发明的AS19-2。用这样的方法首先得到布鲁氏菌弱毒疫苗株S19的Bp26基因突变缺失株△S19-l，而后得到AS19-1毒力基因Bmpl8缺失株AS192。本发明的具体制备方法主要包括以下步骤(1)以布鲁氏菌弱毒疫苗基因组为模板，设计引物，用PCR的方法，扩增出分子标记目标基因的同源重组引导序列，而后克隆到T载体上对目标基因改造；(2)用(1)得到的基因片段与复制启动子为pUCoir的载体相连，而后将sacB基因连接到这个载体的适当位置，构建成同源重组载体(自杀性质粒)；(3)使步骤(2)得到的重组载体转化到布鲁氏菌中去；利用同源重组载体自带的筛选标记筛出同源重组单交换子，利用sacB基因筛选出同源重组的双交换子，得到本发明的分子标记疫苗株AS19-1;(4)重新设计引物，从布鲁氏菌基因组中，扩增出目标毒力基因的同源重组引导序列，使用(1)(3)的方法使AS19-1的毒力缺失，得到本发明的分子标记、毒力缺失弱毒疫苗株AS19-2。本发明的优选实验方案:所说的弱毒疫苗株为S19。本发明的优选实验方案:所说的分子标记目标基因为Bp26。本发明的优选实验方案所说的分子标记目标基因是指用限制性内切酶切除其中500bp，而后在这个位置上连接上LucNF+报告基因。本发明的优选实验方案所说目标蛋白是BP26蛋白。本发明的优选实验方案所说的目标毒力基因是Bmpl8基因。本发明的优选实验方案所说目标毒力基因改造是指用限制性内切酶切除其中的200bp，而后使之相联。其中所说分子标记突变株在本发明中被命名为AS19-1，分子标记、毒力缺失弱毒疫苗突变株被命名为AS19-2用AS19-2接种动物，根据动物所表现的临床症状分析，AS19-2毒力明显比接种其亲本菌株S19。用PCR的方法从布鲁氏菌S19中扩增出Bp26基因，把它克隆到pET28a+上面成重组质粒pETBp26。把它转化到大肠杆菌中表达并纯化出融合蛋白His-BP26。以His-BP26为包被抗原，用ELISA的方法检测动物的血清，就容易区分开动物是其它布鲁氏菌感染还是AS19-2接种的。基因打靶是基于DNA同源重组技术发展起来的在分子水平上改造、剔除或取代某个特定基因，能达研究基因改造后个体的表型进而研究目标基因的功能。一般来说，由于外源DNA与宿主细胞DNA自然发生同源重组的机率非常低，因此对成功地进行了基因打靶是一件非常困难的工作。本发明中构建的自杀性质粒的复制起始位点为pUCori，可以在￡coh'存活并复制，但不能在布鲁氏菌中存活与复制，所以该载体在布鲁氏菌中为自杀质粒。因此，在载体构建过程中涉及到此复制子需在￡中操作，它带有筛选标记便于同源重组单交换子的筛选。为了获得不带抗性标记的工程菌株，必须筛选双交换子。如果用抗性基因作为负筛选标记，必须逐个验证是否丢失抗性，工作烦琐而容易出现假阳性。用sacB基因作为正筛选标记。该基因编码的果糖蔗糖酶，能将蔗糖水解为果糖并生成大分子量的果聚糖，在G—细菌周质空间(极少数0+细菌的假周质空间结构)累积，导致细胞停止生长或死亡，因此，含有该基因的G—宿主菌对蔗糖高度敏感，可以用来作为同源重组双交换的正筛选标记，只细菌在该培养基上生长，它就是丢失抗性基因的双交换子，工作简便可靠将LucNF+报告基因代替了Bp26基因部分片段。LucNF+基因是经基因工程改进的萤火虫萤光素酶基因，使其在构建萤光素酶N端融合蛋白时具有最大的灵活性。蛋白不需要翻译后加工，立即产生报告活性。本发明用PCR的方法扩增出Bp26基因，经过克隆、亚克隆，最后连接到到pET-28a上，转化到大肠杆菌BL21中，用IPTG诱导表达。结果37。C诱导4个小时，用SDS-PAGE分析，高效表达出带有His-tag标签的融合蛋白BP26蛋白，经Western-blot免疫鉴定，它具有免疫活性。为了评价本发明的基因工程构建的布鲁氏工程弱毒疫苗AS19-2的正确性，分别在分子标记目标基因与毒力基因的引导序列上设计引物，以亲本菌株S19为对照，比较扩增基因片段的大小，验证基因改造情况，经凝胶电泳分析，结果与理论值相符，见图广图2。为了检定本发明的基因工程构建的布鲁氏工程菌AS19-2的毒力，本发明以小鼠为实验动物，用AS19-2接种动物，以S19注射为对照组，检测接种小鼠脾脏不同时候的AS19-2与S19含菌量，用不同高浓度的AS19-2与S19接种小鼠，观察小鼠的临床症状及最小致死数量，比较分析了它们的毒力强弱。其结果表明△S19-2比其亲本S19弱很多。详细的方法与步骤及数据见实施例4。用本发明制取的His-Bp26融合蛋白做包被抗原，用ELISA方法成功区分了是S19接种的小鼠还是AS19-2接种的小鼠。详细的方法与步骤及数据见实施例5。以上实验结果证实所构建的布鲁氏弱毒疫苗AS19-2具有分子标记，毒力相对缺失的特点。本发明构建了这两个基因缺失株，实验研究进一步证实，本发明的基因工程菌株接种动物后能与其它菌株感染动物用ELISA方法区分开来。通过接种小鼠进行毒力测试，其毒力明显比S19株弱。本发明的积极效果在于提供布鲁氏菌分子标记、毒力缺失弱毒活疫苗AS19-2株，及提供基于所说的突变株疫苗的方法，特别是进一步提供了能区分人与动物是疫苗接种还是野生菌感染的方法。这对布鲁氏菌病监测、诊断、净化和控制具有重要意义，具有广泛的应用实践价值。图1、同源载体pBLs插入S19染色体上与AS19-2双交换PCR检测；M.lkbpDNALadderMarker;1.S19;2.同源载体插入后的S19;3.AS19-2。图2、改造后的Bmpl8基因在AS19-2双交换子正确性的PCR检测；M.lkbpDNALadderMarker;1.AS19-2;2.S19。图4、自杀性质粒pBBs的构建过程。图5、PCR扩增凝胶回收后验证。图6、重组质粒酶切电泳；l.pBb26/XhoI;2.pBmpl8/XbaI;3.pSacB/(BamHI+SalI);4.pB即18/(XbaI+SacII);5.pBK-Bp26-Luc/EcoRI;M.lkbpDNALadderMarker。图7、同源载体pBLs插入S19染色体上与AS19-2双交换PCR检测；M.lkbpDNALadderMarker;1.S19;2.同源载体插入后的S19;3.AS19-2。图8、改造后的Bmpl8基因在AS19-2双交换子正确性的PCR检测；M,lkbpDNALadderMarker;1.AS19-2;2.S19。图9、目的基因的扩增；1:Bp26(694bp);2:DNAmarkerDL2000图10、重组质粒pMDBp26;1:pMDBp26;2:1Kbmarker。图ll、重组质粒pETBp26酶切鉴定图；Fig.3-3RestrictionmapofrecombinantplasmidpETBp26。图12、融合蛋白SDS-PAGE检测；1:LowMRproteinmarker;l-3:pETBp26肌21inducedfor2,3,4hrespectively;4:pET28a/BL21inducedfor4h。图13、表达产物的薄层扫描结果。图14、纯化蛋白质SDS-PAGE检测。图15、融合蛋白Bp26Westernblot检测。1:RabbitserumagainstrecombinedBp26:2:LowMRproteinmarker;3:pET28a/BL21inducedfor4h。具体实施例方式下列实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本发明。本领域技术人员可以理解到，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明的任何平行改变和改动都将落入本发明的待批权利要求范围内。实施例1同源重组载体(自杀性质粒)的构建1材料与方法1.1菌株、质粒、载体布鲁氏菌S19株、DH5a、pBluescriptSK+本研究室保存；pBK-CMV购自Stratagene公司;pSP-LucNF+购自P簡ega公司;pIB279南京农业大学蒋建东博士惠赠；pMD18-Tsimplevector购自TakaRa公司。1.2试剂限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶、DNA聚合酶I(Klenow大片段)，大肠杆菌DNA聚合酶I，LA-TaqDNApolymerase、lkbpDNALadderMarker、质粒DNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒均为TaKaRa公司产品；萤光素酶检测系统购自Promega公司。1.3PCR扩增1.3.1含有Bp26基因同源重组指导序列的扩增根据Bp26基因的序列以及pMD18-Tsimplevector和pBK-CMV噬菌粒载体特点分别设计5'端含有限制性内切酶XhoI的上游引物与含有XbaI酶切位点的下游引物。上游引物GAATTCTTTAGTCCATCCGACCCAAGTTTACG;下游引物CTCGAGTGAACACTGACCATACGCTG了GAAGAAG。反应条件95。C预变性5min;94。C变性2min，60。C退火2min，72。C延伸5min，30个循环；最后72。C延伸10min。从布鲁氏菌S19的基因组中扩增。1.3.2含有Bmpl8基因同源重组指导序列的扩增设计在5'端加有XbaI酶切位点上游引物CTAGACCAGCACCACACCGCGCGAG;加有SacII酶切位点引下游物CCGCGGTCATTGGCGAGGACAAGGTCCACTT。反应条件95。C预变性5min;94。C变性2min，64。C退火2min，72。C延伸5min，30个循环；最后72。C延伸10min。从布鲁氏菌S19的基因组中扩增。1.3.3LucNF+基因的扩增设计一对上下游都含有BssHII酶切位点的引物GCGCGCATGGTCACCGACGCCAAAAAC与GCGCGCTTACACGGCGATCTTTCCGC，以95。C预变性5min;94。C变性80s，63。C退火80s，72。C延伸100s;最后72。C延伸10min，从质粒pSP-lucNF+扩增出LucNF+基因片段。1.3.4sacB基因的扩增分别设计5'端含有限制性内切酶BamHI的上游引物与含有SalI酶切位点的下游引物。上游引物GTCGACACTCAGTACATAATAAAGGAGACAT;下游引物GGATCCTGGGATTCACCTTTATGTTGATAAG，以95。C预变性5min，94。C变性75s，60。C退火75s，72。C延伸90s反应条件，最后72。C延伸10min，以质粒pIP279为模板，扩增sacB基因。1.4自杀性质粒的构建1.4.1含有Bp26基因同源序列自杀质粒pBLs的构建自杀质粒pBLs构建的过程见图3。把1.4.1中的扩增出的长度4300bp的基因片段(其中包含Bp26基因)，与pMD18-T相连得到重组质粒pBb26。把1.4.3扩增出的LucNF+与pMD18-T相连而成重组质粒pLUC。把1.4.4扩增出sacB基因片段与pMD18-T相连而成重组质粒pSacB。用限制性内切酶BssHII分别消化重组质粒pBb26与pLUC，并把回收的LucNF+与pBb26相连而成重组质粒pBb26-Luc。再用限制性内切酶XbaI与XhoI分别消化质粒pBK-CMV与pBb26-Luc，并把Bp26-LucNF+基因片段与线性化的pBK-CMV相连而成重组质粒pBK-Bp26-Luc。再用限制性内切酶BamHI与SalI分别消化重组质粒pBK-Bp26-Luc与pSacB，并把sacB基因片段与连接到线性化的pBK-Bp26-Luc而成自杀质粒pBLs。1.4.2含有Bmpl8基因同源序列自杀性质粒pBBs的构建自杀性质粒pBBs构建的过程见图4。把1.4.2中的扩增出的长度2700bp的基因片段(其中包含Bmpl8基因)，与pMD18-T相连得到重组质粒pB即18。用限制性内切酶NruI与SacI消化重组质粒pBmpl8，并把消化过的pB卿18用DNAPolymeraseI处理后再用T4DNALigase使之连接，再用XbaI与SacII消化它，凝胶回收目标片段，使之与用XbaI与SacII消化过的pBluescriptSKII(+)相连而成重组质粒pBb即18。再用限制性内切酶BamHI与SalI分别消化重组质粒pBbmpl8与pSacB，并把sacB基因片段与线性化的pBb卿18相连而成自杀质粒pBBs。2结果2.1PCR扩增结果从布鲁氏菌S19株基因组扩增出含有Bp26基因在内的4300bp大小的基因片段，凝胶纯化后待用；从布鲁氏菌基因组扩增出含有Bmpl8在内的2700bp大小的基因片段，凝胶纯化后待用；从质粒pSP-LucNF+扩增出1700bp大小的LucNF+基因片段，凝胶纯化后待用；从质粒pIP279扩增出1400bp大小sacB的基因片段，凝胶纯化后待用。它们经琼脂糖电泳验证，均可观察到与理论值大小相符条带，见图3。2.2几个主要的重组质粒酶切电泳鉴定pBb26经XhoI单酶切，在7100bp左右有一电泳带，与预期值相符；pBmpl8经XbaI单酶切，在5400bp左右有一电泳带，与预期值相符；pSacB经BamHI与SalI双酶切，可以在1400bp和2700bpd左右有两条带，与预期值相符；剔除部分200bp基因后的pBmpl8经XbaI与SacII双酶切，在2400bp与2700bp左右出现两条带与理论值相符；pBK-Bp26-Luc经EcoRI单酶切，在12000bp左右有一条带，与预期值相符，见图4。实施例2布鲁氏菌分子标记、毒力缺失疫苗株AS19-2的构建1.1试剂萤光素酶检测系统购自Promega公司，其它试剂同实施例一。1.2肝汤培养基取新鲜的牛肝去脂肪、筋膜后绞碎，秤取500g，加自来水1000mL与之混合，置锅中煮沸lh，过滤，加水补足原量，加入NaC15g，蛋白胨10g。肝汤琼脂配制取上述肝汤培养基1000mL，加入琼脂20g，高压灭菌备用1.3电转化1.3.1感受态的制备取240mL对数生长前中期(6^。。=0.15)布鲁氏菌液体培养物放入预冷的250mL离心管中，迅速将培养物置于冰水混和物中15~30min,不时的缓慢摇匀保证内容物充分冷却。然后4'C1000Xg离心15rain，回收细胞，倒去培养液，用冰冷10%的丙三醇重悬沉淀，以1000Xg离心15min洗涤细胞3次。最后用3mL10%的丙三醇重悬沉淀制成感受态。1.3.2电转化操作步骤取0.5yg自杀质粒加入100uL上述制作的布鲁氏菌电转感受态中混匀，加入电击杯中，以E=12.5kv/cm电击，然后立即加入37。C预热的1mL的肝汤培养基中。放入摇床以37°C180r/min振荡培养24h。取出200mL涂布于含有筛选标记的肝汤琼脂平板上，3d后筛选出重组子，挑选出单菌落，进一步培养鉴定。1.4同源重组子的筛选1.4.l单交换子的筛选把电转化受体菌涂布在含有筛选标记(Amp100mg/L,Kan50mg/L)的肝汤琼脂平板上，因同源重组载体上带有筛选标记基因，所以很容易的筛选出单交换子。1.4.2双交换子的筛选将获得的同源重组单交换子液体培养3d，适当稀释，涂布于添加5%蔗糖的肝汤培养基平板上，37'C培养4d。因自杀质粒上含有sacB基因，该基因编码的果糖蔗糖酶，能将蔗糖水解为果糖并生成大相对分子量质的果聚糖，在G-细菌周质空间(极少数G+细菌的假周质空间结构)累积，导致细胞停止生长或死亡，挑取单菌落即为阳性同源重组双交换子(丢失sacB基因和抗性等载体序列)。1.5双交换子的验证1.5.1PCR方法的验证在自杀质粒LucNF+基因外侧，Bp26基因的同源臂上设计上游引物GAATTCCAGAGAAGCAGAACAGGCAC与下游引物CTCGAGAAATCGTTCGTCGTTACCGC，在双交换重组子基因组中扩增LucNF+基因片段；在Bmpl8剔除片段的两侧的同源臂上设计上游引物GAATTCACCTCACCGTGGACATAAAG与下游引物CTCGAGTGCCGTCGCAATTGATGAT同时在S19与双交换子AS19-2基因组中扩增B卿18基因片段，比较其大小。1.5.2应用萤光素酶报告基因检测取90uL布鲁氏菌AS19-2培养物，加入10pLlmol/LK2HP04(pH7.8)，20mmol/LEDTA，用干冰快速冷冻混合物，然后将细胞转移到室温并置于室温水浴中。加入300uL新鲜配制的裂解混合物，混均后于室温孵育10min。用20^L细胞裂解液加入装有萤光素酶检测试剂的萤光光度计试管中，吹打混合。将萤光光度计的程序设置为2s延迟及10s萤光素酶活性测量读数。2结果2.1PCR法法验证同源载体pBLs插入S19染色体上与AS19-2双交换子正确性用PCR方法分别从S19、同源载体插入后的S19、AS19-2的基因组中分别扩增出不同片段，见图12。l是从S19中扩增出包含Bp26在内的长为1740bp的基因片段；2是从同源载体插入后的S19不仅扩增出包含Bp26在内的长为1740bp基因片段，同时扩增出了与Bb26-Luc长度相符的2980bp的基因片段，与理论相符；3是从AS19-2只扩增出的Bb26-Luc，证明了AS19-2双交换子只含有Bb26-Luc基因。见图5。2.2PCR方法验证改造后的Bmpl8基因在AS19-2双交换子的正确性用PCR方法分别从S19基因组中扩赠出包含Bmpl8在内的长为2730bp基因片段；2是从AS19-2扩增出的包含改造的Bmpl8长为2470bp基因，1与2相比较少了260bp，这与我们剔除的基因长度相符，见图6。2.3萤光素酶报告基因在布鲁氏菌中表达结果在萤光光度计中连续三次的读数分别为5.570、5.438和5.304。2.4AS19-2遗传稳定性分析将AS19-2传至20代，用PCR验证，结果同上述(2.4PCR方法验证)，用萤光素酶表达验证，结果也同上述(2.5萤光素酶验证)相符。证明AS19-2具有遗传稳定性。实施例3:△S19-2毒力的鉴定在本发明实施例2中，我们缺失了S19的主要的毒力基因之一Bmp18，构建了AS19-2突变株。理论上讲，AS19-2的毒力比S19弱。本发明以小鼠为实验动物，检测接种小鼠脾脏不同时候的AS19-2与S19含菌量，用不同高浓度的AS19-2与S19接种小鼠，观察小鼠的临床症状及最小致死数量，比较分析了它们的毒力强弱。1材料与方法1.1材料1.1.1菌株见实施例21.2方法1.2.1细菌计数法(1)48小时的布鲁氏菌培养物，用无菌生理盐水洗下，用标准比浊制成10亿/mL菌悬液。(2)然后作10倍连续稀释每mL为1亿、1千万、1百万、10万、1千、1百、IO个菌。(3)每个稀释度取0.3mL，接种3块平皿，每个平皿0.lmL，涂匀。每个稀释度换一支吸管。(4)然后将平皿置37r温箱中培养，35d观察菌落数。(5)取菌落数介于30300的平板进行计数，计算每个稀释度3个平皿的平均菌落数。推算出实际菌数。1.2.2细菌的处理用无菌生盐水洗三次，再分别稀释到每mL5亿、l千万、l百万个菌。1.2.3接种小鼠脾脏细菌的计数取16只小鼠随机分成两组，每组8只，分别用AS19-2与S19每只小鼠接种1千万个菌，14d后，麻醉小鼠无菌取脾脏，用无菌研磨器研磨，用无菌生理盐水稀释后，涂布于肝汤琼脂培养基上，37'C温箱中培养5天，计数菌落数。1.2.4接种小鼠的症状观察取2亿、l亿、1千万菌体接种的AS19-2与S19，分别观察接种后2d、5d、8d小鼠的临床表现和死亡情况，以此分析AS19-2与S19毒力的强弱。2结果2.1接种10万AS19-2和S19菌体，比较7d后小鼠脾脏分离的菌体数，从AS19-2接种小鼠分离菌体数，明显少于的S19接种的，具体数据见表5-1。_表5-1从接种小鼠脾脏里分离的细菌数_小鼠编号(以发现在接种AS19-2小鼠接种S19小鼠的菌数量为先后)的脾脏发现的细菌数脾脏发现的细菌数14172413331243123116297278272.2接种不同细菌量、不同时期的小鼠临床症状表现2.21用l百万菌体接种的小鼠表现的临床症状，见下表5-2。表5-2接种1百万菌体的小鼠临床症状表现小鼠随机编号用S19接种小鼠表现的临床症状用AS19-2接种小鼠表现的临床症状2d5d8d2d5d8d1ABCCCC2ABCcCC3AACcCC4AACcCC5AACccC6ADCccC7ADcccC8ADcccC注A.精神不振、B.所好转、C.恢复正常D.无明显表化2.2.2用1亿菌体接种的小鼠表现的临床症状见表5-3表5-3接l亿菌体的小鼠临床症状表现<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注A.伏地、聚群、畏寒;B.有所好转;C.无明显变化2.2.3用2亿菌体接种的小鼠表现的性状5-4表5-4接种2亿菌体的小鼠临床症状表现小鼠随接种S19小鼠表现的临床症状接种AS19-2小鼠表现的临床症状机编号2d5d8d2d5d8d1AABCDE2AABCDEAAFcDE4AFcDEAFcDE6AFcDE7FcDE8FcDE:A.伏地、聚群、畏寒、行走困难;B.伏地、畏寒；C.精神不振、聚群、寒；D.精神不振;E.明显好转;F.死亡3小结布鲁氏菌病实验动物模型十分重要，通常要选择能造成类似于人和大动物的病理损害的动物模型较难。理想的动物模型应具备四个条件，即能经相同的自然途径感染，敏感性一致，类似的临床体征和病理学改变。本实验初步对AS19-2的毒力进了研究。与S19相比AS19-2毒力明显减弱。即使用AS19-2高浓度接种小鼠，所引发的症状与未接种小鼠相比不太明显。实施例4:布鲁氏菌BP26蛋白基因的克隆、表达及纯化布鲁氏菌BP26蛋白是一种具有强免疫原性的外周浆蛋白。它由细胞内向外释放，具有可溶性，相对于固定的外膜蛋白易于检测。有报道显示在感染布鲁氏菌的牛、羊、山羊和人类中都可以检测到BP26蛋白抗体的存在。使用BP26蛋白作为检测抗原，应该有较高的准确性。本发明克隆了布鲁氏菌的BP26蛋白基因，并进行了表达，表达产物通过亲和层析进行了纯化。1材料与方法1.1材料1.1.1菌株与、质粒、载体布鲁氏菌S19、大肠杆菌DH5a、大肠杆菌BL21和pET28a+本研究室保存；pMD18-Tsimplevector购自TakaRa公司。1.1.2仪器分光光度计Lambda3B(UV/V/S)，Perkin-ELMER;脱色摇床TY-80B,南京大学；其它仪器同前二章。1.1.3限制性内切酶及其它试剂限制性内切酶Ndel、EcoRI、Sacl、HindIII、SalI和T4DNA连接酶均购自TaKaRa公司。DNA回收试剂盒同第一章；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体购自鼎国生物公司；RNase购于华美生物工程公司；IPTG及TMB购自Sigma公司；PVDF膜为Millipore公司产品；丙烯酸胺、双甲基丙烯酞胺、低分子量蛋白Marker购自TaKaRa公司；布鲁氏菌阳性牛血清本室研制，辣根过氧化物酶标记兔抗羊IgG购自鼎国生物公司；金属鳌合层析介质S印harose-4-B购自Pharmacia公司。1.1.4主要试剂的配制1.1.4.1SDS-PAGE试剂30%(w/v)Acrylamidel00mL:称取29gAcrylamidelgBIS置于100mL烧杯中，加入约80mL的去离子水后，加热使之溶解，加去离子水将溶液定容至100mL，用0.45um过滤膜过滤除杂质，于棕色瓶中4。C保存。1.5mol/L(pH8.0)Tris-HC1缓冲液18.17gTris加入90mol/LdH20使之溶解，用浓HC1调pH值至8.0，最后加dH20定容至IOOmL;1.0mol/L(pH6.8)Tris-HCl缓冲液2.llgTris加入90mL朋20使之溶解，浓HC1调pH值至6.8，最后加dH20定容至100mL;10%SDS:称取电泳级SDS10g，加入90mLdH20使之溶解，调pH值至7.2，最后加dH20定容至IOOmL;10鬼(w/v)过硫酸胺lmL:称取100g过硫酸胺，加入lraL的去离子水后，充分搅拌溶解，于4'C保存，不宜久放；IOX电极缓冲液3gTris、14.4g甘氨酸、lgSDS，dH20定容至1000mL;2XSDS上样缓冲液2.0mL甘油、lmL2-巯基乙醇、0.6gSDS、1.OmL1%溴酚蓝、2.5mL1.Omol/LpH6.8Tris-HCl，dH20定容至10mL;考马斯亮蓝R-250染色液称取lg考马斯亮蓝R-250，置于IOOOraL烧杯中，加入250mL的异丙醇，100mL冰醋酸，650mL去离子水后，充分搅拌溶解，过滤除去颗粒物质后，室温保存；脱色液量取50mL的乙醇、100mL冰醋酸、850mL去离子水，置于IOOOmL烧杯中，充分混合后待用。1.1.4.2Westernblot检测试剂转移缓冲液甘氨酸2.9g、Trisbase5.8g、SDS0.37g、甲醇200mL,调pH8.3加水至1000mL;封闭液含3%BSA的TBS;洗涤液TBST(O.05%Tween-20):称取8.8gNaCl，加入于800mL去离子水，充分溶解后，加入20mLpH8.01.0mol/LTris-HC1、0.5mLTween20，定容至1000mL。1.1.5培养基LB液体培养基在950mldH20中加入细菌培养用胰蛋白胨10g，细菌培养用酵母提取物5g，NaCl10g,完全溶解后用5mol/LNaOH调节pH值至7.0，加入去离子水至总体积为1L，12rC高压下蒸汽灭菌20min，4'C保存。LB固体培养基在1LLB液体培养基中加入30g的琼脂粉，高压灭菌。1.2方法1.2.1目的基因的扩增与克隆根据Bp26基因的序列以及pMD18-Tsimplevector和pET28a+表达载体的特点分别设计两端含有限制性内切酶NdeI、SalI酶切位点的引物上游5'-CATATGCAGGAGAATCAGATGACGACG-3'下游5'-GTCGACTTACTTGATTTCAAAAACGACATT-3'用PCR的方法从S19基因组中扩增出Bp26基因片段。PCR条件为95'C预变性5min;94。C变性2min，55。C退火lmin，72。C延伸lmin，30个循环；最后72。C延伸10min。回收PCR产物，与pMD18-Tsimplevector相连构建重组质粒pMDBp26，重组质粒pMDBp26送上海生工生物公司进行测序。1.2.2重组表达质粒pETBp26的构建用限制性内切酶NdeI与SalI同时消化pMDBp26与pET28a+，分别凝胶回收纯化Bp26与pET28a+基因片段。取目的片段l叱、载体3ul混合后，加10XLigationbuffer2ul，T4DNA连接酶lul，加无菌去离子水到20叱。混匀后置4。C连接过夜。在无菌条件取连接产物10u1，加入到200mLfco"'.DH5a感受态细胞中进行转化(涂板时加IPTG、X-gal)。1.2.3表达质粒转入BL21表达菌将质粒快速转化受体菌将1叱质粒加入到冰浴的己融化的BL21感受态细菌中，轻轻混匀。继续冰浴30min，42。C热休克90s后，立即冰浴3min。将处理过的全部感受态菌铺到预先在37。C预热的含50ug/mL的卡那霉素LB平板上，用涂布棒均匀涂布菌液，至平板表面的菌液被全部吸收。37-C孵箱过夜培养。1.2.4融合蛋白BP26-His的表达。取单个转化菌落接种到3ml含有卡那霉素(50ug/mL)的LB培养液中。于摇床中37'C，转震荡培养4h至0De。。值达0.38。取出lmL未诱导的培养物，转移到另一管中，12000转离心lmin，弃上清，保留菌体作为未诱导的对照。剩余培养物中加入IPTG至终浓度lmmol/L进行诱导，37。C继续震荡培养。4h后，收集菌体。1.2.5SDS-PAGE电泳(1)洗净玻璃板，固定在电泳槽上。按分子克隆的配方配制12y。的分离胶20mL，迅速注入两玻璃板之间，胶顶覆盖lmL双蒸水。待分离胶凝固后倾出覆盖层液体，用去离子水冲洗凝胶顶部数次，倒置空干液体，加入5mL5%的积层胶溶液，插上梳子，垂直放置电泳槽使其凝固。(2)小心移去梳子，在电泳装置上、下槽间加入Tris-甘氨酸缓冲液，将电源负极与上槽相连。(3)将细菌沉淀重悬于100ul1XSDS凝胶加样缓冲液中，煮沸15min。取20叱上样，用55V电压电泳至浪酚蓝进入分离胶，把电压提高到110V，继续电泳至澳酚蓝到达凝胶底部。(4)染色取下凝胶用蒸馏水冲洗，用5倍凝胶体积的考马斯亮蓝染色液(45mL甲醇、45mL水、10mL冰醋酸中溶解0.25g考马斯亮蓝)浸泡凝胶，放在脱色摇床上室温染色3h。(5)脱色用含30%甲醇、10%冰乙酸的混合液，在脱色摇床上脱色过夜，其间更换脱色液34次，待蓝色背景完全脱净后，将凝胶浸入蒸馏水中终止脱色。1.2.6Western-blot免疫鉴定1.2.6.1制膜当SDS-PAGE行将结束时，切8张滤纸和1张PVDF膜，其大小略小于凝胶。用剪刀在滤膜一角作好标记。把硝酸纤维素滤膜漂浮于一盘去离子水中，借毛细作用使之从下往上湿润后，将之浸没于水中，浸泡5rain以上以驱除留于滤膜上的气泡。在一浅托盘中加入250ml转移缓冲液，把滤纸浸泡于其中。戴上手套按如下方法安装转移装置平放底部电极(为阳极)，石墨电极朝上。在这一电极上放置3张用转移缓冲液浸泡过的滤纸，逐张叠放，精确对齐，然后用一玻璃移液管作滚筒以挤出气泡。把PVDF膜放在滤纸上，要保证精确对齐，而且在3mra滤纸与硝酸纤维素滤膜之间并不留有气泡。从电泳槽上撤出放置SDS聚丙烯酰胺凝胶的玻璃，把凝胶转移到一盘去离子水中略微漂洗一下，然后准确平放于PVDF膜上。把凝胶左下角置于PVDF膜的标记角上，排除所有气泡。把最后3张3S1滤纸放在凝胶上方，同样须确保各层精确对齐并不留气泡。1.2.6.2转膜将阴极放于滤纸上，石墨一边朝下。接电源(将阳极导线接于底部石墨电极)，根据凝胶面积按0.65mA/cm接通电流，4'C转膜过夜，拆卸转移装置。1.2.6.3封闭把PVDF膜放入覆盖有塑料膜的小托盘中，根据滤膜面积以O.lmL/cm2的量加入封闭液，平放在平缓摇动的摇床上，于室温摇动1.5h。1.2.6.4与第一抗体的结合按0.1mL/cm2的量加入第一抗体。将滤膜平放在平缓摇动的摇床上，于4'C温育2h。1.2.6.5与第二抗体的结合用50mlTBST洗涤3次，每次10min。加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体(l:5000稀释)，于室温平缓摇动2h。1.2.6.6显色用50mlTBST洗涤4次，每次10min。加入O.4mlTMB显色至目的条带清晰，加蒸馏水终止反应。1.2.7亲和层析纯化重组蛋白1.2.7.1菌体的裂解每克菌(湿重)加入3ml裂解缓冲液(pH7.920mmol/LTris-HC1，5mmol/Limidazole,0.5mmol/LNaCl)，重悬细菌沉淀。按每毫升裂解缓冲液加入10u1MgS04(lmol/L)，10ii1Dnase(2mg/mL)，2iUPMSF(50mmol/L)的比例，加入上述三种试剂，冰上孵育30min5000转离心15min收集沉淀，按每克菌湿重加入5ml结合缓冲液的比例，将沉淀用结合缓冲液重悬，-7(TC放置过夜。将-7(TC放置的菌液冰上融化后，超声破碎菌体。5000rpm，4。C离心15min，收集上清。-7(TC保存或立即用于纯化。1.2.7.2亲和层析柱的准备准备好层析柱，用记号笔做好标记。用磷酸盐缓冲液充满35cm柱高，封闭出口。悬浮亲和层析介质，把它装入柱内。让柱开始流动并加入更多的介质，一直到介质水平达到合适的柱高。打开出口，加磷酸盐缓冲液，增加流速使介质下沉，持续冲洗直到柱床高度恒定为止。将2个柱体积的20mmol/LNiS(^金属离子溶液匀速通过层析柱。用5个柱床体积的蒸馏水洗柱。用5个柱床体积的结合缓冲液冲洗柱。1.2.7.3重组蛋白的亲和层析样品的吸附与洗涤将待纯化的样品加到金属鳌合的柱中，并以最佳流速让其流过柱床。用洗涤缓冲液洗柱，一直到流出样品的紫外监测值为基线水平。目的蛋白的洗脱加入洗脱缓冲液，待紫外监测仪数值上升时开始接样，随数值上升可分段接样。直到数值回落后一段时间停止接样。清洗和再生层析结束后，用50mmol/LEDTA，l國ol/LNaCl，pH78清洗柱使金属离子解离下来。然后用新鲜的金属离子再生后开始下一轮的纯化。2结果2.1Bp26基因的扩增与克隆2.1.l用PCR方法从布鲁氏菌基因组中扩增出630bp条带，与Bp26理论大小值相符，如图9;2.1.2把目标基因克隆到T载体上，提取质粒，与环形pMDBp26理论大小值相符，见图IO。2.2重组表达质粒pETBp26的鉴定重组质粒pETBp26用NdeI+SalI酶切消化后可见与pET28a及Bp26基因大小相符的条带，如图ll。1:DNAmarkerDL2000;2:recombinantplasmidpETBp26digestedwithNdeI+SalI(694bp)3:1Kbmarker2.3Bp26蛋白在大肠杆菌BL21中表达2.3.1SDS-PAGE分析把重组质粒pETBp26转化到大肠杆菌BL21中，挑选阳性克隆，培养到0K38时，加入IPTG到最终浓度lmmol/L，分别诱导2、3、4小时，观察Bp26蛋白在大肠杆菌BL21中表达情况，分析认为诱导4个小时的表达量最高。SDS-PAGE结果见图12。2.3.2Bp26蛋白在大肠杆菌体总蛋白含量的测定将待检菌体蛋白样品进行12%SDS-PAGE电泳，脱色完全后用CS-9000双薄层扫描仪分别对电泳条带进行扫描(图13)，结果，表达的重组蛋白Bp26占上清总蛋白量的23.25%。2.4融合蛋白亲合层析纯化SDS-PAGE分析纯化的BP26蛋白可见只有一条带，如图14所示，凝胶薄层扫描分析纯度为89%。2.5免疫印迹在29kDa左右出现了特异性带，如图15所示。实施例5布鲁氏菌S19与AS19-2鉴别诊断方法的建立用纯化的BP26蛋白可以区别开野毒株感染与AS19-2接种动物。为了进一步验证这一理论，用S19与AS19-2接种小鼠实验，初步建立了这一诊断方法。1材料与方法1.1材料1.1.1菌株布鲁氏菌S19本研究室保存；AS19-2见第二章。1.1.2ELISA试剂配制(1)包被液碳酸盐缓冲液Na2C03(无水碳酸钠)1.6g，NaHC03(碳酸氢钠)2.9g，加去离子水至lOOOmL。(2)洗涤液PH9.2磷酸盐缓冲液(Tween-20)Na2HP0412H202.9g，KC10.2g，KH2P040.2g，NaCl18g，吐温-200.5mL加去离子水至lOOOmL(3)甲液0.lmol/L柠檬酸4.2g/200mL，乙液0.2mol/LNa臭12H2014.3g/200mL，取甲液24.3mL与乙液25.7mL混合，临用前加20mg邻苯胺(OPD)，加过氧化氢(HA)0.02mL。(4〉终止液2mol/LH2S04溶液取分析纯浓硫酸110mL，加去离子水至100mL。1.1.3实验动物昆明鼠购自长春市生物制品所1.2方法1.2.1布鲁氏菌接种小鼠前的处理用PBS洗两次，然后用生理盐水稀释到1亿/mL。1.2.2实验小鼠的接种把布鲁菌S19与AS19-2培养到对数生长期，用生理盐水洗涤三次；用生理盐水稀释到目的浓度；对小鼠采用腹腔注射。1.2.3被检动物血清的制备对用S19与AS19-2免疫14天的小鼠断尾采血，血样在4'C冰箱放置3个小时后，5000rpm离心5min，取上清即为制备血清。1.2.4检测方法(1)ELISA检测按常规方法进行，将纯化的目的蛋白IO倍稀释后包被酶标板，用被检动物血清l:IOO稀释作为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgGl:200稀释作为二抗。同时用标准阴性和标准阳性血清作对照。(2)操作过程用微量移液器向每个孔内加IOO化包被液稀释的蛋白样品，置湿盒内于37°0直温培养箱中lh，然后于4'C冰箱中包被过夜。次日，用洗涤液洗涤二次，甩去洗涤液，倒置在纱布上轻轻拍扣使孔内的液体充分流出，每次间隔3min。向孔内分别加入用稀释液稀释好的1:100阳性血清、阴性血清0.lmL,置湿盒内于37'C恒温箱中反应lh后，甩去血清，用上面的方法洗涤3次，再加入稀释好的1:200酶标记兔抗牛IgG0.lmL，置于湿盒内于37"C恒温箱静置，甩去残留的酶标记物溶液，以同法洗涤三次。加入底物溶液10014VmL，置湿盒内于37。C恒温箱中静置30min，取出后立即向孔内加入0.02mL终止液，终止反应。(3)结果判定将培养板放入分光光度计读取450吸收波的OD值。2结果2.1用BP26蛋白区分接种10万S19与AS19-2菌体，7d后的小鼠将纯化的BP26蛋白作抗原，用ELISA法检测S19与AS19-2接种7d的小鼠血清中是否含有BP26蛋白的抗体，很易容区分S19和AS19-2接种的小鼠。具体ELISA读数如表4-l。表4-1S19与AS19-2接种小鼠7d后ELISA检测血清结果<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>32000.9450.8700.8410.4790.0640.0560.0610.0620.05564000.5200.5950.6230.2360.0420.0430.0500.0460.056128000.2420.4150.2900,1690.0380.0280.0360.0250,050256000.1660.2000.1530.0960.0600.0170.0230.0100.0452.3结果判读从2.1、2.2中的可以明显分辨出S19与AS19-2接种的差异。权利要求1.一种可区分自然感染或野毒感染的布鲁氏菌弱毒疫苗ΔS19-1，特征在于布鲁氏菌需弱毒疫苗株S19的Bp26基因缺失而成ΔS19-1。2、根据权利要求1所述的布鲁氏菌弱毒疫苗AS19-2，特征在于:△S19-1毒力基因Bmpl8缺失而成弱毒疫苗株AS19-2。3.根据权利要求1或2限定的疫苗制备方法，其特征在于根据布鲁氏菌基因组序列，设计PCR引物，扩增出分子目标基因Bp26同源重组的引导序列，在T载体上对其进行改造，在它的中间用限制性内切酶去除其中的500bp，在这个位置上连接上LucNF+基因，破坏了Bp26的原有序列，然后把改造好的基因片段连入自杀性的质粒上pBLs。4、根据权利要求3限定的疫苗制备方法，其特征在于主要包括以下步骤(1)以布鲁氏菌弱毒疫苗基因组为模板，设计引物，用PCR的方法，扩增出分子标记目标基因的同源重组引导序列，而后克隆到T载体上对目标基因改造；(2)用(1)得到的基因片段与复制启动子为pUCoir的载体相连，而后将sacB基因连接到这个载体的适当位置，构建成同源重组载体(自杀性质粒)；(3)使步骤(2)得到的重组载体转化到布鲁氏菌中去；利用同源重组载体自带的筛选标记筛出同源重组单交换子，利用sacB基因筛选出同源重组的双交换子，得到本发明的分子标记疫苗株AS19-1;(4)重新设计引物，从布鲁氏菌基因组中，扩增出目标毒力基因的同源重组引导序列，使用(1)(3)的方法使AS19-1的毒力缺失，得到本发明的分子标记、毒力缺失弱毒疫苗株AS19-2。5、根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所说的弱毒疫苗株为S19。6、根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所说的分子标记目标基因为Bp26。7、根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所说的分子标记目标基因是指用限制性内切酶切除其中500bp，而后在这个位置上连接上LucNF+报告基因。8、根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所说目标蛋白是BP26蛋白。9、根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所说的目标毒力基因是Bmpl8基因。10、根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所说目标毒力基因改造是指用限制性内切酶切除其中的200bp，而后使之相联。全文摘要本发明涉及布鲁氏菌疫苗，特别是涉及了布鲁氏菌疫苗株的分子标记与毒力基因缺失。本研究通过构建自杀质粒，采用定向同源重组的方法(基因打靶)，将萤光素酶改造基因(LucNF+)代替了布鲁氏菌弱毒疫苗S19株Bp26基因部分片段，破坏了其免疫原性蛋白BP26的表达，构建了布鲁氏菌Bp26基因缺失突变株ΔS19-1。BMP18蛋白是布鲁氏菌主要的毒力因子之一。采用相同的方法剔除了ΔS19-1的Bmp18基因，使其不表达Bmp18蛋白，构建成了布鲁氏菌毒力基因缺失突变株ΔS19-2。本发明解决了常规的布鲁氏菌疫苗不能区分人与动物是人工免疫接种还是野生菌感染、病毒强，容易使接种的人与动物发病的问题。对布鲁氏菌的监测、诊断、净化各控制具有重要意义和实际应用价值。文档编号A61K39/10GK101185756SQ20071005600公开日2008年5月28日申请日期2007年8月29日优先权日2007年8月29日发明者王兴龙,闫广谋申请人:中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所
文档序号 :
【 1129952 】
技术研发人员：闫广谋,王兴龙
技术所有人：中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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