重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白及其制备方法与应用的制作方法

2025-07-06 15:00:05 44次浏览

重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种重组类人胶原蛋白-人源细胞生长因子融合蛋白及其制备方法和应用，所制备的融合蛋白具有独特的纤维状结构和良好的生物组织兼容性，能够促进表皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞的增殖分化。所述制备方法包括：获得编码所述融合蛋白的DNA序列，构建重组表达载体在大肠杆菌、毕赤酵母或中国仓鼠卵巢细胞中表达所述融合蛋白。所述融合蛋白包括与人胶原蛋白至少85％序列同源性且具有人胶原蛋白的功能的第一区和与人源细胞生长因子至少85％序列同源性且具有人源细胞生长因子的功能的第二区；所述第一区与第二区之间设有连接肽，连接肽的通式是(GGGS)n。优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ?ID?NO.15。
【专利说明】重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白及其制备方法与应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及到基因工程领域，通过基因重组的方法获得了重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白。具体而言，本发明涉及一种重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白的制备方法及其应用。

【背景技术】
[0002] 近年来随着生物技术和材料科学的进步，对于以往常规治疗方法难以缝扎和植皮的重度渗血创面治疗有了很大进步，治疗目的也从原来单纯要求创面闭合或瘢痕愈合，提高到了尽量少留瘢痕、追求结构和功能完美修复的高度（付小兵.创伤修复与组织再生面临的新课题[J].临床外科杂志，2007,15(11) :739-740)。临床现有的生长因子在创伤愈合中具有显著优势，但对常规方法难以处理的创面应用时存在活性丧失快、半衰期短需频繁反复用药的缺陷。胶原蛋白是一种生物性高分子物质，在动物细胞中扮演结合组织的角色，为生物科技产业最具关键性的原材料之一，也是需求量十分庞大的最佳生医材料，广泛应用于生医材料、化妆品和食品工业等领域。负载有生长因子的胶原蛋白海绵兼有组织修复、残腔填充、止血、药物载体和防粘连的作用，在各类手术中已广泛应用，但目前获取的胶原蛋白成熟的工艺是采用动物组织提取的方式，存在哺乳动物牛组织及鸟类动物鸡组织中提取的胶原蛋白易带病毒，继而传染并危害人的健康的风险。为探讨操作简便、高效快速的创伤治疗新方法，本发明人致力于新型重组人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白的研究，并在此基础上，完成了本发明。
[0003] 本发明的重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白不仅能使创伤面快速止血、愈合，促进创伤部位血管和神经的修复再生，而且其半衰期较单独人表皮生长因子长，活性保存时间长，不易丧失。重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白复配以适当辅料后，可进一步制备成冻干粉剂、纳米微球、纳米脂质体、水剂、凝胶等半固体制剂，作为活性添加剂应用于组织工程、药学以及美容护肤领域。本发明的重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白具有人源化，免疫原性低，不易发生过敏反应的突出优点。

【发明内容】

[0004] 本发明公开了一种重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白的制备方法及其应用。
[0005] 具体而言，本发明的重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子因子融合蛋白的制备方法包括下述步骤：获得编码所述融合蛋白的DNA序列，构建适当的重组表达载体在大肠杆菌、毕赤酵母或中国仓鼠卵巢细胞表达所述融合蛋白。
[0006] 本发明还涉及构成本发明的重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白的氨基酸序列，编码本发明的重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白的核苷酸序列，表达本发明的重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白的重组载体，和表达本发明的重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白的宿主细胞，所述宿主细胞选自细菌（如大肠杆菌细胞）、酵母细胞（如毕赤酵母细胞）、动物细胞（如中国仓鼠卵巢细胞），其中优选表达宿主为中国仓鼠卵巢细胞，更优选的为毕赤酵母细胞，最优选为大肠杆菌细胞。
[0007] 本发明的重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白包括与人胶原蛋白至少 85%序列同源性的第一区和与人细胞生长因子至少85%序列同源性的第二区。本发明融合蛋白的第一区与第二区之间设有连接肽，连接肽的通式是（GGGS) n，n = 1?5的整数，优选 η = 3〇
[0008] 根据本发明的某些实施方案中的一个方面，提供了一种重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白，其特征在于包括与人胶原蛋白至少85%序列同源性的第一区和与人细胞生长因子至少85%序列同源性的第二区。
[0009] 根据本发明的某些实施方案中的一个方面，提供了一种重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白，其特征在于包括与人胶原蛋白氨基酸残基序列相同的第一区和与人细胞生长因子氨基酸残基序列相同的第二区，或上述二区的功能同等物。其中所述人细胞生长因子选自aFGF、bFGF、EGF或NGF。其中，所述第一区的氨基酸序列为SEQ ID NO. 1 :
[0010] MTS(GERGDLGPQGIAGQRGVVGERGERGERGASGERGDLGPQGIAGQRGVVGER GERGERGAS)X 8
[0011] 其中包括八次 GERGDLGPQGIAGQRGVVGERGERGERGAS GERGDLGPQGIAGQRGVVGERGERGERGAS 序列重复。
[0012] 根据本发明的某些实施方案中的一个方面，提供了一种重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白，其特征在于所述与人胶原蛋白同源的第一区位于融合蛋白的c-末端，与人细胞生长因子同源的第二区位于融合蛋白的N-末端。
[0013] 根据本发明的某些实施方案中的一个方面，提供上述任何一项所述的融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白的第一区与第二区之间设有连接肽，连接肽的通式是（GGGS) n， η为1?5的整数，包括端点值，η优选为1，更优选为3。
[0014] 根据本发明的某些实施方案中的一个方面，提供上述任何一项所述的融合蛋白，其特征在于所述的细胞因子选自aFGF、bFGF、EGF或NGF。
[0015] 根据本发明的某些实施方案中的一个方面，提供构成本发明的重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白的氨基酸序列。优选地，本发明所述的融合蛋白的氨基酸序列为 SEQ ID N0. 15。
[0016] 根据本发明的某些实施方案中的一个方面，提供编码本发明的重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白的核苷酸序列。并且，依据用来表达所述融合蛋白的宿主，所述核苷酸序列在构建成重组表达载体之前进行相应的宿主密码子优化，将所述核苷酸序列中的密码子优化为在所用的宿主中常用的密码子，但是其所编码的融合蛋白的氨基酸序列保持不变。
[0017] 根据本发明的某些实施方案中的一个方面，提供表达本发明的重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白的重组载体。
[0018] 根据本发明的某些实施方案中的一个方面，提供表达本发明的重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白的宿主细胞，所述细胞可以为细菌、酵母、动物细胞，优选表达宿主为中国仓鼠卵巢细胞，更优选的为毕赤酵母细胞，最优选为大肠杆菌细胞。
[0019] 本发明获得的重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白兼具人胶原蛋白和人细胞生长因子的特性，能使创伤面快速止血、愈合，并促进创伤部位血管和神经的修复再生，复配以适当辅料后，可进一步制备成冻干粉剂、纳米微球、纳米脂质体、水剂、凝胶等半固体制剂，作为活性添加剂应用于组织工程、药学以及美容护肤领域。该重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白具有人源化，免疫原性低，不易发生过敏反应的突出优点。因此，本发明还涉及本发明的重组人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白用于制备用于组织工程、药学或美容护肤领域的活性添加剂的应用。
[0020] 根据本发明的某些实施方案中的一个方面，提供本发明的重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白在制备用于组织工程、药学或美容护肤领域的活性添加剂中的应用，所述融合蛋白复配以适当辅料后，可进一步制备成冻干粉剂、纳米微球、纳米脂质体、水齐U、凝胶等半固体制剂，作为活性添加剂应用于组织工程、药学以及美容护肤领域。
[0021] 根据本发明的某些实施方案中的一个方面，本发明提供一种用于组织工程、药学或美容护肤领域的活性添加剂，所述添加剂包含本发明所述的融合蛋白。
[0022] 由此可见，本发明提供下述技术方案：
[0023] 1. -种重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白，其特征在于包括与人胶原蛋白至少85%氨基酸序列同源性且具有人胶原蛋白的功能的第一区和与人细胞生长因子且具有人细胞生长因子的功能至少85%氨基酸序列同源性的第二区，或上述二区的功能同等物。
[0024] 2.根据第1项所述的重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白，其特征在于所述与人胶原蛋白同源的第一区位于所述融合蛋白的C-末端，与人细胞生长因子同源的第二区位于所述融合蛋白的N-末端。
[0025] 3.根据第1项所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白的第一区与第二区之间设有连接肽，连接肽的通式是（GGGS) n，η = 1?5的整数，优选η = 3。
[0026] 4.根据第1项所述的重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白，其特征在于所述的人细胞生长因子选自aFGF、bFGF、EGF或NGF。
[0027] 5.根据第1项所述的重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白，其中所述第一区的氨基酸序列为SEQ ID N0. 1，所述第二区选自aFGF、bFGF、EGF或NGF，并且所述第一区与第二区之间设有连接肽，连接肽的通式是（GGGS) n，η = 1?5的整数，优选η = 3。
[0028] 6.根据第5项所述的重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白，其中所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID Ν0. 15。
[0029] 7.编码第1-6项中任何一项所述的融合蛋白的核苷酸序列。
[0030] 8.表达第1-6项中任何一项所述的融合蛋白的重组载体。
[0031] 9.表达第1-6项中任何一项所述的融合蛋白的宿主细胞，所述宿主细胞选自大肠杆菌、毕赤酵母或中国仓鼠卵巢细胞。
[0032] 10.第1-6项中任何一项所述的融合蛋白在制备用于组织工程、药学或美容护肤领域的活性添加剂中的应用。
[0033] 11. -种用于组织工程、药学或美容护肤领域的活性添加剂，所述添加剂包含第 1-6项中任何一项所述的融合蛋白。

【专利附图】

【附图说明】
[0034] 从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：
[0035] 图1示意性显示本发明的融合蛋白结构图，图示的连接肽为（GGGS)3，其中人表皮生长因子EGF位于融合蛋白的N端，类人胶原蛋白位于融合蛋白的C端，二者之间通过连接肽（GGGS) 3连接，N末端和C末端的his(6)表示6XHis纯化标签。
[0036] 图2显示重组蛋白Ecoll基因片段扩增。泳道1表示扩增的重组蛋白Ecoll基因，约960bp ;泳道2为阴性对照；泳道3为DL2000DNA maker，从下至上分别为100、250、500、 750、1000、2000bp。
[0037] 图3显示大肠杆菌表达质粒pET20b图谱。
[0038] 图4显示含重组融合蛋白Ecoll的SDS-PAGE分析。其中泳道1为低分子量蛋白标记，泳道2为未诱导的BL21(DE3)pLysS/pET20b-Ecoll表达系统，泳道3-8为已诱导的 BL21(DE3)pLysS/pET20b-Ecoll表达系统，融合蛋白表观分子量约为35kd。
[0039] 图5显示表达载体pSV2_dhfr图谱。
[0040] 图6显示表达载体pPICZ α A图谱。
[0041] 图7显示EGF-hCollagen融合蛋白对NIH3T3细胞的促粘附作用。
[0042] 图8显示EGF-hCollagen融合蛋白对NIH3T3细胞的促增殖活性。
[0043] 图9显示EGF-hCollagen生物海绵外观形态。
[0044] 图10显示扫描电镜分析EGF-hCollagen生物海绵的结构。
[0045] 图11显示本发明中所用到的序列的信息。其中，红色斜体表示EGF序列、黑色普通字体表示连接肽序列、下划线为波浪线的蓝色字体为人重组胶原蛋白序列。

【具体实施方式】
[0046] 下面结合附图对本发明进一步说明，但是本领域技术人员应该理解本发明并不限于这些具体的实施例。
[0047] 除非另外指明，下述实施例中所用的空质粒均为可商购获得的质粒。重组质粒采用常规分子克隆方法构建。
[0048] 实施例1
[0049] 重组类人胶原蛋白-人表皮生长因子融合蛋白在大肠杆菌中表达
[0050] 1.编码重组类人胶原蛋白-人表皮生长因子融合蛋白基因的获得
[0051] 将编码类人胶原蛋白的DNA片段（SEQ ID N0. 2)送到广州杰特伟生物科技有限公司（Guangzhou Jetway Biotech Co. Ltd.，China)进行全基因合成，以该DNA序列和经全基因合成的编码人表皮细胞生长因子（EGF)序列（SEQ ID N0. 3)为模板，加入两端引物Ecoll F(SEQ ID N0.4)Ecoll R(SEQ ID N0.5)和中间引物 Ecoll-IN F(SEQ ID N0.6)、Ecoll-IN R(SEQ ID勵.7)(引物由华大基因合成）（引物浓度1〇1^)各11^，再加入(1阶？（各 2. 5 μ M) 10 μ L，lOx PCR pfu 缓冲液 10 μ L 以及 pfu Taq DNA 聚合酶 1 μ L (5U/ μ L)，加水至总体积为100 μ L，按照touch-down PCR反应条件（94°C变性4min后进入循环，循环参数第一步为94°C变性30秒，68°C退火延伸60秒，10个循环后步入第二个循环，94°C变性30秒， 60°C退火30秒，72°C延伸180秒，20个循环）进行目的片段的扩增。电泳检测并回收目的 DNA片段并命名为Ecoll (SEQ ID N0. 14)，条带大小约960bp (图2)，其编码的融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID N0. 15所示，其中类人胶原蛋白与人表皮细胞生长因子之间存在接头肽 (gggs)3〇
[0052] 2.重组类人胶原蛋白-人表皮细胞生长因子融合蛋白表达载体的构建
[0053] 将表达空载体菌株Topl0-pET20b在LB固体抗性平板（1%蛋白胨，0. 5%酵母粉， 1. 5%琼脂粉，终浓度为50 μ g/mL的氨苄青霉素）上划线培养过夜。从平板培养基上挑取单菌落接种至含50 μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C摇床内200rpm培养过夜。离心收集菌体并利用质粒抽提试剂盒获得质粒pET20b，利用Nde I和BamH I(TAKARA Co.Ltd) 双酶切，回收载体大片段后，与利用相同限制性内切酶处理并回收的上述步骤1得到Ecoll 片段相连，构建重组表达质粒pET20b-Ecoll。
[0054] 3.重组类人胶原蛋白-人表皮细胞生长因子融合蛋白的表达
[0055] 将表达空菌株BL21 (DE3)pLysS(Invitrogen Co. Ltd)在LB固体培养平板上划线培养过夜。从平板培养基上挑取单菌落接种至LB液体培养基中，37°C摇床内200rpm培养过夜。次日以1%转接量接种到新鲜LB液体培养基中37°C摇床内200rpm培养2-3小时至 0D600 = 0· 3-0. 5。4°C，4000rpm离心lOmin，弃上清。然后用冰预冷的0· 1M CaCl2重悬菌体沉淀，冰浴30min。4000rpm/min离心7min，弃上清，用冰预冷的0. 1M CaC12重悬菌体沉淀，同时加入终体积15% -20%的灭菌甘油，混匀后置于冰上。取出0. 1 μ g重组表达质粒 pET20b-Ecoll，加入到上述准备好的感受态细胞中，42°C热激法转化后培养过夜。利用PCR 技术鉴定阳性重组子pET20b-Ecoll。挑取阳性重组子接种到LB液体培养基（含50 μ g/mL 氨苄青霉素）中，37°C、200rpm培养至0D600 = 0. 6-0. 8，lmM IPTG诱导4小时，收集菌体，力口入20mM的磷酸盐缓冲液（pH7.0)重悬菌体。利用超声波破碎仪破碎细胞。18000rpm离心 30分钟，收集上清。SDS-PAGE检测和分析融合蛋白的表达。通过薄层凝胶扫描以及灰度分析结果表明，重组融合蛋白在大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS中得到表达，其分子量约为35kDa，表达量约为20mg/L。
[0056] 实施例2
[0057] 重组类人胶原蛋白-表皮生长因子融合蛋白在CH0细胞中的表达
[0058] 首先依实施例1所述方法构建转染CHO-dhfr-细胞的表达载体pSV2-dhfr_Ecoll。使用实施例1所述Ecoll为模板利用上游引物Ecoll F2(SEQ ID N0.8)和下游引物 Ecoll R2(SEQ ID N0.9)扩增编码融合蛋白序列 Ecoll，用 Τ0Ρ0 ΤΑ Cloning Kit(购自 Invitrogen)中的酶扩增，连接T载体（pCR?2. 1-TOPO vector),测序验证，得到两端均含有 Hindlll(aagctt)酶切位点的Ecoll基因片段的pT-Ecoll重组质粒。用于构建重组融合蛋白在CH〇-dhfr-细胞中的表达载体pSV2-dhfr经Hindlll单切，载体用CIAP碱性磷酸酶 (TAKARA)去磷酸化处理后与pT-Ecoll经Hindlll单切后凝胶回收的小片段即Ecoll连接， Amp抗性筛选重组子，抽提重组质粒pSV2-dhfr-Ecoll。
[0059] 采用下列步骤转染CH〇-dhfr-细胞。在转染的前一天，将5X105个CH〇-dhfr-细胞接种于10cm培养皿中，细胞培养基换成无血清无抗生素 F12培养液。每孔转染的细胞，稀释0. 8?1. 0 μ g质粒DNA于50 μ 1无血清培养基中；稀释1?3 μ L LF2000试剂于0ΡΤΙ ΜΕΜΙ培养基中，室温孵育5min。LF2000试剂稀释后，30min内与DNA合并，室温孵育20min 形成DNA LF2000试剂复合物。DNA LF2000试剂复合物（lOOuL)直接加到各孔中，前后轻摇细胞板以混合。37°C、C02孵箱内孵育24?48h直到转移基因表达，不必除去复合物和换培养基。转染后24h，以1 : 10 (v/v)或更高的稀释度传细胞到新鲜的培养基中。转染后 2?3d，抗生素加压，使用400 μ g/mL的G418浓度，用含抗生素的选择培养基换液，每周2 次。10?14d后，可见抗性克隆。待克隆长至合适大小时，用Costar毛细管挑取单克隆到 96孔板，逐渐转移到24孔板、6孔板，直到细胞培养瓶。并用PCR、We Stern-Bl〇t、双抗夹心 ELISA方法鉴定阳性细胞群。将表达量较高的细胞株，传代扩增冻存。
[0060] 在细胞培养瓶中培养挑选细胞，逐步增加 MTX浓度，从0. 005-0. 02-0. 2-2. 0-10. 0 -20. 0-80. 0 μ Μ逐渐增加。每一浓度至少维持两代，以防止抗MTX细胞系产生而dhfr及外源基因并没有得到扩增。每个浓度细胞的适应时间约为2周，适应后继续传代2次，冻存2 管种子细胞，留2管继续加压。并留取细胞培养上清以检测重组蛋白的表达。最终选择生长状态良好、稳定高产的细胞株作为生产备选细胞株。
[0061] 实施例3
[0062] 重组类人胶原蛋白-生长因子融合蛋白在酵母细胞中的表达
[0063] 首先依实施例1所述方法构建转化酵母细胞GS115的重组表达载体 pPICZaA-Ecoll。使用实施例1所述Ecoll为模板利用上游引物Ecoll F3(SEQ ID N0. 10) 和下游引物EcollR3(SEQIDN0.11)扩增N端含有a-factor分泌信号肽识别位点序列的Ecoll基因，利用Xho I和Xba I双酶切，与经相同双酶切回收的载体大片段pPICZaA 连接，转化ToplO感受态细胞，博来霉素抗性YPD固体培养基上筛选转化子，经测序鉴定正确后抽提质粒，用Sac I线性化重组质粒pPICZ a A-Ecoll，乙醇沉淀纯化质粒，用5 μ g重组质粒电击转化GS115感受态细胞，博来霉素抗性和PCR鉴定筛选重组转化子，挑取阳性重组转化子培养至0D600 = 2-4,加入终浓度为1%的甲醇诱导24-72小时，离心收集上清。 SDS-PAGE检测和分析融合蛋白的表达。
[0064] 实施例4
[0065] 本发明首先人工合成类人源胶原蛋白的基因序列，在5'端和3'端分别引入 Nde I和BamH I酶切位点，通过Nde I/BamH I双酶切将其连入pET3c载体，由此得到 pET3c-hCo 1 lagen重组质粒。同时，采用PCR扩增hEGF基因，通过引物设计在5 '端引入Xba I酶切位点，3'端引入（GGGGS)2序列及Nde I酶切位点。以Xba I/Nde I双酶切后，将其连接入pET3c-hCollagen载体，由此构建pET3c-EGF-(GGGGS) 2-hCollagen重组质粒，导入感受态大肠杆菌BL21 (DE3) plysS中培养，以IPTG诱导表达EGF-hCollagen融合蛋白，通过镍亲和层析得到纯化的融合蛋白，通过SDS-PAGE和Western blotting对融合蛋白的分子量大小和免疫学验证，并检验其生物活性。具体步骤如下：
[0066] (l)pET3c_hCollagen重组质粒构建：本发明采用人工方法合成类人源胶原蛋白基因序列，在5'端和3'端分别引入Nde I和BamH I酶切位点。为方便后续纯化，在3' 端终止密码之前加上组氨酸标签，通过Nde I/BamH I双酶切将其连入pET3c载体，得到 pET3c_hCollagen重组质粒。pET3c_hCollagen重组质粒采用Xba I/Nde I进行双酶切，产物经琼脂糖凝胶电泳，将目的条带割下，用DNA胶回收试剂盒进行回收待用；
[0067] (2)EGF DNA片段的扩增与纯化：根据人EGF Genebank序列设计引物，通过引物设计在5'端引入Xba I酶切位点，3'端引入（GGGGS) 2序列及Nde I酶切位点。PCR反应条件为：94°C变性3min，95°C变性30s，65°C退火30s，72°C延伸20s，扩增30个循环，再72°C， 10min，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，将目的条带割下，用DNA胶回收试剂盒进行回收。纯化后的片段采用Xba I/Nde I进行双酶切，产物经琼脂糖凝胶电泳，将目的条带割下，用 DNA胶回收试剂盒进行回收待用；
[0068] (3)EGF_hCollagen融合基因表达载体构建于鉴定：在T4连接酶的作用下，将步骤 ⑴和⑵回收的片段定向连接，并转化T0P10感受态细胞，在LB (Amp)培养基中挑选阳性克隆，采用Xba I/Nde I，Nde I/BamH I酶切验证；
[0069] (4)EGF-hCollagen融合蛋白的表达：将融合基因表达载体转化如感受态细胞 BL21 (DE3)plysS，并在LB(Amp)培养基中筛选培养。挑取阳性克隆，接种于LB(Amp)培养中， 37°C培养3-5h至0D600为0. 5时，加入IPTG至终浓度为ImM，37°C诱导培养约4h，离心收集菌体，加入pH6. 8PBS缓冲液，采用均质机400bar进行破碎。
[0070] (5)EGF-hCollagen融合蛋白的纯化：18000rpm离心20min，将收集得到的上清经镍柱纯化，上样流速0. 6mL/min。用pH6. 8PBS缓冲液平衡后，采用咪唑梯度洗脱，在300mM 时收集流出峰，洗脱样品经G25脱盐，即得到高纯度的融合蛋白。
[0071] (6)EGF-hCollagen融合蛋白细胞粘附性测定：将NIH3T3(CRL-1658，ATCC)细胞用含10%?05的01^11培养，371：，0) 2浓度5%;首先用？85清洗一次，然后添加0.25%的胰酶液进行消化，离心收集细胞；用DMEM进行重悬，细胞密度控制在6. 2 X 104个/mL，将细胞悬液接种到底层铺有人胶原蛋白-人表皮生长因子融合蛋白膜的培养皿中，细胞密度控制在1 X 104个/cm2, 24孔板为20000个/孔。37°C培养lh，维持C02浓度为5%;用PBS冲洗掉没有粘附的细胞；在相差显微镜下计数以及用MTT法比较各组细胞数。阳性对照共两组：一组铺有牛纤连蛋白（4 μ g/平板），一组铺有牛I型去端肽胶原蛋白（lmg/平板）。结果见图7,结果显示：在考察的浓度范围以内EGF-hCollagen融合蛋白给药组及阳性对照组细胞数均高于control组，其中EGF-hCollagen融合蛋白给药浓度为190 μ g/mL时细胞数最高。结果表明EGF-hCollagen融合蛋白具有促进细胞黏附贴壁的活性，当蛋白浓度为190μ g/ mL时促细胞黏附能力最强。
[0072] (7)EGF_hCollagen融合蛋白生物活性测定：将处于对数生长期的3T3细胞用含 10% FBS的1640培养基（购自美国Gibco公司）常规培养至80%?90%汇合，用0· 25% 胰酶消化，以2. 0 X 105个/mL的细胞数目接种于96孔板，培养24h后，换无血清1640培养基培养，24h后将培养基吸出后分别加入浓度为100、50、25、12. 5、6. 25、3. 125ng/mL的融合蛋白（所有样品均用PBS稀释至0.5mg/mL)，每个浓度设3个复孔，空白组为六个复孔。给药后放入培养箱继续培养24h，加入10 μ L MTT (0. 5mg/mL)，培养箱中孵育4h后，吸出孔中溶液并加入1〇〇μ L DMS0,振荡后于570nm/630nm波长下检测吸光度0D值。该实验可以检测EGF-hCollagen融合蛋白对NIH3T3细胞的促增殖活性，结果见图8,结果显示，在考察的浓度范围内，EGF-hCollagen融合蛋白给药组细胞增殖速率高于单纯EGF，且ED 5Q(E(；F_hC()llagen融合蛋白）> ED50(egf)，表明EGF-hCollagen融合蛋白具有促进3T3细胞增殖的活性，且活性高于单纯的EGF。
[0073] 实施例5
[0074] (l)EGF-hcollagen初级生物海绵的制备：EGF_hcollagen蛋白溶于磷酸盐缓冲液中配成5 %的胶原蛋白溶液，4°C条件下缓慢滴加5 %壳聚糖溶液，至EGF-hcol lagen蛋白与壳聚糖的质量比为1 : 10,继续搅拌并低温超声脱泡。脱泡后的EGF-hcollagen蛋白-壳聚糖溶液定量倒入冻干模中，低温冷冻干燥制成初级生物海绵。
[0075] (2)交联：将原花青素溶于含有10%无水乙醇的磷酸盐缓冲液（pH = 7. 4)，配置成0. 5%的原花青素溶液。将上述初级生物海绵于0. 5%原花青素溶液中浸泡24h，然后用超纯水浸泡并不断更换超纯水至PH6. 8。初级生物海绵置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，得EGF-hcollagen生物海绵。EGF-hcollagen生物海绵外观形态应为乳白色疏松海绵状（图9)，扫面电镜下观察可见表面呈现丝状，呈白色疏松的海绵状结构，孔隙分布细密均匀，有弹性，孔隙面积在（100X100) μπι2?（200X200) μπι2范围内（图10)。上述制得的 EGF-hco 1 lagen生物海绵吸水性良好，具有较高的空隙率，可以提供足够的空间吸收足够的血液，并有利于细胞粘附，生长和增殖。
[0076] 应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。
[0001] 序列表 <110^广州市暨鹏牛物利抟有限公司广州佰泰莱生物利技行限公司广州暨南大学医药牛i物技术·研究幵发中心 <120箄.组龙人胶原蛋?- &细胞牛.长凶子融合蛋h及其制备方法与&用 <130> IB126275 χ100> 15 170 PatentTn version 3.1 <210 1 <211/ 483 <2?2> PRT 3 >人源胶原慑白多肽序列 <400 1 Met Thr Ser Gly Glu Arg Gly Asp Leu Gly Pro Gin Gly lie Ala Gly 1 ' 10 15 Gin Arg Gly VaJ Val Gly Glu Arg Gly Glii A:t:g Glv Glu Arg Gly Ala 20 25 30 Ser Gly Glu Arg GJy Asp i.eu Gly Pro Gin Gly He Ala Gly Gin Arg 35 40 45 Gly Vai Val Gly Glu Arg Gly Glu Arg Gly Glu Arg Gly Ala Sor Gly 50 55' 60 Glu Arg Gly Asp Leu Gly Pro Gin Gly lie Ala Glv Gin Arg Gly Val (i5 70 75 80 Val Glv Glu Arg Gly Glu Arg Gly Glu Arg Gly Ala Ser Glv Glu Arg 85 90 95 Gly Asp Leu Gly Pro Gin Gly lie Ala Gly Gin Arg Gly Val Val Gly l〇6 ' 105 110 Glu Arg Gly Glu Arg Gly Glu Arg Gly Ala Ser Glv Glu Arg Gly Asp 115 120 125 Leu Gl? Pro Gin Glv lie Ala Gly Gin Arg Gly Val Val Gly Glu Arg 130 135 140 GIy Glu Arg G1t Glu Arg Gly Ala Ser Glv Glu Arg Glv Asp Leu Glv 145 150 155 160
[0002] Pro Gin Gly Tie Ala G1 y Gin Arg Glv Val Yal Gly Gin Arg Gly (ilu 165 170 175 Arg Glj GIu Arg Gly Ala Ser Glv Glu Arg Glv Asp Leu Gly Pro Gin 180 185 190 Glv He Ala Gly Gin Arg Gly Val Val Gly Glu Arg Gly Glu Arg Gly 195 200 205 Glu Arg Glv Ala Ser Gly Glu Arg Gly Asp Leu Glv Pro Gin Gly lie 210 ' 215 ' 220 ' Ala Gly Gin Arg Gly Val Yal Glv Glu Arg Gly Glu Arg Gly Glu Arg 225 230 235 240 Glv Ala Ser Gly Glu Arg Gly Asp Leu Gly Pro G hi Gly lie Ala Gly ' 245 ' 2hb ' Gin Arg Gly Val Val Gly Glu /rg Gly Glu Arg Gly Glu Arg Gly Ala 260 ^ 265 270 Ser Gly Gu Arg GJy Asp I,on Gly Pro Gin Gy Me Ala Gly Glu Arg 275 ' 280 ' 285 Gly Val Val Gly Glu Arg Gly Glu Arg Gly Glu Arg Gly Ala Ser Gly 290 295 300 Glu Arg Gly Asp Leu Gly Pro Gin Gly lie Ala Gly Gin Arg Gly Val 305 ' 310 315 ' 320 Val Gly Glu Arg Gly Glu Arg GJy Glu Arg Gly Aia Ser Gly Glu Arg 325 ' 330 335 Gly A.sp Leu Gly Pro Gin Gly He Ala Gly Gin Arg Gly Val Val Gly 340 345 350 Glu Arg Gly Glu Arg Gly Glu Arg Gly Ala Sor Gly Glu Arg GIy Asp 355 ' 360 ' 365 ^ Leu Gly Pro Gin Gly He Ala Gly Gin Arg Gly Val Val Gly Glu Arg 370 375 380 Gly Glu A.rg Gly Glu Arg Gly Ala Ser Gly Glu Arg Gly Asp Leu Gly 385 390 395 ' 400 Pro Gin Gly He Ala Glv Gin Arg Glv Val Val Gly Glii Arg Gly Glu 405 410 415 Arg Glv Glu Arg Glv Ala Ser Gly Glu Arg Gly Asp Leu G1t Pi^o Gin 420 425 430 Gly lie Ala Gly Gin Arg Glv Yal Val Gl} ; Glu Arg Glv Glu Arg Glv u 435 ' 440 u 445 ' Glu Arg Gly Ala Ser Glv Glu Arg Glv Asp Leu Gly Pro Glti G1) T Tlo 450 ' 455 ' 460
[0003] Ala Gly Gin Arg Gly Val Val Gly Glu Arg Gly Glu Arg Gly Glu Arg 465 470 475 480 Gly Ala Ser <210> 2 <211> 750 <212> DNA <213>人源胶原蛋内的DNA序列 <400> 2 atgaccagcg gcgaa.cgtgg cgatctgggc ccgcagggca ttgcgggcca gcgtggcgtg 60 gtgggcgaac gtggcgaacg tggcgaacgt ggcgcgagcg gcgaacgtgg cgatctgggc 120 ccgcagggca ttgcgggcca gcgtggcgtg gtgggcgaac gtggcgaacg tggcgaacgt 180 ggcgcgagcg gcgaacgtgg cgatctgggc ccgcagggca tt:gcgggtx；a gcgtggcgtg 240 gtgggcgaac gtggcgaacg tggcgaacgt ggcgcgagcg gcgaacgtgg cgatctgggc 300 ccgcagggca ttgcgggcca gcgtggcgtg gtgggcgaac gtggcgaacg tggcgaacgt 360 ggcgcgagcg gcgaacgtgg cgatctgggc ccgcagggca ttgcgggcca gcgtggcgtg 42(3 gtgggcgaac gtggcgaacg tggcgaacgt ggcgcgagcg gcgaacgtgg cgatctgggii 480 ccgcagggca ttgcgggcca gcgtggcgtg gtgggcgaac gtggcgaacg tggcgaacgt 540 ggcgcgagcg gcgaacgtgg cgatctgggc ccgcagggca ttgcgggcca gcgtggcgtg 600 gtgggcgaac gtggcgaacg tggcgaacgt ggcgcgagcg gcgaacgtgg cgatctgggc 660 ccgcagggca ttgcgggcca gcgtggcgtg gtgggcgaac gtggcgaacg tggcgaacgt 720 ggcgcgagcc atcatcatca tcatcactaa 750 <210 3 <211> 183 <2i2> DNA <2i3>编码人表皮细胞生长W子的核苷酸序列 <400> 3 atgcaccatc atcatcacca caatagtgac tctgaatgtc ccctgtccca cgatggttac 60 tgttlacacg atggtgtgtg tatgtacatt gaagctttgg acaagtacgc ttgtaactgt 120 gtcgtcggtt acatcggtga gagatgtcag taccgagacc tgaagtggtg ggaactgcgc 180 taa 183 <210> 4 <211> 51 <212〉 DNA <213〉Ecoll F引物序列
[0004] <400> 4 ggaattccat atgcaccatc atcatcacca caatagtgac tctgaatgtc c 51 <210> 5 <211〉 41 <212> DNA <213〉Ecoll R引物序列 <400> 5 cgcggatcct tagtgatgat gatgatgatg gctcgcgcca c 41 <210> 6 <211> 37 <212> DNA <2]3> Hcoll-F引物序列 <400> 6 ggaac tgcgc atgaccagcg gcgaacgtgg cgatctg 37 ^210/ 7 ^211/ 34 ^212> DNA Ecoll· IN R引物序列 <400> 7 cgctggtcat gcgca.gttcc ca.ccactt.ca ggtc 34 <210〉 8 /211> 50 ^12/ DNA <213> Ecoll F2引物序列 ^ 100> 8 cccaagctta tgcaccatca tcatcaccac aatagtgact ctgaatgtcc 50 ^210> 9 <211> 41 <212> DNA <213> Ecoll R2引物序列 <100> 9 cccaagcttt tagtgatgat gatgatgatg gctcgcgcca c 41
[0005] <210> 10 <211> 50 <212> DMA <213> Ecoll F3引物序列 <4〇0> 10 ccgctcgaga tgcaccatca tcatcattac aatagtgact ctgaatgtcc 50 <2i0> Π <211> 40 <212/ DM <213/ Ecoll R3引物序列 <400> 11 gc tctaga tt agt gatgatg atgatgatgg ct (^gcgucac 40 <210> 12 <21J> 89 <212> DNA <213> Ecoll-IN F2引物序列 <400> 12 (吨eg(观(:g gcggcrigcgg (:ggcggcagc ggcggcggca gcatgaccag cggcgaacgt 60 ggcgatctg 69 <2!0> 13 <211> 69 Cil2> DNA KcoU-IN M引物序列 <40D> 13 gctggtcatg ctgccgccgc cgctgccgcc gccgctgccg ccgccgcgca gttcccacca 60 cttcaggtc 69 <210、 14 <211> 9G6 <212> DNA <213>重组人晈原蛋ft连接呔IGGGS)3人细胞生长因子齙合蛋β的?因序列 <400> 14 atgcaccatc atcatcacca caatagtgac tctgaatgtc ccctgtccca cgatggttac 60 tgtttacacg atggtgtgtg tatgtacatt gaagcgttgg acaagtacgc ttgtaactgt 120 gtcgtcggtt acatcggtga gagatgtcag taccgagacc tgaagtggtg ggaactgcgc 180
[0006] ggcggcggca gcggcggcgg cagcggcggc ggcagcatga ccagcggcga acgtggcgat 240 ctgggcccgc agggcattgc gggccagcgt ggcgtggtgg gcgaacgtgg cgaacgtggc 300 gaacgtggcg cgagcggega acgtggcgat ctgggcccge agggcattgc gggccagcgt 360 ggcgtggtgg gcgaacgtgg cgaacgtggc gaacgtggcg cgagcggcga acgtggcgat 420 ctgggcccgc agggcattgc gggccagcgt ggcgtggtgg gcgaacgtgg cgaacgtggc 480 gaacgtggcg cgagcggcga acgtggcgat ctgggcccgc agggcattgc gggccagcgt 540 ggcgtggtgg gcgaacgtgg cgaacgtggc gaacgtggcg cgagcggcga acgtggcgat 600 ctgggcccgc agggcattgc gggccagcgt ggcgtggtgg gcgaacgtgg cgaacgtggc 660 gaacgtggcg cgagcggcga acgtggcgat ctgggcccgc agggcattgc gggccagcgt 720 ggcgtggtgg gcgaacgtgg cgaacgtggc gaacgtggcg cgagcggcga acgtggcgat 780 ctgggcccgc agggcattgc gggccagcgt ggcgtggtgg gcgaacgtgg cgaacgtggc 840 gaacgtggcg cgagcggcga acgtggcgat ctgggcccgc agggcattgc gggccagcgt 900 ggcgtggtgg gcgaacgtgg cgaacgtggc gaacgtggcg cgagccatca tcatcalcat 960 cac iaa 966 s2IO> 15 <211、 321 PRT <213/重组人胶原蛋白-连接肽（GGGS)3-人细胞生长因子fe合蛋白的氨基酸序列 <400> 15 Mot His His His His His His ksn Sor Asp Sor Glu ('ys Pro Leu Sor 15 10 15 His Asp Gly ?γτ ('vs Leu His Asp Gly Val Cvs Met Tyr He Glu Ala 20 25 30 Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cvs Val Val Gly Tyr lie Gly Glu Arg 35 40 ' 45 Cys Gin Tyr Arg Asp L(、ii l小s Trp Trp Glu Leu Arg Gly Gly Gly Ser 50 55 60 ' Gly Gly Gly Ser Gly GW Gly Ser Met Thr Ser Glv Glu Arg Gly Asp 65 TO 75 80 Leu Gly Pro Glrx (i.ly lie Ala. Gly Ghi Arg Gly VaJ. Val Gly Glu Arg 85 90 95 Gly Glu Arg Gly Glu Arg Gly Ala Ser Glu Arg Gly Asp Leu Gly 100 105 ' 110 ' Pro Gin Glv lie Ala Gly Gin Arg G1y Val Val Gly Glu Arg Glv Glu 115 120 ' 1^5 ^ Arg G1t Glu Arg Gly Ala Ser Cly Glu Arg Gly Asp Leu Gly Pi^o Gin 130 135 140
[0007] Glv lie Ala Gly Gin Arg Gly Yal Val Glv Glu Arg Gly Glu Arg Gly 145 150 155 160 Glu Arg Gly Ala Ser Gly Glu Arg Glv Asp Leu Gly Pro Gin Gly lie 165 170 175 Ala Gly Gin Arg Glv Yal Val Glv Glu Arg Gly Glu Arg Gl? Glu Arg 180 185 190 Gly Ala Ser Gly Glu Arg Gly Asp Leu Gly Pro Gin Gly He Ala Gly 195 200 205 Gin Arg Gly Yal Yal Gly Glu Arg Gly Glu Arg Gly Glu Arg GL· Ala 210 215 22(3 Ser Gly Glu Arg Gly Asp Leu Gly Pro Gin Gly He kin Gly Gin Arg 225 230 235 240 Gly Yal Yal Gly Glu Arg Glv Glu Arg Gly Glu Arg Glv Ala Ser Gly 245 25() 255 Glu Arg Glv Asp Leu Gly Pro Gin Glv lie Ala Gly Gin Arg Glv Val 260 205 270 ' Yal Glv Glu Arg Glv Glu krg Glv Glu Arg Glv Ala Ser Glv Glu Arg 275 ' 280 ' 285 ' Gly Asp Leu Gly Pro Gin Gly lie Ala Gly Gin Arg Gly Val Val Gly 290 295 300 Glu Arg Gly Glu Arg Gly Glu Arg Gly Ala Ser His His His His His 305 ' 310 ' 315 320 His
【权利要求】
1. 一种重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白，其特征在于包括与人胶原蛋白至少85%氨基酸序列同源性且具有人胶原蛋白的功能的第一区和与人细胞生长因子且具有人细胞生长因子的功能至少85%氨基酸序列同源性的第二区，或所述第一区或第二区的功能同等物；其中所述与人胶原蛋白同源的第一区位于所述融合蛋白的C-末端，与人细胞生长因子同源的第二区位于所述融合蛋白的N-末端。
2. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白的第一区与第二区之间设有连接肽，连接肽的通式是（GGGS)n，η = 1?5的整数，优选η = 3。
3. 根据权利要求1所述的重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白，其特征在于所述的人细胞生长因子选自aFGF、bFGF、EGF或NGF。
4. 根据权利要求1所述的重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白，其中所述第一区的氨基酸序列为SEQ ID NO. 1，所述第二区选自aFGF、bFGF、EGF或NGF，并且所述第一区与第二区之间设有连接肽，连接肽的通式是（GGGS) n，η = 1?5的整数，优选η = 3。
5. 根据权利要求4所述的重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白，其中所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO. 15。
6. 编码权利要求1-5任何一项所述的融合蛋白的核苷酸序列。
7. 表达权利要求1-5任何一项所述的融合蛋白的重组载体。
8. 表达权利要求1-5任何一项所述的融合蛋白的宿主细胞，所述宿主细胞选自大肠杆菌、毕赤酵母或中国仓鼠卵巢细胞。
9. 权利要求1-5任何一项所述的融合蛋白在制备用于组织工程、药学或美容护肤领域的活性添加剂中的应用。
10. -种用于组织工程、药学或美容护肤领域的活性添加剂，所述添加剂包含权利要求 1-5任何一项所述的融合蛋白。
【文档编号】A61L27/22GK104098701SQ201410352444
【公开日】2014年10月15日申请日期:2014年7月23日优先权日:2014年7月23日
【发明者】黄亚东, 项琪, 崔宇, 张卉, 张齐, 肖巧学, 郑青申请人:广州市暨鹏生物科技有限公司, 广州佰泰莱生物科技有限公司, 广州暨南大学医药生物技术研究开发中心

文档序号 : 【 1314633 】

技术研发人员：黄亚东,项琪,崔宇,张卉,张齐,肖巧学,郑青
技术所有人：广州市暨鹏生物科技有限公司,广州佰泰莱生物科技有限公司,广州暨南大学医药生物技术研究开发中心

备注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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黄亚东丨项琪丨崔宇丨张卉丨张齐丨肖巧学丨郑青丨广州市暨鹏生物科技有限公司丨广州佰泰莱生物科技有限公司丨广州暨南大学医药生物技术研究开发中心